细胞工程与环境

细胞工程摘要细胞工程即在细胞水平上应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术。构建环境工程菌、抗污染型植物以及基于抗体的环境治理等技术越来越广泛地应用到环境治理当中。本文简要介绍了细胞工程、细胞融合、细胞固定化的基本概念及其在环境治理中国内外的应用状况，并提出展望。关键词细胞工程；细胞融合；细胞固定化；ABSTRACTCELLENGINEERINGISAPPLICATIONOFCELLBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYDISCIPLINESTHEORYANDTECHNOLOGYATTHECELLULARLEVELBUILDENVIRONMENTENGINEERINGBACTERIA,ANTIPOLLUTIONPLANTSANDENVIRONMENTALPROTECTION,BASEDONANTIBODYTECHNOLOGY,AREMOREANDMOREWIDELYUSEDINENVIRONMENTALGOVERNANCETHISPAPERBRIEFLYINTRODUCESTHECELLENGINEERING,CELLFUSION,THEBASICCONCEPTSOFTHEIMMOBILIZEDCELLSANDITSAPPLICATIONINENVIRONMENTALGOVERNANCE,BOTHINSIDEANDOUTSIDECHINAANDPUTFORWARDTHEPROSPECTKEYWORDSCELLENGINEERINGCELLFUSIONIMMOBILIZATION1构建环境工程菌11细胞融合在外界因素诱导剂或促融剂的作用下，两个或两个以上的异源种、属间细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合CELLFUSION1。以细胞融合技术为首的多种细胞工程技术如细胞培养、细胞固定化等技术越来越广泛地应用到环境治理当中。原生质体融合技术作为高频重组的有效方法和遗传学研究工具，打破了不同物种间属间、门间进行基因重组的天然障碍，为把多个不同亲本优良性状进行融合提供了一个有利手段，并扩大了重组幅度，成为一种新的微生物育种技术1。原生质体融合技术由于可以构建生物新品种，同时又不属于“转基因生物”，不产生基因污染和安全性问题，会在微生物降解污染物的应用方面越来越广，越来越受到重视，尤其环境污染越来越严重的今天，更显示出其他技术无法比拟的优越性2。12固定化固定化细胞技术是指将微生物固定在载体上使其高度密集并保持生物活性功能，在适宜的条件下还可增殖以满足应用之需的生物技术；它利用某些化学或物理手段将游离细胞定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用3。2004年，有人尝试了用改进的PVA硫酸盐包埋法进行固定化藻细胞，用该法制得的固定化小球机械强度高，透光性和传质性能较好，能满足藻细胞光合作用和微生物生长的要求，可用于营养物浓度较高的城市生活污水处理体系，是一种具有发展潜力的新型固定化微生物方法。用此固定化方法得到的蛋白核小球藻和活性污泥共固定体系对含高浓度氮、磷的废水有良好的处理效果，而且无需额外的预处理过程4。2010年，刘望才等进行了新型固定化方法生物处理含酚废水的研究5。李贤玉等用CACL2作为固化剂，采用化学交联法研究制备聚乙烯醇PVA固定化微生物凝胶，获得了具有较高力学强度和通透性的PVA凝胶小球用于污水处理。所得到的凝胶小球的保留率及强度较高，通透性较好6。另外，有学者比较了固定化状态和悬浮状态的工程菌的降解效果，发现固定化工程菌的降解活性较后者明显降低，其比降解速率大约仅为后者的20。考察固定化工程菌长期运行的效果，发现其降解活性保存良好，工程菌稳定性大大提高，未出现固定化细胞溶涨、破碎现象。固定化后，工程菌的比降解速率虽然比悬浮工程菌降低了，但固定化工程菌更适用于长期运行的废水处理系统7。传统的未固定化处理的工程菌在活性污泥处理系统中流失严重，一些研究表明，采用基因工程菌的生物强化技术可以显著提高系统的处理效率，扩大底物利用范围，提高系统的抗冲击负荷的能力8。