芍药苷诱导子宫颈癌hela细胞凋亡的相关研究（可编辑）

芍药苷诱导子宫颈癌HELA细胞凋亡的相关研究中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名牟辑日期中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名必函指导教师签名丕红垒乏么愀删目录一、摘要中文论著摘要1。英文论著摘要3二、英文缩略语5三、论文前言”“6刖吾”“材料与方法7实验结果LO讨论”13结论“15四、本研究创新性的自我评价16五、参考文献17六、附录综述“19在学期间科研成绩28致谢29个人简介30中文论著摘要芍药苷诱导子宫颈癌HELA细胞凋亡的相关研究目的宫颈癌是全球妇女中最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。据国际癌症研的宫颈癌发生在发展中国家。近年来宫颈癌发病逐渐出现年轻化趋势，腺癌比例也有所上升。随着宫颈癌发病年轻化及患者对治疗后生活质量要求的提高，化疗已由晚期姑息治疗转为有效的综合治疗。因此寻找高效低毒药物是提高化疗成功率和患者生存率、改善患者生活质量的关键。天然中草药因其低毒高效特点已经成为国内外抗癌药物研发的热点，芍药苷是一种天然单萜类糖苷化合物，是传统中药赤芍的主要有效成分，具有抗炎、神经保护、镇痛、调节免疫等多种生物学效应，新近药理研究表明芍药苷具有潜在的抗肿瘤作用。然而其有无抗宫颈肿瘤效应及其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养人宫颈癌HELA细胞，观察芍药苷对HELA细胞增殖和凋亡作用的影响，为临床应用芍药苷治疗宫颈癌提供实验依据。实验材料及方法不同浓度芍药苷作用于人宫颈癌HELA细胞后，采用MTT法检测不同时间HELA细胞的生长抑制效应，计算出药物的半量抑制浓度IC50，据此确定芍药苷适当浓度用于细胞凋亡及凋亡相关调控基因实验。膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素FITC碘化丙啶PI双染色流式细胞术检测HELA细胞凋亡率及细胞周期变化，透射电镜及CASPASE3表达的变化。结果不同浓度的芍药苷作用不同时间后，对子宫颈癌HELA细胞的生长抑制率呈明显的浓度一时间依赖关系，在24、48、72应用不同浓度芍药苷后HELA细胞凋亡率逐渐增高，对照组及1000、2000PGML组凋亡率分别为094、1094、1395，细胞周期S期比例呈增多趋势；芍药苷作用48H后透射电镜下可见HELA细胞出现典型凋亡改变；芍药苷作用于HELA细胞48H后，与对照组相比BCL2表达减少、BAX及CASPASE一3表达增多。日结论己芍药苷能够诱导子宫颈癌HELA细胞凋亡，其作用机制可能与抗凋亡基因BCL一2表达减弱及促凋亡基因BAX、CASPASE一3表达增强有关。关键词宫颈肿瘤；HELA细胞；芍药属；细胞凋亡2英文论著摘要RELEVANTONOFCERVICALCANCERHELASTUDYAPOPTOSISCELLSINDUCEDPAEONIFLORINBYECFIVESOBJCERVICALCANCERISONEOFTHECOMMONTUMORTHEWOMENINTHEMALIGNANTAMONGISBREASTWORLD，WHICHCANCERTHEINTERNATIONALCENTERFORRESEARCHPRECEDEDBYONLYONCANCERESTIMATESTHATTHEREARE493000NEWCAESAND274000INDEATHSWORLDWIDE83OFTHECERVICALCANCERIN2002，WITHCOUNTRIESINRECENTDEVELOPINGYEARS，CERVICALCANCERTRENDANDCERVICALADENOCARCINOMAALSOAPPEARSYOUNGERGRADUALLYPROPORTIONRISESASTHISTRENDANDOFLIFEAFTERIMPROVEMENTQUALITYREQUIREMENTSTREATMENT，THEHASTURNEDFROMCARETOEFFECTIVETREATMENTSOCHEMOTHERAPYPALLIATIVECOMPREHENSIVEITTHETOFINDISANDLOWERTOTHESUCCESSKEYDRUGS研MMGHACTIVITYTOXICITYIMPROVERATEOFSURVIVALRATEANDLIFEOFCHEMOTHERAPY,THEQUALITYPATIENTSINRECENTHASATTENTIONBEENFOCUSEDONTHEYEARS，CONCENTRATEDFINDINGCANCERACTIVEORFROMNATURALBIOLOGICALLYCHEMOPREVENTIVETHERAPEUTICAGENTSRESOURCESPAEONIFLORIN,AMONOTERPENETHEBIOACTIVEGLUCOSIDE，ISPRINCIPALCOMPONENTINTHEROOTWHICHINISUSEDTRADITIONALCHINESEINPAEONYWIDELYMEDICINE，OFTENCOMBINATIONWITHOTHERHERBSPFHASTOBEENNUMEROUSREPORTEDPOSSESSEFFECTSASSUCHPHARMACOLOGICALIMMUNOREGULATION,COGNITIVEIMPAIRMENTAMELIORATING,ANDNUMBEROFSTUDIESHAVESHOWNTHATPFEXERTSRECENTLY,ANINCREASINGPRECLINICALANTITUMORANUMBEROFROLEOFPFINACTIVITYAGAINSTMALIGNANCIESHOWEVER,THECERVICALCANCERHASREMAINEDOBSCURETHISFOCUSEDONTHEEFFECTSOFSTUDYEXAMININGPFTREATMENTONCERVICALCANCERINVITROTOBASISFORFUTURECLINICALPROVIDEEXPERIMENTALAPPLICATIONMATERIALSANDMETHODSHELACELLSTREATED、，ITLLATDIFFERENTCONCENTRATIONSFORDIFFERENTHOURSPAEONIFLORINWEREASSESSEDTHEIC50WASCALCULATEDANDBYMETHYLTHIAZOLYLTETRAZOLIUMMMTHENCONCENTRATIONFOROFCELLANDPROPEREXPERIMENTSAPOPTOSISAPOPTOSISREGULATIONGENES3WASDETERMINEDCELLRATEANDWASDETECTEDFLOWAPOPTOSISCYCLECHANGEBYCYTOMETRY谢THANNEXINVFLUORESCEINISOTHIOCVANATEFITCPROPIDIUMIODIDEPITHETRANSMISSIONELECTRONOFHELACELLSWASOBSERVEDINORPHOLO西CALCHANGEBYOFANDINHELACELLSINDUCEDBCL2，BAXMICROSCOPETEMTHEEXPRESSIONCASPASE一3WASDETECTEDIMMUNOCYTOCHEMICALBYPAEONIFLORINBYRESULTSWITHFORAFTERTREATMENTDIFFERENTCONCENTRATIONSOFDIFFERENTPAEONIFLORINHOURS，THEOFHELACELLSWASINHIBITEDINADOSEANDMANNERWITHPROLIFERATIONTIMEDEPENDENTANIC50VALUEOFATAND72HOURS24，485054，2965，2459“GMLRESPECTIVELYTREATEDDIFFERENTCONCENTRATIONSOFRESPECTIVELYPO05AFTERBY000AND2000WASINDUCEDATARATEOF094ANDGROUP，1PEGNA，APOPTOSIS094，11EFFECTSWERETHEOFDOSEDEPENDENT俨005ANDPROPORTION395RESPECTIVELYSUCHCELLSINWASUNDERAOFHELACELLSHELASAPOPTOTICCHANGESPHASERISINGTRENDTYPICALTOWEREOBSERVEDUNDERTEMTHEREWASALOWEREDOFEXPOSUREPAEONIFLORINEXPRESSIONBCL一2ANDANELEVATEDOFBAXANDVERSUSTHECONTROLEXPRESSIONCASPASE3GENESGROUPAFTERA48一HOURPAEONIFLORINTREATMENT妒005CONCLUSIONSHELAAPAEONIFLORINCALLINDUCETHEOFCELLSSIGNIFICANTLYAPOPTOSISTHROUGHOFBCL2ANDALLOFDOWNREGULATIONANTIAPOPTOTICGENEUPREGULATIONPROAPOPTOTICBAXANDGENESCASPASE3WORDSKEYCERVIXCELLS；PAEONIA；CELLNEOPLASMS；HELAAPOPTOSIS4ODOPTICALDENSITY光密度值DABDIAMINOBENZIDINE二氨基联苯胺BCL2BCELLB细胞淋巴瘤白血病因子2LYMPHOMALEUKEMIA2ASSACIATEDXBAXBCL2PROTEINBCL2相关X蛋白CASPASE3CASPASE一3半胱天冬酶3HEI，AHELACELLS人宫颈腺癌细胞株5论文芍药苷诱导子宫颈癌HELA细胞凋亡的相关研究刖看子宫颈癌是全球妇女中最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。