【毕业学位论文】（Word原稿）转ZmPP2C2基因烟草对逆境胁迫的响应-农业植物

I 目 录 摘 要 . 1 . 3 英文缩写符号及中英文对照表 . 5 1. 引言 . 6 境胁迫与信号转导 . 6 细胞信号转导系统 . 7 蛋白质的可逆磷酸化 . 8 白磷酸酶 . 8 蛋白磷酸酶的发现 . 8 植物中的蛋白磷酸酶 . 9 植物中 . 10 进化 . 11 植物中 . 12 课题研究目的及意义 . 16 2. 材料与方法 . 18 . 18 材料的选择 . 18 材料的培养 . 18 料处理 . 18 低温处理 . 18 理 . 18 理 . 18 试验方法 . 19 转基因烟草植株筛选 . 19 转基因植株的表型分析 . 19 转基因植株生理指标的测定 . 21 验数据处理 . 23 . 结果与分析 . 24 . 24 转基因和野生型烟草植株在 1/2 养基及在含 露醇的 1 2养基的萌发情况 . 24 转基因植株烟草的 . 25 低温胁迫对转基因烟草植株生理特性的影响 . 25 转 因烟草植株耐冷性分析 . 25 低温胁迫对转基因烟草和野生型烟草膜脂电解质 外渗的影响. 25 低温胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片脯氨酸和可溶性糖含量的影响 . 26 低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草 . 27 . 29 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片气体交换参数的影响. 29 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片荧光参数的影响 . 30 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草膜透性的影响 错误 !未定义书签。 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草丙二醛的影响 . 31 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草抗氧化酶活性的影响 . 32 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片 . 33 盐胁迫对转基因烟草和野生型烟草叶片可溶性蛋白和叶绿素含量的影响 . 34 . 35 理对转基因烟草和野生型烟草叶片气体交换参数的影响 . 35 理对转 基因烟草和野生型烟草膜透性的影响 . 36 理对对转基因烟草和野生型烟草丙二醛含量的影响 . 37 理对转基因烟草和野生型烟草抗氧化酶活性的影响 . 38 理对转基因烟草和野生型烟草叶片 . 39 理对转基因烟草和野生型烟草叶片可溶性蛋白含量的影响 . 40 4. 讨论 . 40 转基因烟草对低温胁迫的响应 . 40 转基因烟草对盐胁迫的响应 . 40 盐胁迫下转基因烟草叶片光合能力的维持 . 40 盐胁迫对转基因烟草叶片膜脂过氧化及体内保护系统的影响. 41 转基因烟草对干旱胁迫的响应 . 41 5. 结 论 . 42 参考文献 : . 43 致谢 . 53 硕士期间发表的论文 . 54 山东农业大学硕士学位论文 1 转 因 烟草 对逆境胁迫 的 响 应 研 究 生 萧蓓蕾 指导教师 李德全 教授 摘 要 蛋白质磷酸化 与 去磷酸化是 细胞 信号 转导 的重要 过程 ，主要通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶 来完 成 。