抗血凝素糖形驱动b细胞的免疫亲和力选择并决定流感疫苗效力

ANTIHAGLYCOFORMSDRIVEBCELLAFFINITYSELECTIONANDDETERMINEINFLUENZAVACCINEEFFICACY抗血凝素糖形驱动B细胞的免疫亲和力选择并决定流感疫苗效力TAIATWANG,JADMAAMARY,GENESTAN,STYLIANOSBOURNAZOS,CARLWDAVIS,FLORIANKRAMMER,SARAHJSCHLESINGER,PETERPALESE,RAFIAHMED,ANDJEFFREYVRAVETCH概要有保护作用的疫苗可以通过免疫复合物（ICS）中人体各处高度变异的B细胞抗原受体BCR的选择作用诱导出高免疫亲和力的使抗原失活的抗体。这表明FCFC受体FCR参与抗体免疫亲和力的成熟过程，同时由免疫复合物中免疫球蛋白GIGG亚类和FC多糖结构决定。三价流感病毒疫苗诱导抗血凝素IGG亚类和FC多糖的调控，同时唾液酸FC多糖SFC的丰富度可以预见疫苗反应的质量。我们发现SFCS通过结合II型FCRCD23来驱动BCR免疫亲和力选择，从而上调活性B细胞上受抑制的FCRIIB。这提高了BCR信号的阈值需求，使得B细胞选择出更高免疫亲和力的BCR。有SFC、血凝素HA、ICS参与的免疫诱导出保护性的、高免疫亲和力的IGG来对抗HA的保守追踪（）。这些结果显露了一条新奇的、内源的，使免疫亲和力趋于成熟的，可被用于通过唾液酸免疫复合体参与的免疫过程诱导出高免疫亲和力的、使抗原完全失效的抗体的通路。介绍ICFCR相互作用促成了一大批需要疫苗诱导的、保护性的、成熟的抗体反应的细胞过程，包括把抗原运送到生发中心的高效运输，滤泡辅助性T细胞的活化，以及高免疫亲和力的B细胞的选择。确实，FCR发出信号对于保持正负信号的平衡，达到最适免疫应答的极致，大体上是尽责的。两种基本类型的FCR已被识别I型FCR是免疫球蛋白超家族的成员，包括FCRI，II和III，II型FCR是C型凝集素家族的成员，包括DCSIGN和CD23任一信号臂（）的摄动均会导致抗体免疫亲和力和外周耐受的改变。ICFCR相互作用可以引起活化、抑制或调节的细胞信号，取决于FCRS引发的模式，而这是由IC内部FCR结构域的结构决定的。FC的结构反过来受到IGG亚类和FC多糖的组合方式调节。IGG抗体在人体中以四种亚类的形式存在IGG14，血浆中IGG1含量最丰富，IGG24含量依次降低。这是由本研究的十位成年健康志愿者的基准（预接种）抗凝血素IGGS的亚类分布显示出来的。每个亚类按照其结合活化比分布抑制的I型FCRS，以及IGG1和IGG3有着最高的活化受体亲和力。FC多糖是一种复杂的，通过N键连接在IGG每条重链的C2结构域内ASN297上的双触角结构，它的存在对所有的FCFCR结合作用都很必要。核心的FC七糖结构可以通过加上特殊的糖单位（海藻糖F，乙酰氨基葡萄糖N，半乳糖G和唾液酸S）修饰；这些修饰是动态的，作用是通过调整FC结构调节ICFCR相互作用，进而调节IGG分子生物活性。在基线上，大部分IGG的FC糖形都是“中性”结构，由海藻糖的存在和唾液酸的不存在决定。SFC存在，丰富度约520；去岩藻糖基化的糖形也被发现，丰富度约515。该分布是由本研究的病人群体的抗血凝素IGG1上的基准FC糖形结构揭示的。生物学上FC糖形结构最重要的修饰是唾液酸化和岩藻糖基化唾液酸的存在会抑制I型FC受体结合，而海藻糖的存在会促进与活化的I型FCRIIIA的结合。