超敏反应性疾病的免疫学检验医学PPT

,超敏反应性疾病的免疫学检验,超敏反应：已经致敏的机体再次接受相同抗原刺激后，所引起的以生理功能紊乱或组织损伤为主的异常的适应性免疫应答。,第一节 激发试验,激发试验（provocation test） 是模拟自然发病条件，用少量超敏原引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定超敏原的一种体内试验。,非特异性激发：是用组胺等刺激物做雾化吸入， 以观察患者对型超敏反应的敏感性，进而分 析病因或判定疗效。 特异性激发：是用抗原如尘螨等做试验，对明确 超敏原有一定价值。 用于型和型超敏反应性疾病的检查。,收集原料 粉碎、匀浆 脱脂、提取 过滤、分离 鉴定 分装、保存,清毒试验部位,抗原的制备,皮试,前臂曲侧、上臂、背部,禁忌：皮肤患湿疹、感染、皮炎或外伤正在或近日服用免疫抑制剂或抗组胺药物,皮肤试验的类型与方法,皮内试验（intracutaneous test）；挑刺试验（pricktest） 主要用于型超敏反应斑贴试验（patchtest） 主要是检测型超敏反应,0.010.03ml/针,方法,结果,一、皮肤试验-皮内试验,比皮内试验敏感性稍低，但假阳性较少； 皮试液浓度要比皮内试验高10100倍。,将试验抗原与对照液分别滴于试验部位的皮肤上,用针尖透过液滴轻挑一下以刺破皮肤而不出血为度,1min后拭（吸）去试验抗原液,一、皮肤试验-点刺试验,皮内试验较点刺试验有更好的敏感性,第一次读：48小时打开斑试器,间隔30min待斑试器 压痕消失后判定结果。第二次读：第3天或第4天。如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给予紫外线照 射，操作过程相似。,一、皮肤试验-斑贴试验,假阴性出现的常见原因： 皮试液的浓度过低或失效； 老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后； 皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂； 操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。,结果分析及注意事项,结果分析及注意事项,假阳性出现的常见原因： 皮试液含有非特异性刺激物； 患者患有皮肤划痕征； 操作手法较重； 注入量较大或浓度过高； 注入少量空气等。,询问病史,阳性对照,必备抢救药品和设施,如何避免假性结果的出现：,适应证,阴性对照,皮试液浓度,皮肤试验的应用,预防药物或疫苗等过敏 防治型超敏反应性疾病结核菌素试验评估机体细胞免疫功能 预防皮肤接触过敏,结核菌素试验,是用结核菌素进行皮肤试验，通过观察局部是否出现迟发型超敏反应，判断机体有无结核分枝杆菌感染和对该菌的免疫力。,阳性：机体已感染过结核杆菌或BCG接种成功；强阳性：可能有活动性结核病；阴性：机体未感染过结核分枝杆菌， 但应考虑： 感染初期； 老年人； 重度结核病患者，机体处于免疫反应低下状态； 患有其他疾病。,结核菌素试验,手捏式雾化器,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,雾化抗原颗粒5微米,测定肺功能指标：用力肺活量(FVC)1秒用力呼气容积(FEV1)最大呼气流速(PEF)比气道传导率(sGaw),射流雾化器,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,测基础肺功能,激发物稀释液：低浓度/小剂量双倍浓度/剂量递增,阳性伴明显气促、喘息,口吸入,11分半钟,测定肺功能,阳性标准/明显不适/临床症状,直至,激发物达到最高浓度,阴性反应,支气管舒张剂,吸入,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。每次观察不能小于24小时。FEV1：重复性好，结果稳定；PEF：峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制， 与FEV1有较好的相关性，适合流行病学调查；sGaw：敏感性好，但重复性稍差。,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,结果判断：,变应原的确定常以定性试验判断结果。 阳性：气道反应性增高 FEV1、PEF较基础下降20或sGaw下降35%， 有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,结果判断：,阴性：气道反应性正常 FEV1、PEF或sGaw上述标准，正常值为阴性。 无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔23周后复检或2个月后再测。,受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况下一般不适宜作激发试验；有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触等。