蛋白磷酸酶 2C（ 是蛋白磷酸酶 家族 的一个分支 , 其生化性质、蛋白质组成与结构都和其他磷酸酶显著不同，但都在 细胞 信号 转导 中扮演重要角色。高等植物中 的 的各种信号途径，包括 卫细胞及离子通道调控和气孔关闭、逆境胁迫等。 与植物创伤反应、生长发育以 及抗病性等。作为大多数信号途径的负调控因子， 其他调控蛋白结合， 以及直接与 本文以转 草 和 野生型 烟草 为材料， 溶液培养幼苗， 采用 低温、盐胁迫、 水分 胁迫的 处理方式，研究转 逆境胁迫 的 响 应 ，为改 良农作 物抗逆性提供依据。 主要结果如下： 1、 对 转 因烟草 植株进行 基因 组 筛选阳性植株，进行生理指标测定。 2、 逆境胁迫（低温、盐 胁迫 、干旱）下，两种类型 烟草 叶片的相对电导率、 膜 透性增大， 电解质外渗量增多，膜脂过氧化作用增强。 但转基因烟草相对电导率和 明转基因烟草膜脂过氧化程度低于野生型烟草，这 有利 于 膜功能 的 维持。 3、 逆境胁迫（低温、盐 胁迫 、干旱）下， 转基因 烟 草 相容性物质如脯氨酸 、 可溶性糖的积累 明显高于 野生型 烟草 。 在 低温 胁迫 下 ， 两种类型烟草叶片的 升趋势 ， 但转基因烟草 高于 野生型烟草 ； 在 盐和水分 胁迫下 ， 两种类型烟草叶片的 但转基因转 因烟草对逆境胁迫的响 应 2 烟草 下降幅度小 ，仍保持较高的活性。 在 低温 胁迫 下 ， 两种类型烟草叶片的 升高后降低， 但转基因烟草 下降幅度小 ； 在 盐 和水分 胁迫下 ， 上升趋势 ， 转基因烟草 叶片 上升幅度 显著 。 4、 盐 分和 水分 胁迫下 ， 两种类型烟草叶片的 净光合速率（ 、气孔导度（ 都呈下降趋 势 ， 胁迫 对 两种类型烟草叶片的 净光合速率（ 气孔导度（ 的 影响无明显差异。 盐 分 胁迫下， 伤害较轻 。 5、盐分和 水分 胁迫下 ， 两种类型烟草叶片的 可溶性蛋白含量先下降后升高。 在 150 转基因烟草叶片 的类胡萝卜素含量 呈 上升趋势 ， 野生型 烟草 则 呈 下降趋 势 。 关键词 ： 转 草 ； 蛋白磷酸酶； 低温胁迫；盐胁迫； 水分 胁迫； 逆境 响应 山东农业大学硕士学位论文 3 （ 271018） by of of in of a of to in to be in in As of or NA to of as in by in of We of to as by 因烟草对逆境胁迫的响 应 4 DA in in of DA of of in in It is to of 3. in in of OD or OD in a or OD 4. or Pn s in no v/Fm in It S in 5. or of in ar of in 50 to 东农业大学硕士学位论文 5 英文缩写符号及中英文对照表 英文缩写 英文名称 中文名称 基对 基因烟草 O2 胞间隙 度 六烷基三乙基溴 化铵 生型 烟草 in 适应下的最大荧光 in 适应下的初始荧光 m at in 大光化学效率 孔导度 S 培养基 合酶链式反应 et 光合速率 乙二醇 氨酸 氧化物酶 光系统 氧化物歧化酶 羟甲基氨基甲烷 转 因烟草对逆境胁迫的响 应 6 1. 引言 植物在生长发育过程中，经常遭遇不良环境如干旱、高盐、低温等胁迫因子的影响，使植物生长发育受到抑制，严重时会导致植物死亡。由于植物生长在土壤中，本身不能移动，经过长期的进化和演变，植物形成了对环境感知和 响 应来适应逆境胁迫的本领，这种感知和 响 应的机制是一个复杂的逆境信息的转导过程（ et 997； 刘强等， 2000； et 1999）。 