《蛋白质印迹》PPT课件

Westernblot实验技术,概论,印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法(southernblot)。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析。Northernblot:对RNA的印迹分析Westernblot:对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析Easternblot:对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,概论,Westernblot：把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗体反应进行特异性检测的过程。是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）的靶蛋白。,Westernblot是检测蛋白质混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作为确定目的蛋白在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法,Westernblot测定的不是蛋白的绝对含量，只是目的蛋白的相对含量：目的蛋白的存在与否特定实验条件下目的蛋白表达量的变化多种因素影响信号的强弱受，一般仅作为半定量指标不同目的蛋白由于所用检测的抗体不同，其含量不具有可比性,WesternBlot一般流程,蛋白样品的制备SDS-PAGE电泳转膜鉴定膜上特定蛋白,封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,Westernblotting,Isolation,Identification,1.蛋白样品提取：总体原则1）提取时尽可能只集中于提取目的蛋白。通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品2）保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子通过加入核酸酶或采取不同提取策略5）样品分装，长期于-80中保存，避免反复冻融。,一、蛋白质的样品制备,通过稀释使不同样品具有相同浓度，必要时需要对蛋白进行浓缩。常用的蛋白浓度测定方法包括：Bradford法，Lowry法，BCA法,2.蛋白质浓度测定,SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的空间结构，而电泳系统中存在的强还原剂（DTT或-巯基乙醇）能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的棒状结构的SDS-蛋白质复合物，降低或消除了不同蛋白质分子间天然的电荷和分子形状的差异，蛋白质在电泳时的迁移速度仅取决于其分子大小。,二.SDS-PAGE电泳,当SDS单体浓度1mm时，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/g蛋白质)，形成蛋白质SDS复合物,当分子量在15200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW:分子量X:迁移率k、b:常数,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关,SDSPAGE电泳,消除了原携带电荷的差别，迁移仅与分子量有关,除了电荷作用，同时具有分子筛作用,丙烯酰胺(Arc)和N,N-亚甲双丙烯酰胺(Bis)SDS配胶的Tris缓冲液TEMEDAP(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,以温热(利于溶解)的去离子水配制含有29%(w/v)Arc和1%(w/v)Bis储存液,储于棕色瓶，4避光保存。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。,催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。,Mini系列是8.6x6.8cm,Bio-RedMini电泳装置,SDSPAGE电泳分离只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。不同分子量范围的蛋白质应选用不同浓度的凝胶浓度。浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白分子均随着缓冲液流向前推进而不能得以很好地分离。,凝胶浓度的选择,PAGE胶的孔径随“BisArc”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“BisArc”为1：29配制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3%的蛋白质。,凝胶浓度与蛋白分离范围,对于具有不同迁移率的多组分样品，很难选择一种浓度的凝胶来分离，此时最好使用梯度胶。,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用。最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。,分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质,适于分离小分子蛋白质（10KD）,电泳缓冲系统,蛋白分子量标准(marker),未染色marker是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，以方便辨认,宽分子量蛋白标准高分子量蛋白标准低分子量蛋白标准,预染蛋白分子量标准预染蛋白分子量是纯化好的蛋白混合物，与染料共价耦联。优点：及时监测电泳情况和估计迁移率直接观察蛋白转膜效率可以在膜上标记蛋白分子量缺点：预染Marker与染料共价耦联，电泳时迁移特性可能会发生改变，不适合精确定位蛋白,通常预染marker的条带和目标蛋白不完全一样，只是参考大小，在不需要区分大小相近的条带时，预染Marker很方便实用。,预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染,注意：由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的marker上样量相对较少，但要在电泳过程中看到预染Marker，常需要比说明书里多加一些Marker。,优点：1.包装方便携带和使用常温储存在48孔板中，使用不需解冻，只需用枪头刺穿外层薄片，将枪头中的10ul去离子水注入Marker干粉中吸起来就可使用2.独立包装可以防止污染3.分子量范围较广，从18.5kD到215kD（4-20%SDS-PAGE）4.凝胶上和转移膜上各条带分布水平和显色水平一致5.可用于染色（考马斯亮蓝染色和银染）。,BlueRangerPrestainedProteinMWMMix（Pierce产品）：110元次,单色预染的极品,内参照（Loadingcontrols）,电泳步骤,1.试剂准备需要注意的事项：Arc和Bis的有效性AP的有效性2.玻璃板的准备制胶架注意渗漏3.配胶和灌胶积层胶和分离胶梳子及其选择凝胶浓度的选择：根据目的蛋白的分子量要考虑的因素：温度需要注意的事项：过硫酸胺最后加气泡,分离胶不要灌得太满。gel通常在0.5-1h内凝集最好。