只存在唾液酸是FCII型FCR结合的决定因素。唾液酸化有着增强C2结构域构象灵活性的效应，使FC表现出更“封闭”的构形，从而使II型FCR的结合位点暴露出来，同时相对地降低结合I型FCR的可能性。因此FC多糖唾液酸化代表了一种通过FC构造在开放和封闭间的交替调节免疫球蛋白类的感受器活性，从而分别调节FC与I型还是II型FCR结合的机制。针对这种一分为二的乙酰氨基葡萄糖GLCNAC修饰的研究展示了提高I型FCRIIIA免疫亲和力的可能性；然而，去岩藻糖基化是强FCRIIIA结合的一种更有潜力的决定因素。只向分杈的FC的一臂或两臂加半乳糖不影响FCR结合，但是很重要，因为半乳糖苷化是唾液酸化的一个先决条件。IGG的FC结合特异性从I型转变成II型FCRS可造成显著的体内效应，对SFC丰富度清晰的调控可能是一种基本的自我平衡的过程。增强II型FCR信号的一个已知结果是抗炎，一个典型例子就是大剂量静脉注射免疫球蛋白IVIG的抗炎治疗。IVIG中的SFCS通过结合固有效应细胞上II型FCRDCSIGN来发挥作用，刺激IL33生产，引发后面的抗炎过程。I型和II型FCR信号平衡的崩溃可能发生在几种炎性疾病中，如类风湿性关节炎和肉芽肿病合并多血管炎，这些疾病会相对降低SFC的丰富度，这种SFC被发现于自身抗体如抗瓜氨酸肽ACPA和抗蛋白酶3PR3抗体。疾病恶化时抗ACPA和抗PR3FCS的唾液酸化程度降低，而疾病好转与上述抗体的FC多糖唾液酸化程度提高相关。正如唾液酸调控FC糖形在炎症过程的调节中发挥了重要作用，分支上海藻糖的存在与否调节着IGGFCS与FCRIIIA的相互作用来促进或抑制IGG调节的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用ADCC和单核细胞/巨噬细胞活动。去岩藻糖基化的FC结构域增强了与活化受体FCRIIIA的免疫亲和力，这是由FCRIIIA上的N多糖和去岩藻糖基化的FC多糖之间稳定相互作用造成的。从单克隆的治疗用抗体如利妥昔单抗和曲妥单抗上移除海藻糖增加了与FCRIIIA的结合，从而增强ADCC活性，进而增强了它们的临床效果。如同唾液酸化的糖形，伴随FC多糖上海藻糖层次的调节的疾病暗示了FC岩藻糖基化的严格调节；一个例子就是胎儿或新生儿同种免疫性血小板减少症，患儿对人血小板抗原HPA专一性的IGG岩藻糖基化FC多糖的水平显著降低了，去岩藻糖基化的HPA抗体的水平与疾病严重程度有关。FC多糖调节可能导致自分泌B细胞通过ICFCR相互作用发出信号，可能指导对疫苗接种的抗体反应，这一点是由对FC多糖构造可随接种发生变化，以及SFC可以结合CD23（一种表达在活化B细胞上的II型FCR）的观察揭示的。当前的研究被设计用来判定疫苗抗原IGGICS内部的FC结构是否作为包含在抗体反应的成熟内的指导FCR调节的过程的机制被调控。我们的方法是描述FC结构域的结构性决定因素（IGG亚类和FC多糖构造）在健康对象身上应用三联流感病毒疫苗TIV诱导产生的IGGS上的调节。下一步，我们进行了一系列控制实验来判定这种调节在决定疫苗反应时扮演了何种角色（如果存在）。在保护性疫苗反应形成过程中对FC结构域的自然调节的实验结果表明免疫策略，包括含SFC的ICS的管理诱导产生广谱保护性的抗体来对抗流感病毒。结果TIV诱导的IGG上FC结构域结构特性描述健康成年人注射了20122013TIV疫苗。血清（）被画在基线上（接种前），第七天、第三周、第五周、第七周进行后续接种，抗原特异性IGGS被分离以便后续对FC多糖构造和IGG亚类的分析。