自 20世纪 90 年代以来，对细胞信号转导的研究已成为国内外生物 界关注的热点，并开始深入到生命科学的各个领域，成为解决许多重要理论及实践问题的重要途径。涉及此过程的重要细胞生物学事件就是蛋白质的可逆磷酸化，概括起来说，这种翻译后修饰可以改变信号通路中许多关键蛋白质的性质，如酶活性，细胞内定位等，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡 （ et 1994； et 993； et 1992） 。过去对蛋白质可逆磷酸化的研究主要集中在蛋白激酶的调控方面，随着研究的进一步深入，现在认为蛋白磷酸酶和蛋白激酶同样起着重要的调控作用。 目前，对蛋白磷酸酶的研究远不如蛋白激酶深入，但两者的协同 调节机制在细胞信号转导途径中的作用是不言而喻的。多数蛋白磷酸酶和蛋白激酶一样，是受到精确调节的，许多蛋白磷酸酶位于信号转导途径的下游或末端，是信号调节的对象，这种对蛋白磷酸酶调节过程的存在就说明了蛋白磷酸酶的重要性 （ 2000） 。研究发现在骨骼肌收缩过程中，糖原的合成和降解就是通过对蛋白磷酸酶的活性调节而实现的（ 1994）。因此，分离蛋白磷酸酶基因及其编码蛋白，并研究其在信号转导中的作用机制，对于阐明植物的信号转导网络，并 在此基础上， 利 用基因工程技术提高植物抗逆性具有重要意义。 境胁迫与信号转导 环境胁 胁 指由于环境因素如温度、水分等条件的变化，使植物不 能正常生长的一种状况。植物在复杂多变的环境中生长，阵发性和短暂性的胁迫经常发生。由于植物生长在土壤中，不能像动物那样通过移动来躲避逆境，因而在长期的进化过程中演变产生了多种多样的抗逆机制，其中关键山东农业大学硕士学位论文 7 的一步就是对胁迫信号的感受、识别、传递及转导过程。植物是如 何感受并识别逆境信号，传递逆境信息，激活一系列信号分子并调控相关基因的表达及生理生化反应以适应逆境，从而维持其正常的 生长发育，即植物细胞信号转导问题，现已成为生命科学研究的热点。 胞信号转导系统 生物体的新陈代谢和生长发育主要受遗传信息和外界环境信息的调控。遗传信息决定代谢和生长发育的基本模式，其实现在很大程度上依赖于环境的刺激 ， 其中，对于细胞而言，环境刺激信息包括生物体的外界环境和体内环境信息两个方面。而外界环境刺激在控制细胞的基因表达、增殖、分化和发育过程中发挥着重要的调节作用。 20 世纪下半叶以来，随着信息论、控制论和耗散理论等科学思想的影响和生物学自身的发展，逐渐产生了 “ 细胞信号转导 ” 这一 概念。通常 将生物遗传信息传递过程，即由 蛋白质，称 之为遗传信息传递 的中心法则 ； 而细胞信号转导的分子途径就是 细胞 信息传递的中心法则（孙大业等， 2001）。 生物体内的大分子、细胞器、细胞、组织和器官在空间上是相互隔离的，生物体与环境之间更是如此。根据信息论的基本观点，两个空间隔离的组分之间的相互影响和相互协调一致，不管采用何种方式，都必须有信息和信号的传输或交流。各种参与细胞内外信号感受、传递和应答的细胞组分共同构成了细胞信号转导系统。细胞信号转导主要分以下几个阶段：细胞膜上或胞内受体感受逆境信息并 引起相应的生物学效应，主要是胞内第二信使浓度的改变；依赖第二信使的酶尤其是蛋白激酶被激活，使相应的酶和底物蛋白发生磷酸化，引起信号放大，调控相关基因表达并产生相应的生理反应；或蛋白磷酸酶被激活发生去磷酸化，使具有活性的酶失活，从而缩小或关闭信号通路。 植物具有对环境变化快速感知和主动适应的能力，而这种快速感知和主动适应的策略就是植物体内胞间和胞内逆境信息的传递和转导。