采用固定化基因工程菌强化处理与传统活性污泥处理串联工艺，实现对高浓度高负荷污水的生物强化处理，避免出现大量工程菌流失的现象，同时在固定化颗粒的表面以及浅层均观察到了大量工程菌菌体，固定化颗粒的表面还出现了生物膜和菌胶团9。13工程菌的实际应用131难降解有机污染物难降解有机污染物是指几乎不能被微生物降解，或降解所需时间非常长，已不可能被利用来控制该有机物对环境的危害的那些有机化合物，如卤代脂肪烃、卤代酯、单环芳香化合物、酚和甲酚类、邻苯二甲酸酯、多环芳香烃、氮代化合物、多氯联苯、有机氯虫剂、有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯杀虫剂和除草剂等10，生物可利用性低，其工程菌的构建主要包括以下两个方面11其一，工程菌代谢途径的改造，单一的代谢途径很难把POPS彻底降解，污染物降解到完全矿化一般需要不同层次的降解酶的共同作用，即共代谢降解作用。其二，工程菌构建的细胞融合技术，将能够产生生物表面活性剂（可以降低多环芳烃在环境中的毛细管张力和提高其在水中的溶解性，使多环芳烃从固相转移到水相）的细菌与高降解菌进行融合，从而增加了环境生物对POPS的利用率。该工程菌构建的应用具有重要的研究价值，很多学者在多个领域进行了研究和探索。（1）苯酚废水采用双亲灭活原生质体融合技术选育的一株高效苯酚降解菌株，比出发菌株降解苯酚能力提高20，能降解苯酚的最高浓度达到1800MGL1。以海藻酸钠为载体，将高效苯酚降解菌进行固定化，固定化细胞能降解苯酚的最高浓度提高为2200MGL1，比游离菌体的降酚能力约提高2212。（2）农药残留许多农田受到农药残留的污染往往是有机磷和有机氯类农药的混合污染。将有机磷水解酶基因的质粒导人降解有机氯的工程菌中，构建了能够同时降解有机磷和有机氯类农药残留生物降解的工程菌。通过在大肠杆菌表面表达有机磷水解酶，使酶与底物充分接触提高了全细胞降解活性。同时，该工程菌通过融合绿色荧光蛋白发出的荧光以便于该工程菌在线监测中的应用13。酯酶B1是有机磷抗性库蚊体内产生的一类水解酶,它能有效的水解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等四大类农药。酯酶B1基因在原核细胞中有两种表达形式，一种是非融合表达，另一种是融合表达，为进一步提高工程菌的酯酶活性，为其应用于生产实践创造条件，笔者研究了酯酶B1基因在大肠杆菌中的融合高效表达，获得转解毒酶基因工程菌，并对其进行固定化研究，结果表明固定化工程菌株对有机磷农药有高效降解能力。这将为清除有机磷农药污染提供一些帮助14。有机磷农药在农业生产中得到了广泛使用，但是其高毒、高残留等不利因素也给人类健康和生态环境带来巨大威胁。冰核活性细菌的分离鉴定，从植物冻伤组织中分离到一株具有冰核活性的细菌；利用丁香假单胞菌的冰核蛋白N末端作为锚定单元构建了表面展示有机磷水解酶大肠杆菌基因工程菌，比文献报道的大肠杆菌细胞表面展示的有机磷水解酶的最高酶活性高13倍；将融合基因连接到广宿主表达载体PYMBP上，转化到野生型恶臭假单胞菌进行培养，以获得最大全细胞酶活性15。132重金属发展生物降解性能好、环保和可持续的工程菌对重金属的去除具有重大意义，土著菌的改造尤其是关键16，发展生物降解性能好、环保和可持续工程菌的关键见图1。土著工程菌金属平衡的基因在生物和非生物环境生存的能力金属螯合剂和转运基因环境可持续的生物修复能力提高降低风险的基因金属吸收的调节基因生物可降解酶图1发展生物降解性能好、环保和可持续工程菌的关键国外很多学者在这方面进行了深入的研究，有关工程菌修复重金属的实例很多，见表1。表1国外有关工程菌修复重金属的实例16细菌基因表达重金属修复引用真氧产碱杆菌RALSTONIAEUTROPHACH34金属硫蛋白METALLOTHIONEINCD2实验室小试VALLSETAL2000抗辐射球菌DEINOCOCCUSRADIODURANSSTRAINSHG抗性基因HG来自于核武器的放射性废物BRIMETAL2000大肠杆菌、莫拉克斯氏菌属ESCHERICHIACOILANDMORAXELLASP表达EC20CD和HG实验室小试BAEETAL2001,2003大肠杆菌菌株ECOLISTRAIN有机汞制剂ORGANOMERCURIALLYASEHG印度地理位置独特的地区MURTAZAETAL2002荧光假单胞菌PFLUORESCENS4F39NI转运系统NI实验室小试LOPEZETAL2002生根瘤菌属MESORHIZOBIUMHUAKUII植物螯肽合成酶PHYTOCHELATINSYNTHASE,PCSCD2稻田实验SRIPRANGETAL2003B3恶臭假单胞菌株PPUTIDASTRAIN铬酸盐还原酶CHROMATEREDUCTASECR细菌培养物及其悬浮液ACKERLEYETAL2004大肠杆菌菌株ECOLISTRAIN金属调节蛋白METALLOREGULATORYPROTEINARASROVEREXPRESSINGELP153ARAS污染的饮用水和地表水KOSTALETAL2004大肠杆菌ECOLISE5000NI转运系统和金属硫蛋白NI水中NI2的累积DENGETAL2005大肠杆菌ECOLIJM109HG2转运和金属硫蛋白HG实验室小试ZHAOETAL2005大肠杆菌菌株ECOLISTRAIN丝氨酸乙酰转移酶的高表达NI和CO实验室小试FREEMANETAL2005氧化亚铁硫杆菌株ACIDITHIOBACILLUSFERROOXIDANSSTRAINHG离子转运基因表达HG实验室小试SASAKIETAL2005恶臭假单胞菌PPUTIDA06909金属结合肽的表达EC20CD多重金属污染地WUETAL2006假单胞菌属PSEUDOMONASK62表达HG转运和有机汞制剂HG污染地的水银KIYONOANDPANHOU2006大肠杆菌菌株ECOLISTRAINPCS基因表达SPPCSCD2微生物吸附剂对CD的去除KANGETAL2007大肠杆菌ECOLIJM109CD转运和金属硫蛋白NAMELYM4CD水中CD的去除DENGETAL2007大肠杆菌菌株ECOLISTRAIN金属硫蛋白MTAS来自于细菌培养物SINGHETAL2008大肠杆菌菌株ECOLISTRAINASS腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因AS来自于细菌培养物YUANETAL2008荧光假单胞菌OS8大肠杆菌甲基纤维素1061MERR/CADC/ZNTR/PMER/PCADA/PZNTACD,ZN,HG,PBBONDARENKOETAL2008假单胞菌属PSEUDOMONASK62MEREPROTEINENCODEDBYTRANSPOSONTN21BROADHGTRANSPORTERHG细胞膜外KIYONOETAL2009无色杆菌属ACHROMOBACTERSPAO22HG还原酶基因表达HG污染地的生物修复NGETAL2009荚膜甲基球菌属METHYLOCOCCUSCAPSILATUSBATHCRRGENESFORCRVIREDUCTASEACTIVITY还原酶活性CRVICELLASSOCIATEDCRREMOVALINLABORATORYCONDITIONSHASINETAL2010CAULOBACTERCRESCENTUSJS4022/P7236HRSAA6HISFUSIONPROTEINCDPATELETAL2010鞘氨醇单胞菌芽孢杆菌属SPHINGOMONASDESICCABILISANDBACILLUSIDRIENSISSTRAINSOVEREXPRESSIONOFARSMGENEAS实验室小试LIUETAL2011枯草杆菌BSUBTILISBR151PT0024LUMINESCENTCDSENSORSCD土壤污染LVASKETAL2011133饮用水的净化生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，融合白腐真菌、土著细菌YZ、酿酒酵母三个亲株真核原核细胞的原生质体，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得基因工程菌用所述特效菌。生物膜反应器深度处理饮用水源苯并芘的方法是基因工程菌剂引入装有活性炭载体的柱状反应器中，闷曝驯化挂膜使基因工程菌在活性炭载体上形成生物膜；之后将饮用水源水引入反应器中，调试处理之后进入稳定处理运行阶段17。2抗污染型植物土壤中重金属的污染治理通常是将从金属污染的土壤提取金属并把它转移和去除。抗污染型植物的开发与增强其金属吸收、积累和耐毒性等性能的研究意义非凡。