据国际癌症的子宫颈癌发生在发展中国家，占发展中国家女性肿瘤的15121。由于我国近年来开展了宫颈癌筛查工作，其大病率和死亡率都有所下降。尽管如此现在每年我国仍有新发病例10万左右，约占全世界子宫颈癌新发病例的15。而且近年来宫颈癌发病逐渐出现年轻化趋势，腺癌比例也有所上升。目前以铂类为基础的宫颈癌一线化疗药物疗效确切，但存在肾毒性、骨髓抑制和胃肠道反应等严重毒副作用，不仅对人体机能造成损伤，严重者甚至会导致死亡，影响着宫颈癌综合治疗的总体效果。因此寻找高效低毒药物是提高化疗成功率和患者生存率、改善患者生活质量的关键。天然萜类化合物按结构可分为倍半萜、单萜、二萜、三萜几类，是目前研究较多的的一类抗肿瘤中药成份，其中单萜类化合物研究相对较少。芍药苷是1963年首次从芍药根中分离出来的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，又名芍药甙。近年来，国内外学者对芍药苷展开了较为深入的研究，发现芍药苷具有抗炎【3，41、神经保护【51、镇痛61、调节免疫【刀等多种生物学效应，并且毒副作用较小。新近的药理研究表明芍药苷具有抗肿瘤等作用。近年来的研究表明芍药苷可抑制胃癌【引、肝癌【9】、非小细胞肺癌【10L、白血病【11】等肿瘤细胞生长，作为种潜在的抗肿瘤药物，其相关研究颇受关注。目前天然中草药治疗宫颈癌已有相关研究【12,13，芍药苷作为传统中药赤芍中的种主要成分，曾被用于治疗盆腔炎，宫颈炎等，其在宫颈癌上有无抗肿瘤效应及其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养人宫颈癌HELA细胞，观察芍药苷对HELA细胞增殖和凋亡作用的影响，并初步探讨其可能机制，为临床应用芍药苷治疗宫颈癌提供实验依据。6实验材料与方法一、实验材料一细胞株人子宫颈癌HELA细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。二主要试剂公司；膜联蛋白V一异硫氰酸荧光素FITC碘化丙啶PI双染色试剂盒北京SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒北京中杉金桥公司；氨苄青霉素、链霉素华美生物工程有限公司；氯化钠、碳酸氢钠上海宏光化工厂；苏木素、伊红、甲醛、中性树脂上海试剂一厂。三主要仪器96孔培养板、6孔培养板、培养瓶COMING有限公司；垂直单向流洁净工作台青岛海尔特种电冰柜有限公司型号HRLDZD；解剖显微镜、倒置显微镜日E800，日本NIKON公司；二氧化ECLIPSE本OLYMPUS公司；摄影显微镜NIKON碳培养箱美国FISHER厂；高压灭菌器LDZX40BI，上海申安医疗器械厂；电热恒温鼓风干燥箱1013BSII，上海跃进医疗器械厂；自动酶标读数仪WELLSCANMK3，芬兰ALIBUR，美国BD公司；透射电镜LABSYSTEMSDRAGON；流式细胞仪FACSCJEM1200EX，日本厄OL公司。四主要试剂配制L、芍药苷配制ML1将20DMEM中，充分振荡将药物溶解配成20MG芍药苷粉末溶解于1MGML储存液。72022LXRN的微孔滤膜过滤除菌，EP管中20保存，使用时以DMEM稀释至所需浓度。MMOLL2、O02PBS配制NACI8002144G，KCLG，KH2P0402G，NA2HP0412I120G，加二蒸水将体积ML，300调节至1000M1分装，高压灭菌后4保存。3、5MTT配制MGMLO5ML1称取MTTPBS中。G，溶于1002O22LAIN的微孔滤膜过滤除茵，1M1分装于EP管中，20避光保存。4、胰酶配制8002021胰酶缓冲液配制NACLG，KCLG，KH2P04G，NA2HP0412H2028ML，高压灭菌。G，加三蒸水10002EDTA02ML胰酶缓冲液中，充分溶解。G，胰酶25G，JJN、10003向上述溶液中加入1UML的青、链霉素共6ML，用5NAHC03调节PH值至72。4022LAIN的微孔滤膜过滤除菌，300M1分装，20保存。