在基线上，使用同源的病毒通过H1结合酶联免疫吸附测定ELISA和血凝抑制试验HAI测试，所有对象抗H1HA疫苗组分，A/CALIFORNIA/04/2009（H1N1病毒），的IGG都呈阳性。基准的抗H1IGG按亚类分布和FC多糖构造进行特征性描述。基准抗H1IGG上FC糖形主要是中性的，在不同对象间取值范围是663883，GLCNAC含量范围是62146，唾液酸化糖形含量范围是46185，去岩藻糖基化多糖的含量范围是4271507。基准抗H1IGG和总IGG相比含有显著更多的SFC和更少的岩藻糖基化FCFUCFC，但亚类分布没有不同。后续接种中观察到了对H1特异性IGG上SFC糖形丰富度的调节。SFC糖形丰富度显著升高了，在接种后第7天达到峰值；这反映在第7天FUCFC的增加。SFC糖形和抗H1IGG上的FUCFC直到第7周一直高于接种前水平，除了接种后第3周有明显的下降。因为FC多糖的半乳糖苷化是唾液酸化的先决条件，半乳糖的存在可以作为决定唾液酸调节丰富度的限制因素。分析显示半乳糖GALFC水平在接种后受到一种微弱但统计上显著的程度的调节，但是在每一个时间点半乳糖苷化多糖的总丰富度都超过90。这比唾液酸化多糖高出几倍，表明唾液酸化不是受到半乳糖苷化的限制，而是受到独立的调节。二分的乙酰氨基葡萄糖糖形BGLCNACFC不受显见调节。除了接种后对FC糖形的调节，对单一时间点（第3周）的HA专一性IGG的分析表明专一性FC糖形可以和抗原结合片段FAB的专一性相连（），可能由于糖基化的不同，这种不同是由产生IGG的B细胞亚群如成浆细胞PB和记忆B细胞的不同实现的。抗HA（主要是球状头部专一性）和抗HA杆状抗体在FC糖形轮廓上有显著差异，唾液酸化和岩藻糖基化的多糖水平在总抗HAIGG中最高但在抗HA杆状IGG中最低。没有观察到二分的乙酰氨基葡萄糖水平的差异。接种后第7天的特征是抗H1IGG上SFC增多，这会使ICS中II型FCR结合增多。相反地，接种后第3周的特征是SFC减少，去岩藻糖基化FCAFUCFC增多，这会使信号平衡向活化I型FCR移动。第3周FC糖形构造向活化I型FCR信号偏移是从抗H1IGG亚类分布的调节反映出来的，IGG1丰富度中位数从基准的352增加到第3周时的7518。接种后FC糖形的存在反映了活化B细胞亚群内糖基转移酶的表达接种后第7天唾液酸化和岩藻糖基化的FC多糖达到峰值反映了研究对象外周血中成浆细胞丰富度达到峰值，与应用TIV后发生的成浆细胞扩张动力学的完整描述一致。此外，早期成浆细胞反应期间产生的抗H1IGG的量与接种后前7天抗HAIGG上SFC丰富度的变化相关P00065这些发现使我们猜测唾液酸化和岩藻糖基化的FC糖形可能是由PB产生的，至少是一部分地。因为第7天到第3周AFUCFC和去唾液酸化的FC糖形丰富度的相关性增加反映了病人群体外周记忆B细胞微小的增加，正如先前描述的那样，我们猜测那些糖形可能源于记忆B细胞。对PB和记忆B细胞细胞内相关的糖基转移酶染色表明PB相比记忆B细胞ST6GAL1表达增加，FUT8表达不显著增加。此外，对接受200910TIV的6位患者身上提取的第7天PB和记忆B细胞进行基因分析，结果表明PB相比记忆B细胞ST6GAL1P006和FUT8P003的表达增加，支持了由PB产生，较少的唾液酸化和岩藻糖基化的FC多糖由记忆细胞的可能性。不像ST6GAL1和FUT8，B4GALT1（编码一种参与FC多糖调节的半乳糖基转移酶）在PB中没有显著增加。