这一过程涉及植物对逆境刺激的感受与识别，逆境信使的产生与传输，以及反应部位对逆境信使的识别与转导过程 （ et 1991） 。 转 因烟草对逆境胁迫的响 应 8 蛋白质的可逆磷酸化 蛋白质的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节机制，在细胞的信号识别与转导中起着重要的作用，同时还是传递和放大信号的必要途径。蛋白磷酸酶 （ 和蛋白激酶（ 调控这一过程的两类关键酶 。 蛋白质磷酸化反应是由蛋白激酶催化把 位的磷酸基团转移到底物蛋白氨基酸残基上的过程，而其 逆转过程由蛋白磷酸酶催化完成，称为蛋白质的去磷酸化。大量研究表明蛋白质的可逆磷酸化在信号转导中占有极其重要地位 ，是生物体内普遍存在的信号转导调节方式，几乎涉及所有的生理和病理过程，如糖代谢、细胞的生长发育、光合作用、基因表达、神经递质的合成与释放，甚至癌变等等 （ et 992； 1989； et 993； et 1991； 1994； et 1999； et 1995） 。 据报道，目前已鉴定了 500 多种蛋白激酶和 100 多种蛋白磷酸酶（ 1995； et 1995） 。 蛋白激酶和蛋白磷酸酶同时受到时间和空间的调节，从而影响它们对靶蛋白的修饰程度。蛋白质的可逆磷酸化过程存在多种多样的调节途径，同时蛋白磷酸酶和蛋白激酶有多种底物并可在单个或多个位点发挥作用，这些特性都决定了蛋白磷酸酶和蛋白激酶具有多种功能（ 1995） 。细胞对信号分子的响应主要取决于蛋白磷酸酶和蛋白激酶的相互作用。 白磷酸酶 蛋白磷酸酶的发现 在真核生物基因组中，编码蛋白磷酸酶的基因远少于蛋白激酶，一般只有蛋白激酶基因数的三分之一到四分之一。同时，蛋白质 可逆磷酸化研究的重点也都针对蛋白激酶，现在越来越多的研究显示，与蛋白激酶一样，蛋白磷酸酶在信号转导中也同样有重要作用。以往我们对于蛋白磷酸酶的认识主要来自动物和酵母，植物中了解较早、较多的蛋白磷酸酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。 兔的磷酸酶激酶的 、 亚基为底物，首次在油菜（ 子的提取液中均检测到不依赖于二价阳离子的蛋白磷酸酶的活力（ et 989）。随后，人们相山东农业大学硕士学位论文 9 继从拟南芥（ 、苜蓿（ 烟草 （ 、冰叶日中花 （ 、小麦 （ 、水稻 （ 、玉米 （ 中克隆到编码蛋白磷酸酶 的 基因，部分相关蛋白已被分离纯化 （ et 996； et 994； et 999； Yu et 001； et 998； et 2000； et 001）。 同蛋白激酶相比，植物蛋白磷酸酶的研究还只是刚刚起步，大部分已克隆的蛋白磷酸酶基因还没有得到深入细致的研究，其编码的相关蛋白也没有得到分离纯化，它们在信号转导中的作用机制及其所处的地位也不是很清楚。可以预见，随着生物化学和分子生物学的发展，人们对蛋白磷酸酶的作用将越来越重视，蛋白磷酸酶在植物生长发育中的功能也将得到更深入的了解。 植物中的蛋白磷酸酶 植物中存在为数众多的蛋白激酶和磷酸酶，参与体内庞杂信号网络的各个方面，例如拟南芥基因 组中编码蛋白磷酸酶的基因有 112个 （ et 2002） 。植物蛋白磷酸酶通常分为两大类，即丝氨酸 /苏氨酸 蛋白 磷酸酶（ hr 酪氨酸 蛋白 磷酸酶（ yr 而 专一 去除底物蛋白上酪氨酸残基的磷酸基团。此外，还有一类对丝氨酸 /苏氨酸以及酪氨酸都能起作用的双专化磷酸酶 （ 。 根据催化亚基的不同， 为 中 因对金属离子的不同要求进一步细分为 亚类。 