二、方法一细胞培养C02、饱和湿度培养箱中培养，每23天传代1次。二HELA细胞生长抑制率检测应用MTTI匕色法。取对数生长期HELA细胞，用完全培养液调整细胞密度为3000HGGML的芍药苷，同时设置空白对照组，每组3个复孔，药物作用24、48、72150H，每孔加入DMSOGL，摇床混匀后，继续培养4后，每孔加入MTT5MGM120NLIL处测定吸光度OD“L，充分溶解甲瓒结晶后，置酶联免疫检测仪上于492据抑制率确定芍药苷适当浓度用于细胞凋亡及凋亡相关调控基因的实验。8三HELA细胞凋亡率检测X应用ANNEXINVFITCPI双染色流式细胞术。6孔板内按1104ML每孔接种2MLHELA单细胞悬液，常规培养贴壁后分别加入终浓度为1000、2000PGML的芍药XRRAIN苷，设空白对照，继续培养48H后，收集L106个细胞，置15M1离心管中，1000离心5M结合缓冲MIN，弃上清液。用4“C预冷的磷酸盐缓冲液PBS洗2次，用250LATANNEXIN液重新悬浮细胞，加入5VFITC和10JTL20LAGM1的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15MIN。在反应管中加入250M的PBS，置流式细胞仪分析，经CELLQUEST软件分析处理后得出细胞凋亡率。四细胞周期检测应用流式细胞术。同ANNEXINVFITCPI双染法收集细胞，70冷乙醇固定，4O5LNL过夜。上机前取固定的细胞力NPBS洗涤，离心弃上清，加入10PGML的RNASEO5MIN，经200目尼龙置于37孵育30RAIN后，加入100ML避光孵育30PGML的PI网过滤流式细胞仪检测，CELLQUEST软件细胞周期分析。五细胞形态改变观察HELA细胞中加入终浓度为2000HPGML的芍药苷，同时设空白对照组，培养48后用025胰蛋白酶消化收集细胞，经1000RMIN离心沉淀，弃上清后，经25戊二醛、L锇酸双固定、二甲胂酸缓冲液漂洗、酒精和丙酮酸逐级脱水、EPON812环氧树脂包埋、超薄切片70NM后柠檬酸铅、醋酸铀双染色后用透射电镜观察、摄片。六BCL2、BAX及CASPASE3蛋白表达的检测X取指数生长期HELA细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为L104皿，接种于内置无菌玻片的6孔板内2H后，分3组，芍药苷终浓度分别为0、ML孑L。培养24H后，爬片1000、2000酬，对照组不加药物。以上各组平行3孔，继续培养48用PBS漂洗2遍，经4多聚甲醛固定30MIN，PBS洗涤后自然风干，20保存备用。检测方法按免疫组化试剂盒说明书进行。阳性细胞的特征为胞浆或胞核染为黄色或棕黄色，阴性细胞不着色。每张切片随意取5个400倍视野，用软件IMAGEPROPLUS6092测阳性区域的平均光密度值并取平均值。七统计学方法9采用SPSS160软件进行统计分析。所有实验均重复3次，结果以XS表示，差异统计学意义检验采用单因素方差分析和LSD检验。实验结果一、宫颈癌HELA细胞生长抑制率的变化PGM1，HELA细胞生长受到明随着芍药苷浓度增N500、1000、2000、3000显抑制，这种抑制作用呈浓度依赖性闷05；随着作用时间延长24、48、72H，HELA细胞生长抑制率也逐渐增高250、500、2000及3000GGML组，差异有统计学意义O05。但1000LAGML组HELA细胞生长抑制率未见明显的时间依赖性尸O05。PF在24、48、72一_Q棚NQ_I啊”一“一住图1，不同浓度芍药苷作用不同时间后HELA细胞的生长抑制率，与对照组比较8P005，6PO01二、HELA细胞凋亡率的变化芍药苷可促进宫颈癌HELA细胞凋亡。随着芍药苷浓度的增加，HELA细胞的凋亡率逐渐增加。芍药苷对HELA细胞凋亡率正常对照组及1000、2000TTGML组分别为094、1094、1395，呈浓度依赖关系尸005。见图2。102电至SFRRO什C图2，芍药苷作用48HY舌HELA细胞凋亡率的变化。A对照组；B1000垤M1芍药苷作用48H后HELA细胞的凋亡情况；C2000“GML芍药苷作用48H后HELA细胞的凋亡情况。三、芍药苷作用后HELA细胞周期分布改变经不同浓度芍药苷作用48H后，HELA细胞处于G1期的细胞逐渐减少，而S期细胞逐渐增多，但差异无显著的统计学意义尸O05。四、宫颈癌HELA细胞透射电镜下形态改变透射电镜下可见空白对照组的HELA细胞胞膜完整，胞核呈圆形或椭圆形，核膜清晰完整，核内染色质分布均匀；而应用芍药苷48H后，HELA细胞出现核型不规则，核膜模糊，核内异染色质边集、凝聚，核碎裂，有时可见核碎块移入胞质中，及线粒体内质网肿胀等典型凋亡改变5000倍。见图3。染色阳性信号呈棕褐色。