【毕业学位论文】（Word原稿）共轭亚油酸对肉鸡肉品质的影响及其作用机制的研究动物营养与饲料科学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 共轭亚油酸对肉鸡肉品质的影响及其 作用机制的研究 I 摘 要 本论文通过三个试验研究了饲粮中添加共轭亚油酸（ 合物及 肉鸡生产性能和胴体品质、肉品质、激素以及相关酶活性的影响，并从脂肪型脂肪酸结合蛋白（ 心脏型脂肪酸结合蛋白（ 因 达水平初步探讨了 肉鸡 肉品质，尤其是肌内脂肪沉积的分子作用机制。 试验一研究了饲粮中添加不同水平的 合物对 1 18w 北京油鸡肉品质的影响。结果表明：饲粮中添加 高饲料利用率（ P 以上结果表明，长期在肉鸡饲粮中添加 平的 合物可提高饲料转化率和降低腹脂率 ，降低肌肉剪切力和肉色 b*值； 低腹脂的机制可能与其降低血清 度和 活性有关。 试验二研究了饲粮中添加 鸡肉品质、脂类代谢、苹果酸脱氢酶（ 因 达的影响。结果表明：饲粮中添加 饲粮中 添加量超过 日增重和采食量均有下降的趋势， 全期日增重、饲料转化率有显著影响（ P 著增加了风味、嫩度、多汁性和可接受性的评分（ P 本试验也表明，与对照组相比，注射著降低了血清和组织中单不饱和脂肪酸的浓 度，增加了饱和脂肪酸的浓度；腹腔注射 著增加了 表达（ 综上所述，饲粮中添加 合物和 肉鸡生产性能有显著影响，但对不同 状的影响存在较大差异；长期添加 合物可显著增加肉鸡 含量和改善肉品质； 性和 含量，影响组织中 性，而对胰岛素的浓度没有产生影响；肌肉、血清、肝脏和腹脂中脂肪酸的组成有显 著影响， 合物在肌肉组织中的沉积呈线性增加，也增加饱和脂肪酸的浓度，同时降低单不饱和脂肪酸浓度，但饲粮中添加有改变多不饱和脂肪酸的组成和肌肉 相对含量； 著增加 平的表达。综合以上研究结果可以得出结论， 以作为调控 腹脂的营养素，与 合物相比，在肉鸡生产中应用效果更好，但对具体机制还需进行更加深入的研究。 关 键词： 共轭亚油酸，肉品质， 因表达，肉鸡 to of 2 on to of of of LA LA on in to of on 26 LA of P by It LA of be to in to of on in LA P by LA no on * a* b* LA on of in P in P In by In LA LA LA of of LA DH in no on LA of LA in LA of as a in LA on et LA is on V 目 录 第一章 绪 论 . 1 1 研究目的和意义 . 1 2 国内外研究现状 . 3 究的历史概况 . 3 一般生物学特性 . 3 分析 . 4 氧化稳定性 . 4 脂肪代谢 . 5 轭亚油酸对相关基因表达的影响 . 5 轭亚油酸与肉品质 . 8 肪酸结合蛋白 . 13 轭亚油酸的作用机制 . 15 3 研究内容和方法 . 16 究内容 . 16 术路线 . 17 第二章 共轭亚油酸对肉鸡鸡肉品质和脂类代谢的影响 . 18 1 前言 . 18 2 材料与方法 . 19 3 结果与讨论 . 21 轭亚油酸混合物对北京油鸡生产性能和胴体品质的影响 . 21 轭亚油酸混合物对北京油鸡肉品质的影响 . 23 轭亚油酸对北京油鸡血清 度和 性的影响 . 25 轭亚油酸对北京油鸡肌肉脂肪酸沉积的影响 . 26 4 小 结 . 27 第三章 反 10，顺 12 肉鸡脂类代谢和 达的影响 . 