测序技术介绍PPT课件

，测序技术简介，2，测序技术发展史，第三代测序，1954年，Whitfeld等多聚核糖核苷酸序列用化学分解法测定，是有关DNA排序技术的早期报告。桑格1977年DNA脱氧核苷酸末端测序(chainterminatorsequencing)，A.M.Maxam和W.Gilbert在DNA化学分解测序(chemicaldegradationsequencing)，4、Sanger测序的原理，每个DNA测序反应由4个单独的反应组成；在DNA双链中，核苷酸由3-5-磷酸通过酯键连接，因此在测序过程中添加2 ，3-脱氧核糖苷-ddNTP (3-OH除外)，ddNTP在DNA双链延长端时无羟基如果终止站点混合了ddATP，则新链端点为a；如果混合了ddTTP、ddCTP和ddGTP，则新链端点为t、c或g。、9等排序技术将模板、引物、4种dNTP(含有放射性同位素标记的核苷酸)与DNA聚合酶绝热制成的混合物，包含了很多长度不同的片段，最终分离出这种混合物，得到放射性同位素自显影带(SDS-PAGE)，人们根据凝胶电泳图，得到DNA双重、自动测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PEABI制作了373英寸、377英寸、310英寸、3700英寸、3100英寸等DNA测序仪，其中310英寸是临床试验实验室最常用的型号之一。14，分析测序过程中常见的问题，在DNA测序过程中，引物的10-30碱基不一定能完整读取。由于DNA结构的原因，有时会发生反应不能在途中进行的情况。示例：G/Crich；G/c群集；波莉亚，波莉蒂的连续结构等。另一种情况是反应中间出现的皮层现象，通常是DNA结构的重复序列，使测序引物和模板之间有两个以上的结合部位。具体问题分析如下。1:测序结果有很多峰。n值原因分析也出现很多。PCR产品直接排序，PCR产品长度后没有反应信号，机器会产生很多n值。序列的开头出现n值，这主要是由于未去除的染料单体引起的干扰峰，机器无法正确读取输出值的情况。如果损失了引物二聚体或起始端的一小块，也会出现n值。模板本身包含混合序列，具有等位基因。15，分析排序过程中常见的问题，2:为什么找不到我的PCR引物序列？以PCR引物作为排序引物测量的序列始于引物3结束后的第一个碱基，因此找不到排序引物。通过进行反向排序，可以得到引物的反向互补序列。您还可以将正在测试的碎片复制到相应的托架中。通用引物与插入序列相距一定距离，因此可以测量引物序列。3:为什么测序结果和文献不同？原因很多，动物、种族、个体之间的基因序列不一定相同。如果是PCR产品的复制排序，PCR过程中也有不一致的因素。我们提供的排序结果是客户样本序列的忠实结果，不能保证与文献序列完全一致。4:为什么太短的PCR产品不适合直接排序？首先，一般PCR产品精制套件不能精制太短的PCR产品，因为产品片段必须大于200bp。更何况，排序的前50bp和后50bp的序列不好，不适合直接排序。16，分析测序过程中经常出现的问题，5:如果酒精不挥发，在约300bp时会发生连续异常g峰，酒精挥发时间长会导致DNA断裂。第一峰值，重叠干涉。如果不通过扰动最高峰进行解读，样本不纯，基因组DNA的话，该部位可能会出现SNP现象(T/G)，这一事实很好地说明了。如果读数是方解棒，我们可以把样品在这里的基本情况判定为t。第二峰值，电位干扰。如果不解释为干涉峰，则样本可能比预期的多一个基(g)，如果解释为干涉峰，则只需确认此处的基本t为行。17，分析排序过程中常见的问题，6:在用PCR产品或质粒进行排序时，为什么经常发生循环现象？下图是pGEM-T向量排序的结果，在83个部位出现了排序结果bimodal，虽然模板包含两个或更多相同的向量，但插入片段不同。解决方案：重新选择单个克隆或重新提取质粒。需要注意的是，PCR反应或酶鉴定的重新发现只是其克隆只包含插入片段的证据，不足以证明模板的统一性。据分析，7: poly结构的排序结果poly在polyA/T结构后经常发生代码迁移现象，而poly/c后经常发生排序信号的衰退。