唾液酸化FC丰富度可以预测流感病毒疫苗效果，这是由接种后HAI滴度的改变决定的为了调查TIV接种后FC多糖构造受控改变的重要性，我们评估了特定FC糖形的丰富度和血凝滴度HAI变化（TIV效果的一个常用测度）的联系。特别地，鉴于已经观察到接种后第7天HA专一性成浆细胞的扩张程度与疫苗反应有不紧密的联系，我们调查了第7天唾液酸化IGG的产生以及在第3周通过HAI滴度测量的疫苗效果之间的任何联系。确实，接种后第1周抗HAIGG上唾液酸化FC糖形丰富度的变化可以预见随后的HAI活性增强。另外，唾液酸化糖形的丰富度预测了接种后第3周抗HAIGG的免疫亲和力。这些数据表明应用TIV后产生的唾液酸化FC糖形的丰富度可以调节总体的疫苗反应的质量。ICS中唾液酸化FC糖形通过CD23依赖的方式引发B细胞上FCRIIB的上调为了判断免疫复合体中SFC调节B细胞活性的可能机制，我们通过多种体内体外试验研究了SFCICS对B细胞的影响。与原始SFC水平（176，抗HAIGG）或唾液酸苷酶处理来移除原始的唾液酸（去唾液酸化）共同使用的接种后第3周的IGG，与CALIFORNIA/04/2009CAL/09H1HA蛋白复合形成唾液酸化或去唾液酸化ICSIC或AIC。这些ICS和人类CD19外周血单核细胞PBMCS一同培养。培养24H后分析显示FCRIIB，抑制的I型FC受体，在与SIC共同培养的细胞上表达增加，而在与AIC或只与HA蛋白共同培养的细胞上没有此现象。相似地，一个重组抗HA单克隆抗体MABPY102，与唾液酸化FC糖形（237SFC）或去唾液酸化FC糖形共同表达，然后与A/PR8/1934PR8H1HA蛋白混合来产生SIC或AIC。这些MABICS随后与人B细胞淋巴瘤细胞系（BJAB细胞）一同培养，与初级B细胞试验类似，与SIC而不是AIC或单独的HA蛋白共同培养的MABICS可以引起FCRIIB表达的增加。接下来，为了判断唾液酸化ICS在体内如何影响B细胞，对实验鼠使用人类接种后产生的IGG/CAL/09HAICSSIC和AIC，3周后用HA蛋白进行加强。加强后10天，分析外周B细胞FCRIIB的表达；小鼠SIC处理的的抗原专一性外周B细胞FCRIIB表达增加，反之AICS处理组没有表现出那样的增强。相似地，由MABPY102和PR8HA蛋白制成的SIC或AIC被注射入小鼠体内；接种后3天，用SIC而非AIC或单独的HA进行免疫处理的小鼠生发中心B细胞的FCRIIB表达增加。因为CD23是B细胞表达的唯一的II型FCR，我们接下来判断FCRIIB的上调是否依赖于CD23的表达。CD23缺乏的小鼠生发中心B细胞没有表现出FCRIIB的上调，证明SICS借助CD23增强B细胞FCRIIB的上调。唾液酸化ICS诱导产生的IGG抗原免疫结合力更强我们知道FCRIIB表达增加基于BCR免疫结合力提高B细胞选择阈值，因此我们对SICS参与免疫诱导产生的抗HAIGG的免疫结合力进行描述。人类接种后IGG/CAL/09HAICS诱导产生IGGS的免疫结合力通过ELISA法，这是一种由用于抗HAIGGS评价的硝基苯基系统进行调节的方法；该法测量高免疫亲和力的结合IGGS占全部免疫亲和力的结合IGGS的比例。CAL/09HA1亚基的免疫亲和力也通过测量7M尿素治疗后保持结合态的IGG的量的方法进行评估。SIC处理方案诱导产生的IGG对CAL/09HA1（主要是球状头部），H1亚型HA蛋白的高度保守杆状结构域，和完整的CAL/09HA糖蛋白有显著更高的免疫亲和力。