28 1 前言 . 28 2 材料与方法 . 29 3 结果与讨论 . 32 肉仔鸡生产性能的影响 . 32 肉仔鸡屠体品质的影响 . 34 肉鸡血清 二醛、 胰岛素水平的影响 . 35 肉仔鸡肉品质的影响 . 37 肉鸡组织脂肪酸组成的影响 . 39 影响 . 43 肉仔鸡 因表达的影响 . 44 第四章 腹腔注射反 10,顺 12 肉鸡脂类代谢影响的机制 . 47 1 前言 . 47 2 材料与方法 . 47 3 结果与讨论 . 48 血清甘油三酯、 度和胰岛素水平的影响 . 48 肝脏和血清脂肪酸的影响 . 49 相关酶活性和 因表达的影响 . 52 4 小结 . 53 第五章 结 语 . 54 要结论 . 54 要创新点 . 54 要进一步解决的问题 . 55 参考文献 . 56 附 录 . 70 致 谢 . 83 作 者 简 历 . 84 文缩略表 （ 英文缩写 英文全称 中文名称 轭亚油酸 十二碳六烯酸 十碳五烯酸 不饱和脂肪酸 氧化物增生受体 不饱和脂肪酸 as 相色谱 代巴比妥酸反应产物 油三酯 和脂肪酸 内脂肪 油酸 二醛 转录 肪酸结合蛋白 脏型脂肪酸结合蛋白 肪型脂肪酸结合蛋白 中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 1 研究目的和意义 随着生活水平的提高，人们对肉鸡肉品质越来越关注，对肉鸡的消费正由数量型逐渐向质量型过渡。从国内外家禽产业的发展趋势分析，优质肉鸡将逐渐占领国内外肉鸡市场，成为家禽生产的主流。目前，对肉鸡品质形成机理及营养调控 的研究已成为当前研究的热点之一。 共轭亚油酸（ 是含有一组含有共轭双键亚油酸的异构体，然存在的 约占反刍动物的肉中脂类的 75，乳中脂类的 80（ ， 1994）。 有多种生物学功能。 营养研究表明 被吸收并可迅速沉积到脂类和膜中磷脂上（ ，1996； ， 1998）， 动物组织沉积的量主要根据饲粮中 含量和总 摄入（ ， 1994； ， 2002）。 （ 2004）在猪饲粮中添加 2共轭亚油酸，结果表明，肌内脂肪含量提高了 22，眼肌大理石花纹评分提高了 11，但是肉色、剪切力、滴水损失、嫩度、多汁性和风味无显著变化。 O（ 2000）研究表明给育肥公猪饲喂 共轭亚油酸肉色、 和滴水损失没有显著影响。 （ 2001）试验表明添加 共轭亚油酸对肥猪主观肉色评分无显著影响，用色度仪测定的肉色则有影响，反映 肌肉亮度的 L*值显著升高，反映肌肉红度的 a*值无显著变化，反映肌肉黄度的 b*值提高。 O（ 2000）还报道共轭亚油酸显著提高了眼肌大理石花纹的评分。 （ 2002）研究表明 5共轭亚油酸使肌内脂肪含量显著增加。 （ 2002）报道，共轭亚油酸（ 2）对猪肉 、肉色、肌内脂肪、滴水损失、剪切力、多汁性、嫩度和风味没有显著影响。以上研究表明 能对肉品质有影响因试验动物和共轭亚油酸的组成和种类可能有差异。 随着家禽基因组测序的初步完成（ ， 2004），后基 因组或功能基因组时代已经来临，人们开始在 蛋白质水平上研究与肉品质性状相关的功能基因的表达， 使动物营养学研究逐渐深入到分子水平。一般认为，肉鸡脂肪沉积是通过调控参与脂肪代谢相关基因的表达实现的，这些基因主要包括脂蛋白脂酶（ 苹果酸酶（ 、 脂肪酸结合蛋白（ 及过氧化物酶体增殖子活化受体（ 因等（ ， 2004）。 后运送到血管内皮表面，在此把血液带来的乳糜微粒和极低密度 脂蛋白分解成甘油三酯（ 其控制着肌肉和脂肪组织中的 分配，参与肌内脂肪的合成。 