肺炎链球菌的检测与分型技术

肺炎链球菌的检测与分型技术,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 呼吸道传染病室李马超,肺炎链球菌简介(Streptococcus pneumoniae; Pneumococcus),一般称为肺炎双球菌或球菌Gram+ 双球菌或链球菌，溶血（草绿色溶血环）,荚膜包覆的肺炎链球菌具有致病力 荚膜多糖体该菌株致病的主要因子可以保护菌株免于被巨噬细胞等吞食具有抗原性各具免疫反应特异性目前可知超过90种,Streptococcus pneumoniaeCapsule major virulence factor91 different capsule types (serotypes).110F18B28A40PCV7: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F211A18C28F41PHiD10: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F311B18F2941FPCV13: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 6A, 19A411C19A3142 PPV23: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 19A, 2, 8, 511D19B32A43 12F, 15B, 17F, 20, 22F, 33F, 9N, 10A, llA6A11F19C32F446B12A19F33A456C12B2033B467A12F2133C47A7B1322A33D47F7C1422F33F487F15A23A34 6D?815B23B35A 11E?9A15C23F35B9L15F24A35C9N16A24B35F9V16F24F3610A17A25A3710B17F25F3810C18A2739,肺炎链球菌的发现,1881年美国George Sternberg与法国Louis Pasteur首次各別从唾液中发现微尖型的双球菌Pasteur将患有狂犬病病死儿童的唾液植入兔子，而Sternberg将自己唾液植入兔子，二者结果皆可在兔子血液中分离出双球菌。1886年Fraenkel认为应将该菌归类为肺炎球菌同年Weischelbaum建议命名为Diplococcus pneumoniae但是直到1920年才正式被承认而目前的命名Streptococcus pneumoniae是在1974被确定，主要是经过rRNA基因序列分析而得名。,著名的转化试验 1928年 Griffith,鼻窦,鼻,肺,鼓膜,血管,脑膜,骨骼,肺,肺炎链球菌定植与扩散,Musher DM. In Mandell G, Bennett JE, Dolin R editors. Principles and practice of infectious disease. 4th ed. New York, USA: Churchill Livingstone, Inc.; 1995. p.1811-26,至少有60%的健康学龄前儿童、30%的健康学龄儿童与成人在鼻咽部携带有肺炎球菌,扩散,沒有感染者帶菌者发病者,突破血脑屏障,肺炎球菌菌血症,鼻窦炎,脑脊液渗漏,脑膜炎,中耳炎,鼻咽部移殖,肺炎,突破吞噬细胞防御系统,突破呼吸道粘膜纤毛防御系统,腹膜炎关节炎等,Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: ASM Press; 1994. p. 322-31,肺炎链球菌疾病负担,13,侵袭性肺炎球菌疾病及其相关死亡CDC急性细菌性疾病监测* （2006年）,/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf,458例死亡。死亡率 65岁: 7.55/100 000 1岁: 0.71 / 100 000,*覆盖2800万(占美国人口9%),欧洲1985 2006年2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾病发病（发表的研究）,*每10万 2 岁儿童的年发病数,Adapted from McIntosh 2007. Epidemiology and Infection (2007), 135:644-656,侵袭性肺炎球菌疾病,脑膜炎,15,肺炎球菌疾病死亡率最高的10个国家多数位于亚洲和非洲,占全球死亡的%,Source: WHO,全人群,16,全球所有年龄疫苗可预防疾病死亡数,疫苗可预防疾病死亡数(WHO, 2003年6月),/vaccine_research/about/gvrf/Levine_Orin.pdf.,肺炎球菌疾病轮状病毒流脑ACHib黄热病乙型肝炎百日咳破伤风脊灰麻疹白喉,5岁以内 5岁以上 合计,17,肺炎球菌会导致 31-33%的急性中耳炎40%治疗失败 长期或复发中耳炎:50%的病例分离的细菌里，80%对青霉素耐药,Gehanno P et al. PIDJ 2001; 20:570-3. Maillet F. 1998 2000 BEH n42/2002:207-8. Gehanno P et al. PIDJ 1998; 17:885-90Husson MO et al. Pathol Biol 2001. 