细胞工程对于发展理想的植物修复的植物，提高金属积累能力至关重要18。构建抗污染型植物的细胞工程技术，主要包括原生质体培养、体细胞杂交和体细胞无性系变异19。原生质体培养和体细胞杂交是植物细胞工程的核心技术之一，为克服植物远缘杂交不亲和性，创造新的种质资源，实现植物遗传转化和进行细胞学的基础研究提供了重要的技术支撑。体细胞无性系变异是指植物体细胞在植物组织培养过程中产生的变异。利用人工诱变创造体细胞无性系变异，已成为植物细胞工程育种的重要技术。人工诱变方法包括物理诱变C射线、X射线、中子、电子束、离子束、激光、紫外线、空间环境、化学诱变甲基磺酸乙酯、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、5BU、EB等和生物诱变转座子插入突变、跳跃基因等。构建抗污染型植物的细胞工程在实际植物细胞工程的应用见表2。表2在不同植物中利用转基因的方法增强其对重金属的吸收18金属植物方法参考文献BRASSICANAPUS欧洲油菜EXPRESSIONOFBACTERIALACCDEAMINASEGENEACC脱氨酶基因表达的细菌STEARNSETAL2005NIARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFNICOTIANAMINESYNTHASECDNA烟草胺合成酶的表达的互补PIANELLIETAL2005BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEANDGLUTATHIONESYNTHETASE谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶的高效表达BENNETTETAL2003REISINGERETAL2008ARABIDOPSIS拟南芥OVEREXPRESSIONOFARABIDOPSISPHYTOCHELATINSYNTHASEATPCS1拟南芥植物螯合肽合成酶的高效表达LEEETAL2003CDARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFYEASTABCTRANSPORTERFAMILYMEMBER,YCF1转运蛋白酵母的表达SONGETAL2003ARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFYEASTABCTRANSPORTERFAMILYMEMBER,YCF1转运蛋白酵母的表达SONGETAL2003BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFAYEASTCADMIUMFACTOR1YCF1一个镉因子酵母的表达BHUIYANETAL2011APBBRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFATPBINDINGCASSETTEABCTRANSPORTERGENEATATM3蛋白转运基因的高效表达BHUIYANETAL2011BNICOTIANATABACUM烟草EXPRESSIONOFYEASTMETALLOTHIONEINCUP1GENE金属硫蛋白CUP1基因酵母的表达THOMASETAL2003POPULUSALBA白杨树EXPRESSIONOFPSMTA1GENEFROMPISUMSATIVUM豌豆BALESTRAZZIETAL2009CUARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFYEASTCOPPERDEPENDENTTRANSCRIPTIONFACTORACE1铜依赖转录因子酵母XUETAL2009ARABIDOPSISOVEREXPRESSIONOFZNINDUCEDFACILITATOR1ZIF1锌诱导HAYDONANDCOBBETT2007BRASSICAJUNCEA芥菜OVERPRODUCTIONOFTHEGGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEANDGLUTATHIONESYNTHETASE谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽合成酶BENNETTETAL2003ZNNICOTIANATABACUM烟草OVEREXPRESSIONOFGLYOXALASEPATHWAYENZYMES醛酮变位酶通道酶SINGLAPAREEKETAL2006HGARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFBACTERIALGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEGENEUNDERCONTROLOFASTRONGCONSTITUTIVEACTINREGULATORYSEQUENCEA2一个强大的肌动蛋白监管序列控制下细菌合成酶基因LIETAL2005NICOTIANATABACUM烟草EXPRESSIONOFPPKGENESPECIEDBACTERIALPOLYPHOSPHATEPOLYP多磷酸盐细菌NAGATAETAL2006NICOTIANATABACUM烟草EXPRESSIONOFAMODIFIEDBACTERIALHGREDUCTASE,MERAGENE修改后的汞细菌还原酶HEATONETAL2005ARABIDOPSIS拟南芥EXPRESSIONOFBACTERIALGAMMAGLUTAMYLCYSTEINESYNTHETASEGENEUNDERCONTROLOFASTRONGCONSTITUTIVEACTINREGULATORYSEQUENCEA2一个强大的肌动蛋白监管序列控制下细菌合成酶基因LIETAL2005BRASSICAJUNCEA芥菜OVEREXPRESSIONOFATPSULFURYLASE硫酸化酶WANGELINEETAL2004ASBRASSICANAPUS欧洲油菜EXPRESSIONOFENTEROBACTERCLOACAE阴沟肠杆菌UW41AMINOCYCLOPROPANE1CARBOXYLATEACCDEAMINASE脱氨酶EC41994GENENIEETAL20023基于抗体的环境污染治理技术本文采用碳二亚胺缩合方法合成了软海绵酸与不同蛋白载体偶联物，分别用作免疫抗原和包被抗原，免疫BALB/C鼠，采用细胞融合技术，制备了抗腹泻性贝毒主要成份软海绵酸的1种多克隆抗体、2种单克隆抗体，研究了应用这些抗体发展建立软海绵酸的间接竞争酶联免疫检测和胶体金标记免疫层析检测技术20。建立了水中硝基苯胺测定的间接竞争酶联免疫测定方法，精密度和准确度均符合残留测定的要求。该方法可用于地下水、地表水、饮用水等不同水样硝基苯胺的检测。与HPLC方法比较，本方法的主要优点在于不需要复杂的样品前处理，水样可直接用于检测，不需要昂贵的仪器设备21。4展望采用紫外诱变与原生质体融合联用的方法对好氧反硝化菌株进行育种22。首次利用PEG细胞融合技术构建融合子菌株，降解处理印染废水23。都为细胞工程的发展提供了广阔的前景。参考文献1赵志强,郑小林,张思杰等细胞融合技术J生物学通报,2005,401040412卢静,党志,郭楚玲PAHS降解菌的细胞融合及降解菲的性能研究J第六届全国环境化学大会,20083杨意东,赵丽君高浓度有机废水固定化生物处理技术的研究J给水排水,20004黄国兰,王媛,孙红文等固定化藻菌共生系统及其脱硫除磷作用研究Z国家科技成果,20045刘望才,金谊,高浩其等新型固定化方法生物处理含酚废水的研究Z国家科技成果,20086李贤玉,叶林污水处理用聚乙烯醇凝胶的制备及结构与性能研究A2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集（下册）C,20097谢珊,刘俊新,李琳等利用基因工程菌BL21处理有机磷混合农药废水的研究J环境工程学报,20088BOONN,TOPEM,VERSTRAETEW,ETALBIOAUGMENTATIONASATOOLTOPROTECTTHESTRUCTUREANDFUNCTIONOFANACTIVATEDSLUDGEMICROBIALCOMMUNITYAGAINSTA3CHLOROANILINESHOCKLOADJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,200