体液蛋白质检验医学PPT

1,体液蛋白质检验,人类白蛋白分子,2,1、掌握血浆蛋白质的组成、功能及分类；个别血浆蛋白质（前白蛋白、白蛋白）的来源和生理功能；血清总蛋白和白蛋白的测定方法和原理。,2、熟悉急性时相反应蛋白的概念和种类；血清球蛋白和纤维蛋白原的测定方法,3、了解其他蛋白质的来源和生理功能；尿液蛋白和脑脊液蛋白的检测 。,本章教学要求：,3,第一节 血浆蛋白质概述,机体蛋白质：,体液蛋白质的检测：,机体主要的 生物大分子,含量：人体固体成分的45%,种类：10万，30005000种/单细胞,功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等,疾病发生,体液蛋白质异常,4,要判断异常,首先要清楚正常的血浆蛋白质组成、功能、分类及特点,一、血浆蛋白质的功能及分类,组成：,种类：1000种 500种 200种含量：g mg g来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂,5,功能：,维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%80%的血浆渗透压；运输功能：脂溶性物质、激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；维持血浆的酸碱平衡：酸性或碱性蛋白质；免疫与防御功能：血浆免疫球蛋白与补体等免疫分子；凝血、抗凝血及纤溶等功能：除因子外均可营养作用，修补组织蛋白;催化作用：酶的本质；调控物质代谢；作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶；,6,分类：,依据来源、分离方法和生理功能,来源,肝生成：绝大多数血浆蛋白质,其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素,7,分离方法,盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）,电泳法：,醋酸纤维素薄膜电泳：6种,琼脂糖凝胶电泳：13种,聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种,SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种,分辨率增高,-,-,-,+,纤维蛋白原,醋酸纤维素薄膜,8,即时可用的蛋白质电泳标准,9,功能分类:,10,二、血浆中几种主要的蛋白质,结构： MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。理化性质：p4.7，肝细胞合成，半寿期12 小时。测定方法：免疫比浊法免疫扩散技术。,（一）前清蛋白（PA）急性时相反应蛋白,11,功能：营养指标，载体功能（甲状腺素维生素）。临床意义：敏感性高的指标； 降低：营养不良，肝功不全， 急性炎症，恶性肿瘤， 肝硬化及肾炎时。参考值： 200400mg/L 。,12,结构：585个aa残基构成的单链多肽， MW=66458，含17个二硫键。理化性质：pI=45.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15-19 天，占总蛋白的40%60%，p7.4时带负电。测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG），溴甲酚紫（BCP）,盐析等。,（二）清蛋白（ALB）急性时相反应蛋白,13,功能：营养作用，载体功能（高亲和力）和解毒，维持血浆渗透压和正常p值。临床意义：合成受食物影响，敏感性较低。降低:在营养不良，肝功不全，急慢性肝疾病时;增高:少见,假性升高。参考值：35-50 g/,14,结构： MW=12-16 万, 1046个aa残基构成的单链多肽，含糖约，每分子铜蓝蛋白可结合个铜原子。理化性质：肝合成,巨噬细胞和淋巴细胞合成少量；pI 值为4.4， 具遗传基因多态性。测定方法：免疫化学（扩散或比浊）等,（三）铜蓝蛋白(CER) 急性时相反应蛋白,15,功能：具氧化酶活性且起抗氧化剂作用，铜的无毒代谢库临床意义：增加感染,创伤,肿瘤; 降低-营养不良，严重肝病及肾综;协助诊断肝豆状核变性（Wilson 病）：铜蓝蛋白降低，游离铜增加致铜在肝沉积引起肝硬化，脑基底节豆状核变性。参考值：了解,16,结构： MW=7.7 万,单链糖蛋白，含糖约。理化性质：肝细胞合成， pI 值为5.5-5.9,半寿期7 天，可逆结合多价离子如Fe,Cu,Zn,Co 等，一分子TRF 可结合两个三价铁。测定方法：免疫扩散法，放免法和免疫比浊法等。,（四）转铁蛋白(TRF) 急性时相反应蛋白,17,功能：运输铁。临床意义：血TRF 浓度受铁供应调节，缺铁TRF 升，铁治疗后恢复。可用于贫血的诊断和对治疗的监测。降低:急性时相反应、慢性肝病、营养不良及蛋白丢失时；升高：妊娠或雌激素会使其升高;缺铁性低色素贫血升高。参考值：了解,18,结构： 两对肽链形成四聚体，有变异体。理化性质：肝合成， pI 值为4.1，电泳位a2 -球蛋白区带测定方法：电泳法，免疫化学法（扩散,浊度）,化学法等,（五）结合珠蛋白(Hp) 急性时相反应蛋白,19,功能：与红细胞中释出自由Hb 结合,防止Hb 从尿中丢失保存铁, 急性溶血后一周再生恢复。高效的过氧化物酶。需铁细菌的天然抑菌剂。临床意义：升高：急性时相反应；雄激素刺激升高降低：血管内溶血时；雌激素使其降低。参考值：0.5-2.2 g/L,20,结构：394个aa残基构成的单链多肽，含1012%的糖MW=5.5 万。理化性质：pI值为4.8，占1-球蛋白区带显色的90。测定方法：免疫化学法，电泳（酸性凝胶电泳或等电聚焦电泳），利用蛋白酶抑制能力测定等。,（六）1-抗胰蛋白酶（AAT）急性时相反应蛋白,21,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的p依赖性。临床意义：降低：血浆AAT仅见于胎儿呼吸窘迫综合症。升高：炎症、术后，某些激素治疗后。参考值： 0.831.99g/L,22,结构：181个aa残基构成的单链多肽， MW=4万，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。理化性质：pI 值2.73.5，肝合成，脓毒症时粒细胞和单核细胞及某些肿瘤组织也可合成。 位于1-球蛋白区带。测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法），ELISA法等,（七）1-酸性糖蛋白（AAG） 急性时相反应蛋白,23,功能：与免疫防御功能有关，机制不详；抑制血小板凝集影响胶原纤维形成；参与脂类运输。临床意义：升高：急性炎症，组织损伤，风湿，肿瘤，急性心肌梗死（AMI），溃疡性结肠炎；降低：营养不良降低, 严重肝损伤和雌激素使其降低。参考值：.252.0g/L 。,24,结构： MW=6280 万,分子量最大，由四个相同的亚基组成，含糖量约。理化性质：肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期5 天。测定方法：免疫化学等,（八）2-巨球蛋白(AMG),25,功能：与多种分子和离子结合，影响蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制剂具有选择性保护某些酶的作用）。临床意义：婴幼儿及儿童比成人高；升高：雌激素，低蛋白血症可使其含量升高；降低：胰腺炎及前列腺癌时。参考值：1.31-2.93g/L,26,结构： MW11.5-14 万，分子含个相同的亚基，亚基间靠非共价键连接成圆盘状多聚体。理化性质：肝合成， pI 值为6.2，电泳位于 区带。测定方法：半定量沉淀法（早），免疫化学法。,（九）C-反应蛋白质(CRP) 急性时相反应蛋白,27,功能：结合多糖，磷脂和核酸；激活补体，抗凝。临床意义：第一个认定的急性时相反应蛋白,是急性时相反应的一个敏感指标，在、创伤、感染、外科手术时含量迅速升高，达到正常的2000倍。参考值： 8.0mg/L （血浆）,28,（十）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）,生化特性,1、于结肠癌的提取物中发现，因此抗原也出现在胚 胎细胞上，故称癌胚抗原。 2、CEA是一种结构复杂的可溶性酸性糖蛋白，含糖量约为45%55%； CEA属细胞表面糖蛋白家族，不规则地分布于细胞表面，易被细胞分泌或脱落至血液或其它体液中；电泳位置于-球蛋白的位置；有5种互相不重叠的抗原决定族，分别命名为Gold15，其中13有很高的特异性，45有交叉反应,29,基因位于19号染色体上，由10个基因组成，可表达36种不同的糖蛋白， 胚胎期主要由胎儿的消化道上皮、肝脏和胰细胞分泌，出生后消失。 成人CEA主要是由结肠粘膜细胞分泌到粪便中，少量重吸收入血。 健康成人血中CEA浓度小于2.5g/L。,生化特性,30,临床应用,CEA是一种低器官特异性肿瘤标志物。不适合作某种恶性肿瘤的诊断和筛查，但对预后判断、疗效观察及辅助诊断是一个有效的监测指标，也是发现复发的理想指标,1、用于辅助诊断： 肿瘤名称 阳性率 结肠癌 70%90% 胰腺癌（中晚期） 88% 91%， 肺癌 76%， 乳腺癌 70%2、检测胃液中的CEA对胃癌有一定的诊断意义。,31,3、CEA比正常持续升高510倍（如20g/L） 往往提示有恶性肿瘤特别是肠癌的存在。4、注意排除非癌性CEA升高。 良性疾病如吸烟者、酒精性肝硬化、肺气肿、结肠息肉、非特异性结肠炎、胰腺炎、良性乳腺疾病等也可引起CEA的上升,临床应用,32,结构：590个aa残基构成的单链多肽， MW=6.5万万，含4%的糖。理化性质：pI 值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之间。胎儿肝卵黄囊合成，成人量微，升高由于肿瘤细胞合成。测定方法：免疫化学法（扩散,火箭电泳）,ELISA等,（十一）甲胎蛋白(AFP),33,功能：胎儿血浆主要蛋白质，调节肝细胞生长和脑细胞发育；抑制细胞和体液的免疫反应；维持正常妊娠，防止母婴排斥。临床意义：胎儿产前监测（羊水或母血）增高：原发性肝癌患者诊断和鉴别（80%原发增高）， 其他癌症也可见增高。参考值：20-100g/L(成人) 5g/L(新生儿),34,三、疾病时的血浆蛋白质,：在急性炎症或某些组织损伤时，有些血浆蛋白质含量会增高，有些会降低，这种现象称为急性时相反应。而这些血浆蛋白质被称为急性时相反应蛋白。,（一）急性时相反应与急性时相反应蛋白,35,急性时相反应蛋白分类：,升高：其他多种蛋白质。,降低：前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白,36,急性时相反应机制： 当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。,急性时相反应的应用： 急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关，可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。,37,38,（二）肝脏疾病：,（三）肾脏疾病：,肾病早期,严重肾脏,选择性蛋白质丢失,非选择性蛋白质丢失,（四）风湿病：免疫球蛋白，1-酸性糖蛋白，结合珠蛋白及升高,（五）遗传性缺陷：多由于编码相应蛋白质的基因发生突变或缺失。,非典型的急性时相反应，,急性肝炎,慢性肝硬化 见表8-3,39,40,第二节 体液蛋白质测定,总蛋白测定,个别蛋白质的测定,蛋白分离测定技术,发展趋势:,测定体液标本:,血浆：普遍,尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查,41,免疫化学法特异定量个别蛋白质,体液蛋白质的测定方法概括：,常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法，微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（ELA/ELISA）,42,电泳测定：,定量化学测定TPr，Alb,电泳 组成图谱 半定量 定量,染料结合法，UV法，折光法等,43,（一）血清总蛋白测定,假设：,、 纯多肽链，含氮量平均为16 % 、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量,44,测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质,1、元素组成测定：含N稳定；2、重复的肽链结构：具有多个肽键；3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收；4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接；5、沉淀后借浊度测定：光度计测定；6、光折射测定：折射仪测定。,45,方法：,1.凯氏定氮法参考方法2.双缩脲法( 推荐) 3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6. UV 法.折光测定法,46,1.凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro),消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+ ）滴定用已标定的无机酸滴（使H+ 恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含 量成正比。