究表明其在肌内脂 肪合成中具有重要作用，而 体脂合成中具有重要作用。 参与机体细胞内脂肪酸的摄取，并协助其运输的一种蛋白质，同时 的贮存库，能够在较大范围内以脂肪酸浓度的方式来调控机体内的脂类代谢过程（ ， 1997）。因此，本试验研究 些脂肪代谢相关的基因 控，试图在分子水平阐明 控肌内脂肪沉积的分子机理。 中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 2 肉 鸡的体脂分布于皮下、腹腔和肌肉内，并且脂肪的沉积具有时空性，即首先沉积肌内脂肪，然后是皮下脂肪、腹脂。 肌内脂肪和腹脂的影响存在较大差异，对于差异机制的研究是当前营养研究的热点。肉鸡的脂肪代谢和沉积与人不同，家禽脂肪代谢主要在肝脏，这使家禽肝脏成为对脂肪代谢和沉积最为敏感的器官之一，这将为人类早期代谢疾病的研究提供良好的模型。迄今为止，人们对于 控肉鸡脂类代谢的研究较少，同时肉鸡品质和风味的研究是一个复杂的问题，分子生物学技术和生物信息学技术的运用将有利于阐明这些问题。北京油鸡是我国特有的品种， 肉质优良为本研究提供了理想的试验素材，因此，本研究以北京油鸡和 鸡为试验动物，通过 肉鸡脂肪代谢相关基因表达调控的研究，试图找出调控肉鸡肌内脂肪调控的关键位点或途径，为肉鸡肉品质的营养调控研究提供理论基础。 添加可能增加肌肉生产效率和提供健康动物产品，可以提高猪肌内脂肪的含量，增加大理石花纹，对动物肉品质有一定影响，这些作用是否存在于肉鸡中迄今为止还未在相关文献中报道过。 于肉鸡肉品质的影响研究比较少，肌内脂肪含量和腹脂沉积的多少都会对肉品质和屠体品质产生较大影响。因此，本课题 针对 合物及 肉鸡 肉 品 质的影响及其调控的分子机制 这一当前需要解决的问题 进行系统地研究。这将 为通过 营养 途径 调控 肉品质提供理论基础，同时 本研究结果对人类脂类代谢疾病的研究具有一定的指导意义。 中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 3 2 国内外研究现状 究的历史概况 人们对共轭亚油酸的研究始于上世纪八十年代， 题组试图在烤牛肉中鉴别致癌物质时，他们意外发现烤牛肉的提取物中存在一类天然抗癌物质，这些物质是亚油酸的共轭二烯异构体，把它们集体命名为共轭亚油酸（ ， 1987）。这次发现导致了人们随后 对共轭亚油酸作用进行广泛而深入的研究。共轭亚油酸对癌症（ ， 1990； ， 1999； ， 2005）、糖尿病（ 1998； ， 2001）、动脉硬化（ ， 1994； ， 1997）、免疫功能（ 1994； ， 2001； ， 2002）、体组成（ ， 1997， 1999a，1999b； ， 2003）、抗氧化（ ， 1990； ， 2005）。总 之，这些研究表明饲喂（ 共轭亚油酸混合物能防止肿瘤形成、促进免疫、提高葡萄糖耐受、增加饲料转化率、降低肥胖、增加瘦肉率和降低血脂。然而在这些研究中 合物含有大量的 构体。因此，阐明共轭亚油酸的这些作用究竟是哪个异构体作用的结果是相当困难的。而且共轭亚油酸的天然来源（反刍动物肉和乳），含有 80 10 ， 1998）。共轭亚油酸由多种异构体组成，每种异构体具有不同的细胞代谢途径和方式（ 2002），因此每种 共轭亚油酸异构体作用的机制可能是特异的。当前的许多研究结果不一致， （ 2006）发现 有抑制结肠癌生长的作用，而 没有，人们还发现含有 富的共轭亚油酸混合物降低体脂肪的程度远超过富含 ， 1999a）。