混合搅拌速度要适当，太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形；太慢不均匀。,注意事项,4.样品准备和点样样品按1:1加入2xSDS加样缓冲液，煮沸3-5min。注意水蒸气的小问题分子量标准内参阳性对照5.电泳积层胶：低电压分离胶：高电压注意电泳时间，当溴酚蓝指示到凝胶尽头时停止。注意正负极,影响电泳效果的因素：1.电压低电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮。2.胶的均匀度胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。,条带呈笑脸状,凝胶冷却不均匀，中间冷却不好,条带呈皱眉状,可能凝胶和玻璃挡板底部有气泡，两边聚合不完全,拖尾,样品溶解不好,纹理（纵向条纹）,样品中含有不溶性颗粒,条带偏斜,电极不平衡或者加样位置偏斜,条带两边扩散,加样量过多,电泳中出现的现象及原因,电泳结果检查：考马斯亮蓝染色：使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染：操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。以上两种染色方法染料与蛋白不可逆结合，干扰后面的WesternBlot实验，可选择同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,三、蛋白质转移(转膜),转膜方法,选择原则：a.膜与目的蛋白的结合能力（单位面积的膜结合蛋白的载量）以及膜的孔径（拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.根据不同目的来挑选不同的转移膜，如要做蛋白测序或者质谱分析。,转印膜,常用的固定化膜：NC膜（硝酸纤维素膜）和PVDF膜。,1.蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80100ug/cm2)。2.适用于各种显色方法，同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色；3.背景低，信噪比高。4.转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。Schleicher&Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4条件下保存5年依然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的WesternBlot结果。,优点,硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜),纯的硝纤膜较脆，易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途,缺点,注意,1.硝纤膜孔径选择：20KD蛋白：选择0.45um孔径的膜，20KD蛋白：选择0.2um的，7KD蛋白：选择0.1um的膜。2.选择纯的NC膜（混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会降低）。3.选择合适的去垢剂：NC膜上结合的蛋白会因为某些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%,常见生产公司：Schleicher&SchullMilliporePALL罗氏InvitrogenGE（Amersham）SantaCruz,均有NC产品,Schleicher&Schull是第一个提供硝纤膜的厂家，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：ProtranNC膜OptitranNC膜,Protran特点：100%PureNC，蛋白结合能力强低背景、多孔径选择（0.45,0.2,0.1um）保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年）纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需小心操作,Schleicher&Schull”“王牌“产品纯NC膜,Optitran：在超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，外表和纯NC膜完全一样，保持了NC膜各种优点，内部多了中性支持物，其柔韧度和机械耐受力高于NC膜，不容易卷曲，特别适于重复标记和洗脱的实验。蛋白结合力不如纯NC膜结合能力强(75-90g/cm2)。,Schleicher&Schull的强化NC膜,PVDF膜-做WB的“杀手锏,PVDF:聚偏二氟乙烯膜,作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。PVDF膜的蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性都强于NC膜。PVDF膜结合量是100-200g/cm2，而结合强度PVDF比NC膜高6倍！,PVDF膜特点：1.更好的机械强度和化学耐受性。2.适用多种检测方法：化学发光、常规显色、同位素和标准染色都可以，但不适合荧光。3.膜孔径有0.45um和0.2um，后者对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。,PVDF膜需要100%甲醇预处理（不超过15秒）,MiliporePVDF:20*20cm(2400元/10张)BioRedNC膜：30cm*3.5m（2200元/卷）,活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，,Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为：Immobile-P（0.45um）：孔径均一，蛋白吸附力强，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高。Immobilon-PSQ(0.2um)：是印迹小分子蛋白质（20KDa）的理想选择优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。Immobilon-FL(用于荧光显色)第一个专门为荧光显色优化的转移膜。BlottingSandwichesforHighTroughput四种。这几种膜最大特点快。按照Millipore的操作手册，Immobilon可以在保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时主要是缩短封闭和洗脱时间。,尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dotblot优点（相对NC膜）1.结合力强，2.机械强度大，结实，柔软且不易卷曲，便于操作缺点：1.背景高由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出2.当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。3.无适合尼龙膜上的直接染色方法。目前WB实验多不选择尼龙膜。,尼龙膜,转移缓冲液,缓冲液的组成对蛋白与膜和探针的结合起着决定的作用。,为了得到最有效的转移，不但必须有足够的时间，缓冲液的pH和离子强度还必须使蛋白质有最大的可溶性和转移速度。目前通常使用Tris-甘氨酸缓冲液。若转膜后有样品要测序，最好用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。