解决方法：使用逆向引物对模板进行排序，并测量poly结构，就可以完成模板的全长剥离。19，第二代排序技术，20，各自的优点，从454测序平台上获得的片段达到400bp，可以读取长质量；如果数据量相同，Solexa排序平台仅是454排序平台的1/10。SOLiD排序平台的准确度达99.94%，片段覆盖度为15时，排序准确度可能接近100%。21，2005年末，454公司推出了基于巧克力测序原理的第一个高质量基因组测序系统GenomeSequencer20System。这是核酸测序技术发展史上的里程碑。之后，Roy以1.55亿美元收购了454家公司，在2006年的10个小时内获得了100万个读取长度(reads)、4亿到6亿个基本信息(basepair)，并引入了准确度超过99%的更新GSFLX排序系统。2008年，GSFLX系统再次升级，通量增加了5倍，读取长度和准确度也增加了。虽然454GS排序平台可能不是市场份额最高的排序，但截至2011年3月，利用该系统的研究论文发表了1000多篇，在阅读方面比其他两个系统更出色，从一开始就在排序(denovo)和宏基因组排序(metagenome)方面显示出了不可替代的位置。22，2006年Solexa也正式提供了其NGS系统GenomeAnalyzer。基于DNA群集(DNAcluster)、网桥PCR(BridgePCR)和可逆阻塞等核心技术的系统具有高吞吐量、低错误率、低成本和大范围复盖等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的价格收购了Solexa，将GA商品化。GA的最早版本还意味着1GbAnalyzer，因为它一次可以获取1Gb的数据，最新的Hiseq2000平台在10天内可以获取300Gb以上的数据，读取的默认长度约为150bp。有人消息说，Illumina完成了600Gb的生产测试，在一些客户中进行了前期体验，还将在年内进行Tb(1000Gb)级测试Run。据不完全统计，Illumina销售了600多个ga/gaix和Hiseq2000平台，2010年仅深圳化工大学基因研究所一家就购买了128台Hiseq2000，跃升为世界最大的基因组测序和分析中心，Illumina在测序领域发挥了影响力。23，在Sanger排序时代，美国应用生物系统(ABI)是该行业的领导者，其垄断权从任何人都不能动摇的早期377到完全自动化的3730 XL，ABI的排序器广泛应用于基因组学研究的各个方面。但是在第二代测序技术快速发展的初期，ABI开始得晚了一点。在2005年454家公司推出GS平台之前，ABI的领导受到威胁，迅速收购了开发NGS的小公司Agencourt，并在2007年推出了SOLiD sequencing platform。从此以后，SOLiD继续升级，并达到了当前的SOLiD5版本(SOLiD5500 XL)。SOLiD的全称是sequencgbyoligoligationdetection，即低聚体连接检测排序，其基本原理是通过标有荧光的8碱单链DNA探针与模板配对，发送不同的荧光信号以读取目标序列的默认排序顺序。在此方法中，目标序列中的所有碱基读取两次，因此SOLiD的最大优点是高精度。据悉，SOLiD5平台的排序通量为30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确度达99.99%。此外，SOLiD系统使用DNA合成和排序，而不是PCR反应，因此GC对高采样具有很大的优势。2020/6/8，24，454排序原理，phi排序原理，2020/6/8。25，454排序原理，pie排序原理，2020/6/8。26，454排序的原理，phi排序的原理，2020/6/8。在27，454测序原理，454测序器中，a，t，g，c的4个碱基分别存储在单独的试瓶中，在每个阶段，4个碱基对依次放入反应器，碱基对结合的时候，释放1个馅饼，这个包裹垫片被酶氧化成荧光神，释放成光信号，读取这个位置的碱基信息。