,原理：,47,评价：,优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。,应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法,48,2.双缩脲法,原理：,蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。,双缩脲生成,49,评价：,优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。,应用：常规推荐方法。手工或上机使用。,50,3.酚试剂法,原理：,蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，,Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。,Folin 1921 年首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951 年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。,51,评价及应用：,优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。,52,4.比浊法,原理：,评价及应用：,优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）,某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。,53,5.染料结合法,在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。,原理：,常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等,评价及应用：,优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。,54,6.紫外分光光度法,蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260,原理：,55,评价及应用：,优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。,56,7.折光测定法,溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。,原理：,评价及应用：,优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。,57,参考范围：成人6080g/L,临床意义：,总蛋白升高：,总蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿,真性升高：多发性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等,假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高，A/G几乎不变,58,（二）血清白蛋白测定,方法：,1.染料结合法( 推荐) 2.盐析法3.电泳法4.免疫化学法,59,1.染料结合法( 推荐),原理: 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。,染料,BCG,BCP,优点,缺点,易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差,与非人源性白蛋白结合力弱 与白蛋白结合特异性好,在30秒内测可提高特异性,BCG:溴甲酚绿，BCP：溴甲酚紫,60,应用及评价:,严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动化分析。临床上推荐使用。,61,原理: 盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。 各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。,2.盐析法,中性盐：硫酸铵、硫酸钠等,62,应及评价:,操作繁琐，不宜自动化，基本不用,63,3.电泳法,操作：,醋纤膜电泳,染色,晾干,透明,光密度仪扫描,洗脱,比色,染色,分离,测得蛋白组分百分比,计算得出各种蛋白质含量,半定量,定量,64,评价及应用：,优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌,缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高,65,4.免疫化学法,原理及特点:,应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.,66,参考范围:成人3555g/L.,临床意义：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿 先天性ALB缺乏病,真性升高：未见,假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白,67,（三）血清球蛋白测定,方法：,间接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸 紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反应:,参考范围: 成人2030g/L. A/G：1.52.5,68,临床意义：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成减少、低或无-球蛋白血症,真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反应、MM、巨球蛋白血症。,假性升高（少见）：机体明显失水。,69,二、尿液蛋白质测定（一）尿液总蛋白的测定,来源：,来自血浆蛋白，主要是,来自肾脏与尿路的组织蛋白。,临床应用：正常儿童40mg24h，成30mg130mg/24h ；异常：蛋白尿。,检测：用于泌尿系统疾病及一些全身性疾病的筛查、疗效观察，详见肾脏功能检验。,70,三、脑脊液蛋白质测定,脑脊液蛋白质来源:,外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的低分子量蛋白质,占血清蛋白质1%以下,内源:由中枢神经系统合成,脑脊液特有的蛋白质.,71,检测方法:,1、浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