芍药苷组BCB2表达显色较对照组明显变浅，且阳性细胞数逐渐减少；而BAX、CASPASE3芍药苷组表达显色则较对照组明显加深，呈强染色，且阳性细胞数明显增多。在每张爬片上随机选取5个高倍视野400倍，测量其平均光密度值，对照组及芍药苷浓度为1000、2000II酌融时，BCL2平均OD值042O0L，差异均有统计学意义P005，且呈剂量依赖关系。见图4。12黧舞溺鎏黧婺懋图4，不同浓度芍药苷作用于HELA细胞鸫H后凋亡相关蛋白的表达X400。AIA4对照组、1000、2000PGML芍药苷处理后HELA细胞中BCL一2蛋白的表达逐渐减弱；BI一B3对照组、1000、2000PGML芍药苷处理后HELA细胞中BAX蛋白的CASPASE3蛋白的表达逐渐增强讨论目前，细胞凋亡机制的紊乱在恶性肿瘤发生发展的过程中，已被公认发挥着非常重要的作用。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为临床上治疗恶性肿瘤的一种重要手段。实验研究表明，芍药苷可抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导其分化，促进其凋亡，如胃癌嘲、肝癌91、非小细胞肺癌【埘、白血病【1等，但是具体作用机制尚有待进一步研究。芍药苷作为传统中药赤芍中的一种主要成分，其在宫颈癌上有无抗肿瘤效应及其相关研究尚少见报道。本研究结果显示，芍药苷对宫颈癌细胞的生长有明显的抑制作用，并且随着芍药苷浓度的加大和作用时间的延长，其抑制作用也逐渐增加。另外，用流式细胞仪分析芍药苷作用后细胞的凋亡情况，结果显示在芍药苷的作用下，细胞凋亡13率呈明显的上升趋势。这表明芍药苷对细胞生长的抑制作用是通过对细胞凋亡的诱导作用来实现的。肿瘤细胞的凋亡是一个多因素参与的、复杂的生理性死亡程序。凋亡的发生途径分为死亡受体依赖途径和线粒体依赖途径。在线粒体依赖途径中，BCL一2家族是重要的调控者，BCL2和BAX基因是BCL2家族的两个重要的凋亡相关基因。BCL2蛋白主要通过稳定跨膜电位、抑制凋亡诱导因子释放、阻止CASPASE活化等多种方式抑制凋亡发生；而BAX不但拮抗BCL一2的凋亡抑制作用，而且具有直接促进细胞凋亡的功能。BCL2与BAX的比值决定了细胞是否接受凋亡诱导信号，以及接受凋亡刺激后细胞的生死【14】。CASPASE家族是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋胞凋亡有关的过程，包括细胞内蛋白质底物的降解、凋亡抑制的失活、凋亡小体的形成等，是此家族重要的功能执行者、凋亡过程中的关键酶，可以反应细胞的凋亡水平及凋亡启动因素的存在【L51。当接收到细胞凋亡信号的刺激，BCL2与BAX的比值变小，使线粒体外膜通透性升高，引起细胞色素C释放到胞浆中，激活凋亡【161。在本实验中应用芍药苷后，可见HELA细胞中抗凋亡相关基因BCL2表达减弱，而促凋亡相关基因BAX、CASPASE3表达增强，最终细胞出现凋亡改变。综上所述，在芍药苷的作用下，HELA细胞的生长受到明显抑制，且其凋亡率明显增加，在这一过程中，药苷的作用。另外，宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其有别于其他肿瘤的特点在于病灶与外界相通，治疗药物或措施可直接与病灶接触，起到直接杀伤宫颈肿瘤细胞的作用。本研究中芍药苷通过直接与HELA细胞作用，明显地抑制其增殖并促进其凋亡，作为传统中药的一种主要成分，有着潜在外用治疗宫颈癌的可能。细胞凋亡的过程是一个多因素参与调控的错综复杂的过程，芍药苷是如何在这一过程中发挥作用，影响宫颈癌细胞凋亡基因及其他相关因子的表达，以及其在临床上能否真正通过直接接触作用抑制宫颈癌的发生发展，尚有待于进一步深入研究。141516参考文献LPARKINJ，ETTHEWORLDCANCERBURDENGLOBOCANJDM，BRAYF，FERLYA1ESTIMATING2000JINTCANCER2001，9421531562PARKINJ，ETA1GLOBALCANG宅RCANCERJDM，BRAYF，FERLYSTATISTICSJCACLIN，2002，552。