肿瘤个体化分子病理检测和临床应用

肿瘤个体化分子病理检测以及临床应用,山东省医学科学院附属医院病理科 杨香山,肿瘤个体化分子病理检测及临床应用,一、开展肿瘤个体化分子病理检测的意义二、分子病理检测的标本选择三、分子病理检测的方法四、分子病理检测的项目,一.开展肿瘤个体化分子检测的意义,-个体化分子诊断是个体化治疗的基石。-靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计，所以用药前，必需检测患者是否存在对应的靶点，才能发挥其疗效。,卫生部原发性肺癌诊疗规范 (2011)- IV期肺癌在开始治疗前，建议先获取肿瘤组织进行表皮生长因子受体(EGFR)是否突变的检测，根据EGFR突变状况制定相应的治疗策略。,中国肿瘤界正在致力于推动肿瘤个体化分子病理诊断的规范化，同时也希望临床能够与病理科紧密配合，共同实现规范化诊断、规范化治疗的目标，以造福患者。,外科手术标本(石蜡切片） 10 um X2 切片活检标本（石蜡切片） 10um X4 切片穿刺标本（新鲜组织）至少芝麻粒大小胸腹水标本不少于10mL。,二.分子病理检测的标本选择,-尽量避开肿瘤间质、出血灶、坏死物质等-肿瘤细胞所占的比例也是必须要考虑的因素。-目前尚不清楚满足分子学检测需要的最低限度肿瘤细胞的数量。,-获得质、量俱佳的肿瘤标本是EGFR检测的重要前提条件，涉及到从临床标本采集到完成最终检测实验等多个环节。-离体后及时（30分钟内）固定于10%中性缓冲福尔马林液中。-固定时间：小标本6-12h ，大标本6-48h 。,肿瘤组织样本的采集及病理评估,Pirker R, et al. J Thorac Oncol 2010; 5(10):1706-1713.,1. Data on file.2. Kimura H, et al. British Journal of Cancer 2006; 95(10):1390-1395.3. Zhang X, et al. Lung Cancer 2008; 60(2):175-182.4. Soh J, et al. Int J Cancer 2006; 119(10):2353-2358.,胸水标本处理流程,三.分子病理检测的方法,基因试剂盒 价格适中、灵敏度，特异性高、所需时间短。PCR通用设备平台基因芯片 特定设备，价格高测序法检测 PCR通用设备平台，灵敏度，特异性低、所需时间长。价格便宜,（一）技术简介肿瘤个体化治疗是指实施治疗前根据患者的个体差异（基因差异），“量体裁衣”（基因检测）地制定某个患者的治疗方案，即检查某种靶向药物对患者是否有效或是在多种化疗药物中筛选最有效的药物。化疗个体化可显著提高治疗效果，有效缓解疾病，避免药物的毒副作用，提高患者的生活质量，避免因反复尝试不同药物带来的身体损害、错过最佳治疗时间以及浪费金钱。使用靶向药物前必须基因检测，从而判断该药是否适用该患者。,荧光定量PCR与基因测序法检测基因突变的比较,荧光定量PCR与基因测序法检测基因突变的比较,基因检测过程示意图,标本采集与运输要求,基因突变检测方法 -国际肺癌协会共识,测序法与ARMS法比较,测序法和ARMS法在不同标本类型中突变率的比较,ARMS法更适合用于小标本检测,四.分子病理检测的项目,分子靶向治疗基因检测： 药物敏感基因检测： ERCC1基因表达 EGFR（29种、4种） P53基因突变（6种突变）KRAS（7种突变） BRCA1基因表达 BRAF基因突变（V600E突变） RRM1基因表达 Jak2基因突变（V617F突变） TYMS基因表达PIK3CA基因突变（5种热点突变） DPD基因表达 C-KIT基因突变（D816V突变 ） STMN1基因表达 RET基因突变（M918T突变） TYMP基因表达PDGFRA基因突变 （D842V突变） BRCA1基因表达 BCR-ABL基因突变（T315I突变） TOP2A基因表达 EML4-ALK融合基因（RT-PCR法) TUBB3基因表达,（一）分子靶向药物作用靶点基因检测临床应用,二、分子靶向药物作用靶点检测和耐药基因检测临床应用,（二）化疗药物对应的基因检测项目临床应用,扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增（Allele-specific amplification，ASA）。利用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。该法省去了探针杂交操作，通过设计两个5端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物。,细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩， 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂， 形成50300kbp长的DNA大片段， 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段， 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder.如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。,1. 大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期，染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为“爬行”.因此，细胞凋亡早期产生的50300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。,2. DNA Ladder 测定方法：收获细胞（1107）沉淀，细胞裂解液，13000rpm5min, 收集上清，1%SDS和RnaseA（5mg/ml