454测序仪的整个实验阶段可以大大总结。样品处理库制造emPCR反应板，进行机器排序，2020/6/8。28，454测序原理，样品处理：样品处理主要以基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等大片段的DNA分子为对象，用超声波或氮中断切割，然后用琼脂糖凝胶电泳回收或纯化，选择500-800bp的DNA片段。非编码RNA或PCR产品不需要此步骤。2020/6/8，29，454排序原理，库准备包括连接器连接和磁珠精炼两个阶段，454的库连接器由a、b、每个44bp、20bp的PCR引物、20bp的排序引物、4bp(TCAG)的“键”碱基组成。磁珠连接和DNA变性后，只有a目的片段b形式的连接物被浓缩，其他两种形态(AA，BB)的产物被去除。2020/6/8，30，454排序原理，emPCR(乳液PCR)是454排序的关键阶段，将富集的库与排序磁珠、各反应物混合，添加特定矿物油和表面活性剂，利用振荡器进行剧烈振动，使反应系统成为油水捕收(water-in-oil)在理想条件下，每一滴或微反应器将只包含一个磁珠和一个单链DNA，通过控制此阶段的条件，可以在1mL乳液中形成至少10的6次方的理想微反应器。PCR扩增后，将在每个磁珠上形成高密度的DNA簇，这些DNA序列完全相同，可以用于下一步。接着乳液混合物碎了，扩增的片段还结合在自己的珠子上。2020/6/8，31，454排序原理，454排序反应板称为PicoTiterPlate(PTP)，由350万个小孔的光纤组成的每个孔的直径为29m，排序磁珠的直径为20m，因此每个孔只能容纳一个磁珠。将磁珠和排序试剂添加到PTP中，使其可用于机器排序。2020/6/8，32，454排序原理，排序阶段如上所述，4个碱基在泵控制下依次放入反应板，反应结束后，每次一个或多个碱基展开时，就会释放光信号，记录信号的有无和强度，从而测量DNA序列。2020/6/8，33，2020/6/8，34，454排序原理，优缺点：454排序准确度高，超过400bp的读取以上，其准确度仍可达到99%以上；主要错误发生在相同聚合物(例如attg)的连续扩展中，但是a和g的读取没有问题，但是由于t仅记录一次光信号，并且只有信号强度不同于ATG序列中的t，因此同聚体越长，可能发生的错误就越多。目前，454测序器在阅读方面有明显的优势，因此广泛应用于大基因组的首次测序(denovo)、转录组分析、基因组结构分析等领域。2020/6/8，35，Solexa排序，2020/6/8，36，Solexa排序，常用术语：SBS:边缘合成边缘排序反应，每个SBS扩展一个碱基。大约需要70分钟。Run:单个机器排序反应可以生成4G-75G排序通量。通路：单个通路，每个通路可以直接在物理上区分排序样本，一次运行最多可以同时拥有8个通路。Channel:通路的同义词。Tile:每个Lane有两个tile列，共120个社区。每个小区都分布着很多簇合部位。Cluster:群集，Solexa排序技术使用桥接PCR方法创建DNA群集，从而允许每个DNA群集生成CCD可以区分的荧光点。2020/6/8，37，Solexa排序，Index:标签，Solexa多排序(MultiplexedSequencing)过程中使用Index分隔样本，完成常规排序后在Index部分执行7个附加循环排序，Index标识Barcode:Index同义词Fasta:序列存储格式。如果序列文件以FASTA格式保存，则每个序列的第一行以“开头”遵循序列的ID号(唯一标识符)和有关该序列的说明信息。第二行的内容是序列，如果序列短于61nt，则会排成一行。如果序列长度大于61nt，则每行存储61nt，最后小于61nt的保留下来，并与最后一行对齐。第二个序列从另一行开始，以“”和序列的ID号开始，以此类推。2020/6/8，38，Solexa排序，Fastq:Fastq是反映排序序列基本质量的Solexa排序技术。第一行以“”符号开头，后跟一个序列的说明