49: 789-93.,急性中耳炎: 容易被忽略的感染,肺炎链球菌研究的关注重点,病原学研究（检测与鉴别）分子特征研究（分子分型与进化）耐药性研究肺炎链球菌的检测与鉴别肺炎链球菌的分型方法,肺炎链球菌的检测,培养基：哥伦比亚血琼脂/巧克力琼脂溶血环510CO2、35培养1820h,菌落形态扁平（脐窝）/粘液,镜下观察革兰氏染色/电镜,生化鉴定-胆汁溶解（+）,生化鉴定-奥普托欣实验（敏感）,试剂盒-生物梅里埃API（生化鉴定仪）API 20 STREP 链球菌及有关种类的鉴定系统（Ref. 20600）API 20 STREP 肺炎链球菌药敏卡片（ Ref.22231 ）适用范围：细菌培养物优点：可鉴别多种相关细菌,试剂盒-生物梅里埃Slidex Pneumo Kit适用范围：脑脊液、细菌的培养物优点：灵敏、易判读、准确度较高,试剂盒-OXOID DRYSPOT PNEUMO TEST适用范围：脑脊液 细菌培养物优点：灵敏、易判读、准确度高,试剂盒-BinaxNow Streptococcus Pneumoniae适用范围：尿液 脑脊液 细菌培养物优点：操作简便、准确度高,其他检测方法：普通PCR检测（cpsA）荧光PCR检测（lytA）,常用于肺炎链球菌的分型方法,1.基于血清学特征的：血清分型/群、普通PCR分型、荧光PCR分型2.基于分子特征的：MLST、MLVA、PFGE,基于血清学特征,血清分型/群以荚膜多糖的特异性为基础荚膜肿胀试验（Quellung Reaction ）是肺炎链球菌区分血清型的金标准,血清分型的意义（1）,各血清型的发病率不同 :,Hausdorff WP, et al. CID 2000; 30: 122-40. Valles X, Flanner B, et al. Trop Med Int Health 2006; 11(3): 358-66,年龄,地区,血清分型的意义（2）,感染后的致病部位,免疫状态,对抗生素的耐药不同,一些种族或民族之间不同,血清型,携带与侵袭能力,侵袭携带,分离物数量,Source: Clinical updates in Pediatric Infectious Diseases. Vol2(6): Feb 1999.,丹麦SSI日本生研,基于血清学特征,SSI Pneumococcus antisera,SSI胶乳优点：操作简单、结果易判读局限性：价格昂贵鉴定范围有限,基于血清学特征,PCR分型血清分型：成本高、操作复杂、处理量小，依赖于培养PCR分型方法：成本低、操作简单、高通量可以对临床标本进行检测,基于血清学特征,PCR分型 引物设计来源41对引物,基于血清学特征,PCR分型,基于血清学特征,PCR分型存在缺陷：1.对仪器设备有一定的依赖性2.不能对全部血清型/群进行鉴别3.存在一定比例的分型错误,基于血清学特征,荧光PCR分型:灵明度更高特异性更强多病原检测,The Ct value corresponding to the detection level of RT-PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping,基于分子特征,MLST： Multi-Locus Sequencing Typing 选定数个看家基因位点；针对各基因位点设计相应的PCR引物，扩增各目的看家基因片断；扩增产物测定DNA序列；进而给每各基因位点指定相应的等位基因数值；各看家基因位点的等位基因数值共同构成一个等位基因谱，从而命名相应的序列型。,PCR,Sequencing,GCCATGCTTAGAAT,MLSTDATABASES,6,2,3,15,2,7,2,基于分子特征,148株IPD MLST分析,74个ST4个高致病克隆在中国发现24个新的ST型别被发现,基于分子特征,PFGE：Pulsed Field Gel Electrophoresis,基于分子特征,基于分子特征,A B C D E F G H I,基于分子特征,肺炎链球菌分型技术-脉冲场分型 PFGE Typing SOP,我国部分地区肺炎链球菌血清分型与脉冲场凝胶电泳分型分析 ：中国疫苗和免疫2010年第03期,基于分子特征,MLVA：Multiple-Locus variable number tandem repeat Analysis,细菌基因组中广泛分布的短重复序列（r