体外试验证据也支持这种观点，含有 20 200 M 的 3肪细胞中可以降低甘油三酯和增加脂解。 到目前为止，共轭亚油酸对于动物生产性能和人健康的作用 还不令人信服。动物试验研究了添加的共轭亚油酸多是共轭亚油酸混合物，结果报道不一致。近来许多研究使用具有相当纯度的异构单体，研究表明 作用可能具有单体特异性。近年来研究表明 调节脂类代谢作用的关键。而且 免疫功能具有较弱的影响，对胰岛素耐受的影响还不清楚。 一般生物学特性 源于必需脂肪酸亚油酸。亚油酸是在碳 9 和碳 12 两个位置具有双键的十八碳二烯酸，这两个双键都是顺式结构。亚油酸、 三维构象如图 1。共轭亚油酸的同分异构体是一组位置和几何空间不同的亚油酸的共轭二烯酸。 9,11； 10,12 和11,13 位置上具有双键，在这些位置上每个位置都有可能在几何空间上存在顺式和反式结构（ ， 1994）。到目前为止，已经报道 同分异构体具有 20 多种（ ， 1998a； ，2004）。与其它大多数不饱和脂肪酸不同， 共轭的，带有不可分离的亚甲基。这些异构体中 植物油中含量较丰富，在 含量 分别约占总量的 43%和40%（ ， 1994）。最初， 认为是共轭亚油酸的活性形式，因为它是中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 4 唯一在动物磷脂中发现的共轭亚油酸的异构体（ ， 1990）。然而， （ 1999）研究表明 2 构体具有生物活性，因为在老鼠上能降低体脂肪和增加机体蛋白。据估计体重 70人每天 需要量为 能促进人们的健康（ 1999），这个剂量超过了美国和其它国家的 d。 分析 每种 2002； 2000； 2000； 1999； 000）。目前可采用多种方法对 其衍生物进行分析。常用的有气相色谱法 (银离子 2高效液相色谱法 (核磁共振法 (、超临界流体色谱法 (等。其中 A g 目前最主要的分析方法 ， 可对 行定性 及定量分析 (2000； 2000；2004)。在分析之前常要将 （ 1993）发现 ， 甲酯化会导致 构体组成发生较大的变化 ， 从而极大地影响定量分析结果。 氧化稳定性 化稳定性是个复杂的问题 , 人们对此存在着不同看法。 (1990)认为 有抗癌活性，并认为 潜在的抗氧化剂， 择性吸收进入细胞磷脂，可以部分解释抗癌作用。但进一步的研究否定了这种看法 。 稳定性与其所处的体系有关， 构体的稳定性至少是部分取决于它的顺反构型而非共轭双键的位置异构（ ， 1995），并发现 氧化为四种呋喃型脂肪酸 : 8, 118, 10 9, 129, 11 10, 1310, 121, 1411, 13 （ 1995）在含有 12油酸、 构 of LA A 中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 5 酰 的脂膜中研究了 脂类氧化的影响 , 认为 能是助氧化剂而非抗氧化剂， （ 1999）也发现 油和脂肪中不是抗氧化剂。但 (2005)通过对脂类超氧化和抗氧化酶活性研究 抗氧化性试验，在维生素 E 缺乏的小鼠中具有保持在血浆和肝脏细胞膜的氧化稳定性，这表明 氧化性。 由于 多重要的生理功能 , 它的储存就显得尤为重要。为了提高 品货架寿命 ， 必须加强其稳定性 , 这对 为一个商业化产品至关重要。在 含 10% 低芥酸菜籽油中加入儿茶素 (或丁基化羟基甲苯 ( 均可显著防止 氧化 , 且同量的 能防止 氧化。