持其生物 活性不需要离子参与， 要 参与，而 有较高的序列同源性，组成一个蛋白磷酸酶 P（ ， 家族； 与需要 的丙酮酸脱氢酶磷酸酶和另外一些丝氨酸 /苏氨酸磷酸酶 （ hr 组成蛋白磷酸酶 M（ ， 。蛋白磷酸酶分类见图 1： 转 因烟草对逆境胁迫的响 应 10 蛋白酪氨酸磷酸酶（ 蛋 白 磷 酸 酶 双专化酸磷酸酶（ 蛋白磷酸酶 1（ 蛋白磷酸酶 P(蛋白磷酸酶 2A（ 蛋白丝氨酸 /苏氨酸磷酸酶 ( 蛋白磷酸酶 2B（ 蛋白磷酸酶 2C（ 蛋白磷酸酶 M(蛋白丝氨酸 /苏氨酸磷酸酶 ( 丙酮酸脱氢酶磷酸酶 图 1蛋白磷酸酶的分类 植物中 生化特性与蛋白质结构 然较早被发现，但却是了解最少的一类丝氨酸 /苏氨酸型磷酸酶。在结构上，虽然在，但却没有发现独立的亚基可以调节 在 亚类中只有 有调控亚基。 或者 离子。 等其他离子， 一般通过竞争 或而使 活性丧失 （ et 1999； et 1998） 。加入螯合剂 ， 对其他一些 显著抑制作用的海绵酸 （ 、环孢霉素 （ 对 1995） 。 植物 端有保守的催化结构域， N 端延伸区是植 物 些不同长度延伸区赋予 的 构域 （ et 1994； Li et 1999） 。烟草的一个 N A 结合的蛋白磷酸酶 1（ ， 的 够与防卫相关基因启动子区域结合 （ et 2003） 。拟南芥中参与脱落酸 （ 信号途径的 端还对 1998） 。山东农业大学硕士学位论文 11 更有甚者，拟南芥 端区域抑制了其酶活性 （ Yu et 2003） 。植物体内 少调控亚基的 端在其蛋白质活 化 以及底物专化性识别中起重要作用。 et 1996） 首次利用 X 晶体衍射观察到人 体结构，其催化结构域的主要特征为两平行 折叠，当中包含双金属离子的三明治结构。其间 4个水分子与 2个 金属离子结合，为去磷酸化反应提供亲水核。这个三维结构解释了 严格依赖性，并且发现 与二价离子结合的序列 6062位氨基酸 ） 在几乎所有的 et 1996） 。一些保守序列对于 在突变体中得到验证，例如拟南芥多数 变体以及回复突变体都位于保守序列或其 附近 （ 1998； et 1999； et 1997） 。依据催化结构域的保守性，发现拟南芥中有 69个 中大多数在进化上与其他植物的关系更为密切，形成不同的簇 （ ，而少数则独立进化为单独的簇。植物 菌 为不同的簇中 （ et 2002） 。 进化 因分布十分广泛，存在于除病毒之外的所有生物。在高等生物中，同一生物体内 往往为数 众多。生物的长期进化过程中，变异是必然的，但是仍然有一定的保守性。根据人 晶体结构，发现 多数保守残基都是维护 身功能的核心区域，如与二价离子结合的序列 60在几乎所有的 都是保守的 （ et 1996） 。另外一些保守序列对于 质的重要性，在突变体中得到验证，多数 变体以及回复突变体都位于保守序列或其附近（ et 1999； et 1997） ，对保守序列的点 突变分析也证明这些序列对 性十分重要 （ 1998） 。如今保守序列已经成为筛选 选基因的重要依据，根据对保守的催化结构域的分析，发现拟南芥中 因有 69 个之多 （ et 2002） 。 因存在久远，因而进化上十分复杂 。冰叶日中花（ 中的 10 个 因有几个彼此间存转 因烟草对逆境胁迫的响 应 12 在密切的同源性，而另外几个则与其他植物中 缘性更 近 （ et 1999） 。对拟南芥的 59 个 因同源 性 分析表明，大多数 与其他植物的关系更为密切，它们一起形成不同的簇 （ ，而少数拟南芥 因则独立进化为单独的簇。植物 因与动物、真菌 因彼此有显著的不同，归在不同的簇中 （ et 2002） 。 植物中 功能 与 控的各类信号途径 一种 重要的植物激素，在植物生长发育