741083NIZAMUTDINOVAA1PAEONOLANDMAINACTIVEIT，JINYC，KIMJS，ETPAEONIFLORIN,THEPRINCIPLESOFPAEONIATHEHEARTINRATSFROMALBIFLORA,PROTECTMYOCARDIALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYPLANTA8MED，2008，741414ZHUA1PAEONIFLORININHIBITSINFLAMMMIONANDWL，CHENXGHB，ETJIANGSYSTEMICIMPROVESSURVIVALINCLINPHARMACOLTOXICOL，2009，1056471EXPERIMENTALSEPSISBASIC5KIMA1CHEMICALCONSTITUENTSISOLATEDFROMPAEONIALAETIFLORAROOTSSH，LEEMK，LEEKY,ETANDTHEFTOXIDATIVESTRESSINVITROJLNHIBMEDNEUROPROTECTIVEACTIVITYAGAINSTENZYMECHEM2416XJ，CHENHL，LIZ，ETEFFECTOFINRATSWITHNEONATALMATERNALZHANGA1ANALGESICPAEONIFLORINVISCERALISMEDIATEDADENOSINESEPARATIONINDUCEDHYPERALGESIATHROUGHBYA1RECEPTORTHEEXTRACELLULARINHIBITINGSIGNALREGULATEDPROTEINBIOCHEMBEHAV,2009，9488977WUINDUCEDIMMUNEA1PAEONIFLORINTOLERANCEOFMESENTERICH，WEIW，SONGL，ETLYMPHNODEVIABETADESENSITIZATIONINRATSWITHLYMPHOEYTESENHANCING2ADRENERGICRECEPTORARTHRITISINTADJUVANTIMMUNOPHARMACOL，2007，7662_6738WUA1PAEONIFLORINNFR,BACTIVATIONMODULATIONOFH，LITS，ETW，WANGSUPPRESSTHROUGHIRBAANDENHANCES5FLUOROURACILINDUCEDINHUMANCARCINOMACELLSAPOPTOSISGASTRICBIOMEDICINEPHARMACOTHERAPY，2008，626596669G2凋亡的研究中西医结合晏雪生，李瀚曼，彭亚琴，等芍药甙诱导入肝癌细胞系HEP肝病杂志，2006，16182010HUNGCJ，TSAIYM，ETOFISCELLJY，YANGA1ANTIPROLIFERATIVEACTIVITYPAEONIFLORINTHROUGHARRESTANDTHEFASFASINHUMANNONSMALLCELLCYCLEIIGANDMEDIATEDAPOPTOTICPATHWAYLUNGCANCERA549CELLSCLINPHARMACOLEXPPHYSIOL，2008，351411471LTSUBOIAKHANDA1PAEONIFLORININDUCESOFH，HOSSAINKAA，ETAPOPTOSISLYMPHOCYTESAREDOXLINKEDMECHANISMJCELLTHROUGHBIOEHEM。2004，93162172。12SLINHIBITIONEFFECTOFONTHEINVASIONOFHUMANY，ZHANGZHANGGUIZHIFULINGDECOCTIONCERVICALCANCERJOUMALOFETHNOPHARMACOLOGY，2008，120253513XUA1COROSOLICACIDINDUCESMITOEHONDRIALANDYGEDUJ，ETAPOPTOSISTHROUGHPATHWAYACTIVATIONINHUMANCERVIXADENOCARCINOMAHELACELLSCANCERCASPASEL甜ER2009。28422923714JMTHEBCL2OFTHECELLULARLIFEORDEATHSWITCHNATREVS，ADAMSCORYFAMILYREGULATORSCANCER，2002，264765615SALVESENGSDIMTBYVMCASPASESINTRACELLULARSIGNALING446OFCFROMMITOCHONDDA1KLUEKA1THERELEASE6E，GREENDR,ETCYTOCHROMERM，BOSSYWETZELFOR1321136ASITEBCL2PRIMARYREGULATIONOFAPOPTOSISSCIENCE，1997，275118综述天然萜类化合物在宫颈癌抗癌机制中的研究摘要随着中草药低毒高效的特点逐渐为大家认知，越来越多的中草药被用于宫颈癌的治疗。萜类化合物是中草药中一类比较重要的化合物，现已发现青蒿素、香樟醇、冬凌草甲素和大豆皂苷等多种萜类化合物表现出抗宫颈癌活性，其中二萜化合物紫杉醇已广泛应用于宫颈癌治疗，并且取得了较好的临床疗效，该类化合物的抗癌机制也正处于研究中。就萜类物质在宫颈癌抗癌机制中的研究进行综述。