而维生素 C 对 氧化没有影响 ， 维生素 E 和柠檬酸对 氧化却有促进作用。 脂肪代谢 脂肪组织含有脂类、水和胶原质，主要沉积在动物体的特定部位。鸡主要脂肪库在皮下、肌间脂肪、肌内脂肪。已表明共轭亚油酸能抑制硬脂酰 原酶活性（ ， 1999b）。共轭亚油酸也能降低花生四烯酸的含量。既然，花生四烯酸和二十五碳五烯酸（ 二十二碳六烯酸 (过不同途径合成，降低花生四烯酸合成并不意味着减少 轭亚油酸的生物学 效应可能与减少或改变花生四烯酸和 合成相关。许多研究表明共轭亚油酸能降低哺乳动物的脂肪沉积，也表明共轭亚油酸能促进肌肉生长和降低脂肪沉积（ ， 1999），增加饲料效率（ ， 1997； ， 1994）增加腰部肌肉质量。共轭亚油酸对禽类脂肪积累还少见报道。因此，我们研究共轭亚油酸对于肉鸡生长和脂类水平的影响。 轭亚油酸对相关基因表达的影响 脂肪代谢相关基因表达的影响 降低动物体脂肪的沉积，改善屠体和肌肉品质（ ， 2003），但其作用机制尚未研究清楚。目前通常认为是如下两个机制：第一， 加包含在产热或脂肪酸氧化过程中基因表达，如乙酰 化酶（ 解链蛋白 肉碱棕榈酸转移酶 ；第二， 低生脂基因表达，如乙酰 化酶、脂肪酸合成酶（ 3 磷酸甘油转移酶。 （ 2001）发现在 3肪细胞中 10 100M的 低了硬脂酰辅酶 1（ 因表达，但没有影响 脂肪酸合成酶基因的表达。 责饱和脂肪酸的脱饱和，如棕榈酸酯（ 16： 0）和硬脂酸（ 18： 0）脱饱和形成单不饱和脂肪酸（ 包括棕榈油酸（ 16： 1）和油酸（ 18： 1）， 对于甘油三酯的合成和贮存是必须的。然而 （ 2004）研究 肥胖机理时发现，试验采用野生型和 因敲除老鼠饲喂 周，结果表明两个试验组血浆甘油三酯和游离脂肪酸下降相似，脂肪酸合成酶和解链蛋白 -2 平增加相似，由此，看出 肥胖作用可能独立中国农业科学院博士论文 第一章 绪 论 6 于 因表达和酶活性。但目前研 究还没有确定 制甘油三酯的确切机制以及是否影响前脂肪细胞和脂类代谢。 免疫反应相关基因表达的影响 研究已表明 免疫具有调节作用是通过许多细胞因子作用而实现的（ 2005）。细胞因子通常指由多种细胞产生的具有生物活性可溶性的因子，其在非常低的浓度（ pg/mlng/可对多种 靶 细胞产生广泛的生物活性。细胞因子对于维持生命是必须的，主要通过调节免疫反应而在免疫系统中起着核心作用。细胞因子通过多种途径如细胞因子网络和细胞因子信号调节分子来调控 ，它们主要包括 ： 白介素 ( 、干扰素 ( 、肿瘤坏死因子 ( 、肿瘤生长因子 ( 等。 （ 2002）使用 理巨噬细胞，发现 构体混合物能降低细胞因子如 1 和成，认为 有抗炎症反应至少是部分依赖于 节， （ 2003）发现 有类似作用。 （ 2005）研究发现 抑制 产生，增加了 转录和蛋白水平增加了 生，而且还发现对 节作用是依赖于对 化的抑制，在这个试验中首次发现 增加抗炎症反应细胞因子 转录和产生，同时抑制了细胞因子 可能解释了它的免疫抑制性质。 转录 因子 的影响 脂肪代谢以及免疫反应中相关基因表达调节作用是通过其与转录因子的相互作用来实现。转录因子是指识别并结合到真核启动子序列上的蛋白因子。结构基因上游和下游（甚至内部）存在着许多特异调节成分即顺式作用元件，依靠转录因子结合与否调节基因是否转录。转录因子与顺式作用元件特异性结合是基因表达调节的基本方 式。动物细胞中含有各种序列特异的转录因子，而营养物质可与这些转录因子以不同的方式结合，从而影响转录过程。 转录