,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,注意事项及禁忌症：,受试者在检查前：48小时：停！抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素类药;12小时：停！支气管扩张剂;15分钟：实验室休息,病史、体检排除BPT的禁忌证。,注意事项,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,注意事项及禁忌症：,二、支气管激发试验（bronchial provocative test,BPT）,应用与评价：,观察症状,症状好转或减轻,导致,基础饮食,吃可疑的过敏食物,症状加重,1周后,疑似,过敏原，重复3次,确定,某食物为过敏原,症状未减轻,1周后,排除,食物所致过敏,三、食物激发试验,结膜激发试验,将超敏原滴于一眼，阳性反应为结膜充血、水肿、分泌增加、搔痒，甚至眼睑红肿。注意假阳性对结果的干扰。,四、其他方法,结果判定及分析,型超敏反应 抗原刺激后2030min内观察结果。 阳性反应： 点刺试验以红晕为主 皮内试验以风团为主,结果判定及分析,型超敏反应 接触抗原后4872h内观察结果。 阳性反应： 皮内试验以红肿和硬结为主 斑贴试验以红肿和水疱为主,假性结果,假阴性 ：试验抗原浓度过低或因各种原因失效；正服用免疫抑制剂或抗组胺药物；操作误差 ；皮试季节选择不当 。假阳性 ：试验抗原不纯，引起交叉反应；试验溶液配制不当，产生非特异性刺激；皮肤反应性过强；操作不当。,第二节 IgE的检测,一、血清总IgE的检测, ELISA双抗体夹心法：操作简便，敏感性很高，是测定血清IgE最常用的方法。, CLIA：敏感度更高，特异性高，定量。,临床意义：正常人群血清IgE水平受地域环境、种 族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、测定法及取 样等影响，结果有一定差异。,参考值,0.10.9mg/L,某些过敏体质者高于正常100010000倍,血清IgE高,特应症、支气管肺曲菌病、药物性间质性肺炎、麻风、寄生虫病及IgE型骨髓瘤等,一、血清总IgE的检测,总IgE：正常成人血清含量为 20200IU/ml 婴儿血中IgE含量极低； 寄生虫感染时可显著增高。sIgE:ECP(嗜酸性细胞阳离子蛋白）：,放射免疫吸附剂试验 （radioimmunosorbenttest，IRST）酶联免疫测定法(ELISA) 化学发光固相荧光免疫分析,一、血清总IgE的检测,临床意义 ：1、正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响2、IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。,一、血清总IgE的检测, 酶联免疫吸附试验（ELISA）：常用间接法。 免疫印迹技术（IBT）：操作简单，能一次性测定多种变应原的特异性IgE，故临床已普遍采用IBT法。,二、特异性IgE的检测,（+）,洗涤,洗涤,洗涤,结果,ELISA间接法检测特异性IgE,特异性变应原加入待检血清,转印至NC膜,NC膜,待检血清特异性IgE,抗-IgEHRP,底物,特异性抗原条带显色,NC膜变应原特异性IgE抗-IgEHRP,IBT检测特异性IgE,目前公认的检测I型超敏反应方法之一；具有特异性强、敏感性高；影响因素少、对患者绝对安全等优点；过敏性哮喘诊断；寻找变应原。 缺点：费用昂贵、花费时间长、不同试剂盒的参比血清不同不易相互比较。,二、特异性IgE的检测,第三节 免疫复合物检测,抗原特异性循环免疫复合物 利用免疫复合物中抗原特异性来测IC。 优点：特异性高； 缺点：需制备专一的针对抗原的抗体，只能检测特定的一种IC，不常用。（免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂）,抗原非特异性免疫复合物检测,不考虑免疫复合物中抗原的性质，只检测免疫复合物的总量。 根据检测原理不同，检测技术分为：,1.物理法PEG法2.补体法C1q结合试验3.抗球蛋白法mRF固相抑制试验4.细胞法 Raji细胞试验,CIC：分子量600kDa以上，沉降系数19S；热聚合人IgG(heat agglutination human IgG, HAHG)：作为参考标准品，绘制标准曲线进行CIC定量或测定A值代表CIC相当于HAHG的含量。,一、抗原非特异性CIC检测技术,一、抗原非特异性CIC检测技术,CIC的检测方法：按抗体分子在结合抗原后发生的物理学和生物学特性的改变而设计。 PEG比浊法; ELISA法; 细胞法Raji细胞法; 抗球蛋白技术mRF凝胶扩散试验。,一、抗原非特异性CIC检测技术,PEG比浊法：,1.基本原理 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）为不带电荷、直链大分子结构的多糖，有强脱水作用，利用2%4%浓度的PEG可选择性沉淀大分子CIC。2.技术要点 生物化学检验。,3.