关键词二萜类；宫颈肿瘤；癌；药物疗法富颈癌是最常见妇科恶性肿瘤之一，在宫颈癌的综合治疗中，天然萜类化合物正发挥着不可或缺的作用。越来越多的萜类物质被发现具有抗宫颈癌作用，相关抗癌机制也正在研究中，部分萜类物质已应用于宫颈癌的临床治疗中。据萜类化合物的结构分类简述其在宫颈癌中抗癌作用及机制的研究状况，以期为开发新的天然萜类抗宫颈癌药物、进一步阐明各种萜类药物的抗癌作用机制提供线索。一、简介宫颈癌每年有约50万新发病例，其总体5年生存率仍然偏低。随着宫颈癌发病年轻化及患者对治疗后生活质量要求的提高，化疗已由晚期姑息治疗转为有效的综合治疗。目前以铂类为基础的宫颈癌一线化疗药物疗效确切，但存在肾毒性、骨髓抑制和胃肠道反应等严重毒副作用，不仅对人体机能造成损伤，严重者甚至会导致死亡。因此寻找高效低毒药物是提高化疗成功率和患者生存率、改善患者生活质量的关键。近年从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分引起了国内外学者的极大兴趣。萜类化合物是自然界种类繁多的一类次生代谢物，是中药和天然植物药的主要有效成分，又称类异戊二烯，目前已知的萜类物质多达3万余种。该类化合物表现出许多对人类有益的药理活性，如抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗真菌抗微生物活性及生长调节作用等。其中抗肿瘤作用尤为引人注意，国内外学者对其进行了19广泛研究和发掘。已有研究显示，萜类化合物抗肿瘤机制复杂多样，有以下途径直接细胞毒作用。抑制肿瘤细胞异常增殖。诱导肿瘤细胞凋亡。抑制肿瘤血管生成。降低肿瘤细胞线粒体膜电位。改变肿瘤细胞中游离CA2浓度。增强机体免疫力等。多种萜类化合物通过上述机制发挥抗宫颈癌的作用，有的已在临床上取得了良好疗效。二、倍半萜类倍半萜类化合物分布较广，在木兰目、芸香目、山茱萸目及菊目植物中最丰富。多种倍半萜化合物，如青蒿素、黄根醇、小白菊内酯和姜黄酮等具有抗宫颈癌活性。该类化合物可通过二价铁介导的细胞毒作用直接杀伤宫颈癌细胞，还能够抗肿瘤血管生成，亦可通过P53基因依赖途径及线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡。青篙素是从中药黄花篙中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，目前青蒿素类衍生物有双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚及青蒿琥酯。DISBROW等【L】研究发现，青蒿素在体外对宫颈癌HELA细胞株无杀灭作用，而双氢青蒿素在体外能够高效杀灭宫颈癌HELA细胞株，但对正常宫颈细胞几乎无细胞毒性。因此其推测青蒿素在体内是经过肝脏转化为双氢青蒿素才对HELA细胞起作用的。进一步研究发现，二有高效杀灭作用，该细胞毒作用是铁离子依赖性的。双氢青蒿素通过线粒体这一非尸53基因依赖途径促进宫颈癌细胞凋亡。在感染犬口腔乳头状瘤病毒的母犬模型中发现，双氢青蒿素组较未应用对照组能明显阻止肿瘤的发生。而且在正常犬应用双氢青蒿素黏膜未见溃疡或炎症损害。中国杭NCHEN等21发现，青蒿琥酯和双氢青蒿素能够抑制宫颈癌HELA细胞株生长并具有抗血管生成的作用。此外中国学者发现，青蒿琥酯具有放疗和化疗增敏作用。青蒿琥酯能抑制人宫颈癌HELA细胞MMOLL第一代放疗增MGL。在乏氧条件下，L生长，其半数抑制浓度IC50为37敏剂咪嗦哒唑MISO对HELA增殖抑制率与30MGL的青蒿琥酯作用相似，而在富MMOLL氧条件下，1MISO对HEL增殖抑制率低于30MGL青蒿琥酯的杀伤作用。说明青蒿琥酯具有一定的放疗增敏作用。随后PAIK等【3L发现，青蒿素的新衍生物双苯甲醇二聚体7及邻苯二甲酸二聚体5，均能在体外选择性高效杀灭宫颈癌细胞。这种杀灭作用呈剂量依赖性，而对正常宫颈细胞不产生细胞毒效应。ABDUL等【4】以BALBC小鼠为宫颈病变模型研究发现，倍半萜化合物花姜酮及其与顺铂联用均具有抗宫颈肿瘤作用，这一作用可能与调节小鼠血清中白细胞介素6的水平有关。黄根醇也是具有抗癌活性的倍半萜化合物，是中药黄根姜黄的提取物。ISMAIL等【5】研究发现，黄根醇能抑制宫颈癌HELA细胞株增殖，促进其凋亡。免疫印迹法进一步发现，黄根醇促凋亡过程中P53蛋白和BAX蛋白表达上调，而对抗凋亡蛋白BCL2及病毒抗原E6表达无影响。推测黄根醇可能通过P53基因依赖途径诱导HELA细胞凋亡。WU等【6L发现，倍半萜内酯小白菊内酯对宫颈癌SIHA细胞株有抗增殖和促凋亡作用。WANG等【71发现，二聚倍半萜棉子酚及其衍生物也能抑制SIHA细胞株生长。但对后2种倍半萜化合物的具体抗癌机制研究尚不清楚，限制了其临床应用。