,TransferBuffer:48mMTrisbase5.81g39mMGlycine2.93g0.037%SDS0.375g20%MeOH200mltotal1000ml,Notes,1.全程手套操作，避免手印污染也保护自己2.做好标记，以免转摸后分不清条带泳动方向及加样孔顺序。3.对于特别小的蛋白，tricine(两性离子缓冲剂)SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD20KD间的分辨率。4.转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。5.让电转液从下通过膜以赶走膜内空气，膜需要彻底浸润否则影响转膜效果。6.膜不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色,可以用丽春红S染色.,可逆染液：ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等染色后，染液可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析不可逆染液：考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。,转膜后检测,免疫学基础,抗原抗体反应抗体起到探针的作用，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。,四、免疫检测,同位素标记生物素标记地高辛标记酶标记,酶标底物：生色底物化学发光法底物荧光底物,抗体标记方法,酶标记法安全且快速，已经成为WesternBlot的主流检测方法。,酶促反应的底物不同显色方法不同：化学发光Chemiluminescent：灵敏度很高，灵敏度已经达到pg级别，甚至还有Femto级别的，灵敏度超过了同位素底物显色Colormetirc/Chromogen：直接显色而操作简便且成本低。主要有：辣根过氧化物酶HRP（HorseradishPeroxidase)碱性磷酸酶AP（AlkalinePhosphatase）葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase）-半乳糖苷酶（-Galactosidase）,少见,常见,酶标记法,生色底物检测,HRP的显色底物有：DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride,33二氨基联苯胺)4-CN(4-Chloro-1-naphthol,4-氯-1-萘酚)CN/DABAEC(3-amino-9-ethylcarbazole,3-氨基-乙基咔唑)，TMB(3.3,5,5-Tetramethylbenzidine,3.3,5,5-四甲基联苯胺),辣根过氧化物酶（HRP）,底物显色是利用底物在HRP和H2O2存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。,ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB稍差,信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但由于灵敏度高而易引起高背景，以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数,DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家推出DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。,AP碱性磷酸酶,碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法AP可将无色的底物BICP（5溴4氯吲哚磷酸盐）转化为蓝紫色产物,AP很早就被用于检测系统包括WB检测和核酸检测。优点：灵敏度高底物更稳定（试剂盒保存时间长）缺点：显色背景偏高（脱脂奶粉和BSA中富含AP）。分子克隆III推荐的适用AP封闭剂是：6%的酪蛋白1%聚乙烯吡咯烷酮10mmolEDTA,AP显色底物,AP显色的灵敏度就可以达到低pg级，但封闭要做得好,BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，最常用到,化学发光检测,化学发光法是目前使用最为广泛，安全好且灵敏度极高的WB检测方法。该方法在酶和底物都存在时才发光，不同于生色反应形成不溶的产物累积于膜上，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检经常使用的显色交联酶：HRP和AP抗体浓度过高造成高背景所以抗体用量的稀释倍数要大,HRP化学发光底物,经典底物：Luminol,辣根过氧化物酶-ECL法:利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质（鲁米诺）,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,在化学增强剂存在的情况下，光强度可增强1000倍。利用X线胶片感光原理,将结果记录下来,GEHealthcare公司的ECL新产品,AP在催化脱磷底物方法时转换数高,可快速产生强信号,获得极高灵敏度的WB结果。WesternBreeze化学发光法检测试剂盒（Invitrogen公司产品）（1）检测灵敏度达到Femto水平（2）发光持续时间长达5天。（3）兼容成像系统，（4）优化后背景极低，Lumi-PhosWb化学发光法检测试剂盒（Pierce公司产品）（1）灵敏度可以达到低pg级12pg（2）检测方法适用的膜还包括尼龙膜这是许多化学发光底物所不兼容的（3）发光持续时间是8个小时（2小时内光最强）,AP化学发光,免疫检测步骤,1.封闭5%脱脂奶粉（溶于TBS缓冲液）目的：封闭膜上未结合蛋白的位点,Note：脱脂奶是最常用的经济配方，但其可能有痕量的生物素和AP，可造成背景污染而不适合生物素亲和素的检测方法采用AP检测系统,脱脂奶不适合用做封闭液。若用HRP检测系统则封闭液不要加NaN3，它对HRP有灭活作用，选用AP作为显色方法，封闭时要选择Tris缓冲体系，不要用PBS封闭时间和封闭剂的量都要足够。,2.一抗温育5%脱脂奶粉+适量一抗平缓摇动温度时间目的：一抗和目的蛋白结合3.洗膜用含TWEEN-20的TBS缓冲液洗少量多次目的：洗去未与目的蛋白结合的一抗,4.二抗温育5%脱脂奶粉+适量二抗平缓摇动温度时间目的：二抗和已与目的蛋白结合的一抗结合起放大作用5.洗膜用含TWEEN-20的TBS缓冲液洗少量多次目的：洗去未与一抗结合的二抗,6.检测：,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP),8.灰度分析灰度分析软件MetaMorphoffline分析软件；PhoretixD6.01，PDQuest7.3.1目的：得到目的蛋白质的相对含量,WesternBlot常见问题分析,实验中可能出现的问题,1.没有注明可以用来做westernblot的一抗，可以用来做westernblot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于westernblot，因为在westernblot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。,2.westernblot时为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?可能一抗