注意事项： 2%PEG沉淀大分子CIC； 4%PEG沉淀较小分子CIC； 超过5%PEG选择性沉淀CIC的特性消失； 温度影响极大，需进行温差校正； 低密度脂蛋白使浊度增加，空腹采血； 高球蛋白血症和标本反复冻融浊度增加。,一、抗原非特异性CIC检测技术,PEG比浊法：,一、抗原非特异性CIC检测技术,ELISA法：,1.基本原理 ELISA法测定的CIC，是能够结合C1q的 IgG类抗体与其特异性抗原形成的CIC。2.技术要点 将聚苯乙烯包被上C1q，加入受检血清， CIC中IgG的Fc段与C1q结合，再加抗人IgGHRP， 形成C1q-CIC-抗人IgGHRP复合物，加底物显色。,一、抗原非特异性CIC检测技术, 灵敏度高于PEG比浊法，检测到0.1mg/L，重复性好等优点； C1q制品不易精制, 纯品不稳定，只能检出与补体结合的CIC。,ELISA法：,一、抗原非特异性CIC检测技术,细胞法-Raji细胞法：,1.基本原理 Raji细胞是从Burkitt淋巴瘤分离建株似B细胞系，在体外繁殖传代，细胞表面有高密度的C1q、C3b、C3d等补体受体，而且不易脱落。,2.技术要点 将一定量待检血清、HAHG和Raji细胞混合，使补体、CIC或HAHG与Raji细胞形成复合物，加入抗人IgGFIC，形成Raji细胞补体CIC(或 HAHG)抗人IgG FIC复合物，检测荧光强度。,一、抗原非特异性CIC检测技术,细胞法-Raji细胞法：,3.影响因素 培养条件能改变Raji细胞其表面受体的数量及亲和性，影响检测敏感性; 待检血清中如有抗淋巴细胞的抗体，能和Raji细胞反应; SLE血清中的抗DNA也能和Raji细胞反应，使测定结果偏高。,一、抗原非特异性CIC检测技术,细胞法-Raji细胞法：,4.方法评价 敏感性高(6mg/L HAHG)，实用性强； 缺点需培养Raji细胞和同位素标记抗人IgG，操作繁琐; Raii细胞培养较困难，不易长期稳定保持其特性，培养条件受限。,一、抗原非特异性CIC检测技术,细胞法-Raji细胞法：,1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。,一、抗原非特异性CIC检测技术,抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：,1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。,一、抗原非特异性CIC检测技术,抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：,2.技术要点将mRF和待检血清中的CIC在琼脂凝胶中扩散，mRFCIC结合形成沉淀现象，进行CIC定性或定量。,一、抗原非特异性CIC检测技术,抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：,3.方法评价敏感度较低100mg/L（HAHG），mRF来源受限，操作费时，难于常规应用。,一、抗原非特异性CIC检测技术,抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：,自身免疫性疾病病程中连续动态观察或辅助诊断：试验方法本身不完善；IC形成的复杂性，如在生理状态下IC是由各种抗原 与相应抗体所构成的，维持动态平衡。在病理状态 下往往是单一种类IC增高，而此种单一成分增高发 展到足以影响IC总体水平情况下，才能被试验检出。,二、CIC检测方法评价及应用,检测方法评价：,肾脏疾病：急性肾小球肾炎、移植肾、IgA肾病；消化系统疾病：慢活肝炎、原发性胆淤性肝硬化；皮肤病：荨麻疹、天疱疮、皮疹性皮炎；型超敏反应性疾病：SLE、RA、硬皮症、自身 免疫性溶血性贫血等。此外，CIC的检测对于肿瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神经肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病的诊断。,二、CIC检测方法评价及应用,临床应用：,固定或沉积于病变局部组织中的IC测定常用免疫组化技术，如荧光免疫组化技术检测到组织标本有Ig和补体。受累组织的成分、构型和特定的部位可为疾病的严重程度和预后提供依据。,三、沉积于组织中IC 的测定,第四节 抗球蛋白试验（Coombs试验）,类型,不完全抗体：抗体分子较短小，只能与颗粒抗原一方相结合，不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。,抗人球蛋白试验（antiglobulin test, AGT）：将人球蛋白注入异种动物，诱导动物产生抗人球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS)，AGS加入表面结合有不完全抗体的红细胞复合物中，就能出现可见的凝集现象。,作用：检测红细胞表面结合的不完全抗体。临床意义：新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊断。,RBC为Rh+,7S的IgG,体内发生,+,抗IgG,体外