三、单萜类单萜类化合物广泛存在于高等植物的分泌组织里，海洋生物中也可见，有很强的生理活性，抗肿瘤作用是其显著活性之一。其中柠檬醛、紫苏醇、芍药苷和香樟醇等均表现出抗癌作用，在其他肿瘤中单萜类物质的抗肿瘤研究多见，但该类物质在宫颈癌中有无抗癌作用及其机制相关研究尚不多见。中国台湾CHEMG等【8】研究发现，单萜类化合物香樟醇对宫颈癌HELA细胞株有强烈的抗增殖作用，其IC50为O37DEIN6S等F9】从红藻海头红中得到的9种卤化单萜，发现由这些卤化单萜组成的复合物对HELA细胞具有明显细胞毒作用。近年亦有研究发现天然单萜化合物柠檬醛、香芹酚、麝香草酚及其大多数衍生物具有抑制HELA细胞增殖的作用，这提示该类物质存在潜在辅助治疗宫颈癌的可能【10以11。然而上述单萜类物质的具体抗癌机制尚少见相关研究。四、二萜类具有抗肿瘤活性二萜类化合物很多，如紫杉醇、丹参酮、冬凌草甲素和芫花酯等，其中多种表现出明显抗宫颈癌活性。其对宫颈癌的抗癌机制有几种抑制肿瘤细胞有丝分裂实现抗增殖作用；通过线粒体途径及P13KAKT信号通路诱导宫颈癌细胞凋亡；抑制肿瘤血管生成等。21紫杉醇是红豆杉属植物的复杂四环二萜类化合物，应用较广泛，具有独特抗肿瘤作用机制，其主要通过促进蛋白质组装成微管及阻止其解聚，将肿瘤细胞阻遏在G期和M期，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂，最终导致肿瘤细胞死亡。FARIED等【12】发现，宫颈癌HELA细胞表现出的紫杉醇敏感性最高，而CASKI细胞最低。紫杉醇通过内在途径诱导宫颈癌细胞凋亡，导致G2M期阻滞。能下调HELA及CASKI细胞的AKT蛋白磷酸化。在CASKI细胞，紫杉醇把诱导激活下游哺乳类雷帕霉素靶号活化，大大提高了CASKI细胞对紫杉醇诱导细胞凋亡的敏感性。LEE等【L3】用蛋白HPV阴性C33A的有丝分裂蛋白BUB3，提高凋亡相关蛋白、免疫应答相关蛋白和细胞周期控制蛋白的表达；减少生长因子、癌蛋白和转录调节蛋白的表达；其途径和线粒体介导的凋亡途径包含细胞色素C释放和BCL2下调实现的。YIM等141发现，紫杉醇作用于宫颈癌HELA细胞株后，转化含有卷曲螺旋酸性重复蛋白3TACC3的MRNA和蛋白质表达水平均呈时间和剂量依赖性下调。应用紫杉醇后TACC3后表现出协同作用；在TACC3表达沉默后再应用紫杉醇无法实现其G2M期阻滞及促凋亡抗增殖作用。BANNO等【15】还发现，有丝分裂前期检查点叉头环指结紫杉烷类药物的敏感性增强有关。紫杉醇应用广泛，其抗癌机制研究也较深入，诸多研究表明紫杉醇可能通过抗增殖促凋亡等途径分别或协同发挥抗宫颈癌效应。目前临床上包括紫杉醇的各种化疗方案也正处于研究中。MABUCHI等【16】对复发性宫颈癌放疗后的紫杉醇卡铂TC和不含紫杉醇以铂为基础NTP2种化疗方案的疗效和毒性进行比较。发现TC组28例患者有效率为679，其中5例完全缓解，14例部分缓解，所有患者肿瘤中位无进展生存期PFS为7个月，有效患者为10个月，骨髓抑制为最常见的毒性反应而对照NTP组31例患者有效率为226，中位和平均PFS分别为0和2个月。2组中有效率和中位PFS相比差异均有统计学意义。另外TC方案尤其对宫颈腺癌患者有明显疗效。紫杉醇在临床试验中的显著疗效也进一步验证了其抗宫颈癌效应。冬凌草甲素是从冬凌草中提取分离的四环二萜类化合物，具有广泛抗肿瘤作用。中国芜湖HU等1刀发现，25PMOLL以上的冬凌草甲素对宫颈癌HELA细胞具有明显生长抑制作用，并能诱导细胞发生凋亡，这种作用呈浓度和时间依赖性，冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中，细胞端粒酶、蛋白激酶B、人叉头框蛋白、糖原合成酶激酶3表达水平及活性显著降低。冬凌草甲素还诱导细胞色素C释放，伴随CASPASE3激活和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶断裂。应用半胱氨酸蛋白酶抑制剂，阻止CASPASE3的活化后可使冬凌草甲素诱导的细胞死亡作用消失。同年中日联合学者【181发现，冬凌草甲素可诱导HELA细胞发生自体吞噬。这种自噬作用呈剂量时间依赖性。冬凌草甲素处理HELA细胞后，自噬相关蛋白MAPLC3及BECLINL表达增强，而阻断自噬通路后，发生自噬的HELA细胞比率降低，MAPLC3及BECLIN1表达也降低，进一步研究发现RAS蛋白可抑制冬凌草甲素诱导的自噬，而P38、JNK及丝裂原活化蛋白激酶MAP融可正向调节这一作用。上述研究表明，冬凌草甲素可能通过调控凋亡相关基因表达、激活相关信号转导通路、降低细胞中端粒酶活性及诱导细胞自噬等机制发挥抗宫颈癌作用。丹参所含丹参酮也是三环二萜衍生物，1996年就有学者报道人宫