与应用SIC处理方案的CD23缺乏小鼠缺少FCRIIB上调过程的现象一致，CD23缺乏小鼠体内诱导产生的IGG没有表现出更强的免疫亲和力。MABPY102/PR8HAICS诱导产生的IGGS对PR8H1蛋白或PR8杆状结构域的免疫亲和力用表面等离子体共振SPR分析进行评估。研究发现SIC处理的小鼠的抗HAIGG的多克隆血清抗体离解率是AIC处理的小鼠或接受SIC处理的CD23缺乏小鼠的IGG的1/101/20更高免疫亲和力的IGGS调节对抗H1N1流感病毒的广泛保护为了判断与抗HAIGG免疫结合力的提高有联系的任何功能意义，我们测试了人类接种后多克隆IGG/CAL/09HAIC或单独的HA蛋白处理的小鼠产生的混合IGG（来自上一实验的血清）的保护活性。使用混合IGG和使用病毒HAI终点滴度相当，表明用于接种的同源HAA/NETHERLANDS/602/2009和CAL/09或CAL/09杆状蛋白有着相当的结合活性。为了进行激发试验，病毒在鼻内感染前用纯化的IGG进行预培养；这样质量损失就是和混合IGG一起培养后感染性病毒残余部分的作用。在激发试验中，我们观察到了相当的抗H1N1病毒A/NETHERLANDS/602/2009保护作用，这说明同源HA可用于疫苗接种。相反地，当我们用一种表达由高度保守的H1杆状结构域和一个无关的头部亚型结构域H5组成的嵌合血凝素分子CH5/1的病毒，只评估抗杆状结构域IGGS的保护活性时，我们观察到了混合IGG保护潜能的一个不同。只有SIC处理的细胞诱导产生的更高免疫亲和性的IGGS有抗杆状结构域介入的保护性。下一步，我们使用MABPY102/PR8HAIC免疫处理的小鼠（SIC处理野生型小鼠、SIC处理CD23缺乏小鼠或AIC处理）和只用PR8HA处理的小鼠IGG进行了等价激发试验。纯化的混合IGG和PR8HA有同等的结合效价。小鼠受到A/PR8/1934病毒的激发，这表明同源H1HA可用于疫苗接种，还有像之前一样，完全的保护需要所有IGG共同作用来实现。相反地，只有SIC诱导产生的IGG能使小鼠应对A/FM/1/1947H1N1病毒和A/NETHERLANDS/602/2009H1N1病毒的激发，证明保护的广度是由SIC诱导产生的更高免疫亲和力的IGG提供的。讨论早期成浆细胞反应产生的SFC被发现与随后的HAI抗体生产有关，这暗示了保护性TIV反应在个体发生学上可能需要免疫调变剂II型FCR信号。进一步的实验证明免疫复合体中的SFC引起B细胞FCRIIB的上调，从而调节B细胞的选择为偏好表达更高免疫亲和力的BCR。我们的研究提出了一个通过TIV接种引起成浆细胞扩张和SFCIGG生产的模型。免疫复合体通过活化B细胞上II型FCRCD23用SFCIGG信号生成，引起FCRIIB表达的增加。这导致了BCR免疫亲和力（B细胞生存所需）阈值的提高，最终导致更高免疫亲和力，更有潜能的保护性IGG的生成。几个实验（含本实验）已经发现抗HAIGG的基准滴度与TIV反应的程度成负相关，以致低基准滴度预示着更强的疫苗反应。低基准抗HA滴度也预示着成浆细胞活动频率和接种后第7天SFC糖形生产的增加。总的来说，低基准的抗HAIGG预示着接种后1周内成浆细胞的大扩张和唾液酸化糖形的大量生产，导致HAIIGG的巨大变化。值得注意的是，第7天唾液酸化FC糖形的更大规模生产也可以由基准唾液酸化FC丰富度预测，更低的基准唾液酸化糖形丰富度与随后SFC生产扩大有关。保护性抗杆状结构域IGGS可被唾液酸化ICS诱导产生这一发现和抗杆状结