人工复制小鼠铜离子中毒的病理变化观察

人工复制小鼠铜离子中毒的病理变化观察提交日期2010年3月诚信声明本人郑重声明所呈交的本科毕业论文（设计）是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。毕业论文（设计）作者签名年月日目录摘要4关键词41前言42材料与方法621试脸材料6211试验动物6212实验试剂和仪器622实验方法6221动物分组6222临床观察6223病理组织学观察63结果与分析731临床症状与大体病理变化732病理组织学变化74讨论105结论11参考文献11致谢12人工复制小鼠铜离子中毒的病理变化观察作者陈青山指导老师李德亮（湖南省农业大学动物科学技术学院，长沙410128）摘要本研究采用硫酸铜灌胃的方式对小鼠铜中毒的临床表现及组织器官的病理变化进行观察。试验根据灌胃的剂量将实验小鼠随机分为4组对照组0MG/KG、低剂量组50MG/KG、中剂量组100MG/KG，高剂量组200MG/KG，每组6只，试验周期为2周。结果显示，高剂量组的死亡率高于中剂量和低剂量组。高剂量组器官的病理形态学观察表现为肝脂肪变性和颗粒变性，肝细胞呈现蜂窝状外观，低剂量组和中剂量组肝细胞肿大，胞浆内充满红染的细微颗粒；低剂量组中肾小管出现颗粒变性，肾小管上皮细胞肿胀，使管腔变小或狭窄，间质毛细血管扩张，充血。中剂量组肾小管出现明显颗粒变性，管腔中有许多红染蛋白质物质，出现管型。部分肾小管壁细胞结构被破坏。高剂量组肾小管上皮坏死、崩解、脱落于管腔中。结果表明，铜中毒主要损害肝脏、肾脏等组织器官，最终导致发病甚至死亡。关键词铜中毒；病理变化；小白鼠；1前言铜元素普遍存在于动物、植物和微生物体内，是所有低等动物和脊椎动物必需的微量元素之一。自1925年被首次报道后，铜作为动植物营养必需微量元素的作用逐渐被人们所认识并不断被研究1。研究表明，在饲料中添加适量的铜，可明显提高动物的生产性能。铜的这种特殊生物学作用，在现代畜牧业中已被广泛应用，并取得了较好的经济效益。近年来，由于饲料中铜的过量添加而导致的动物中毒现象常有时有发生4。许多铜盐如硫酸铜、次醋酸铜、碳酸铜、氯化铜、氧化亚铜、硝酸铜、石油酸铜、三氯酚铜等作为沙虫剂、浸种剂、杀真菌剂、驱虫剂、灭螺剂或木材防腐剂2被广泛的使用也常常给家畜养殖带来巨大的潜在危险，动物误食铜盐后就会发生铜中毒。此外，一些植物含有吡咯类生物碱的有毒植物如三叶草、千里光、和天荞莱属植物能够增强铜与肝脏的亲和力、使铜在肝脏蓄积而不能正常排出；另一些含有肝毒性生物碱的植物会造成动物肝细胞的损伤，从而使铜在肝脏的代谢出现异常，也能使动物体内蓄铜过多而中毒3。虽然动物每日摄入铜的含量没有达到中毒剂量，但是动物日粮中钼的含量非常低或日粮中铜/钼的比值过高大于10，也能造成铜在动物肝脏内蓄积，蓄积过量时动物出现铜中毒症，有报道羔羊在补饲向日葵钼/铝比值大于10后，出现慢性铜中毒症状18。铜中毒的发生，往往会给养殖业带来巨大的经济损失。因此，及时掌握动物铜中毒后的临床表现及其对机体组织器官的病理损害，从而探讨发病机理将会对铜中毒的临床诊断和基础研究提供重要的指导意义17。已有的研究表明，各种动物对铜的毒性作用和铜的敏感性存在有较大的差异10。绵羊敏感性最高，反刍动物次之，高于其它动物6；中毒剂量的报道也不经相同羔羊2550MG/KG，绵羊20110MG/KG15，奶牛200880MG/KG7，奶牛200MG/KG8，蛋鸡500MG/KG，猪为250400MG/KG17；兔200MG/KG16；马800MG/KG，大鼠1000MG/KG，肉鸡300MG/KG11，鸭300MG/KG9，鹅100MG/KG2。动物铜中毒的研究主要集中于中毒剂量，临床表现，病理变化，血液生化指标以及发病机理等方面，在蓄积至一定阶段后，会突然出现严重的溶血，肝肾损伤，并最终死亡14。动物发生铜中毒时，6磷酸葡萄糖脱氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，而丙氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸氨基转移酶，乳酸脱氢酶等酶活性升高16。动物的铜中毒习惯上分为急性中毒和慢性中毒。急性铜中毒主要以明显的胃肠炎为临床症状，表现为恶心、流涎、腹泻、剧烈腹痛13。慢性铜中毒主要以溶血症状为主要临床症状，据国内报道，王幼名和王长青等做了猪中毒的研究，临床表现如下性中毒时精神沉郁、食欲废绝、呕吐、腹痛、腹泻，肌肉松弛，排黑色稀粪，胃与十二指肠粘膜见有出血、溃疡、坏死病变，肝脏肿大呈土黄色5。徐善良和杨云林等做了山羊的铜中毒研究，具体症状如下铜中毒时病理剖检变化以胃肠粘膜糜烂脱落、溃疡、出血为特征12。党晓鹏和齐长明等做了绵羊的研究，具体症状如下心外膜出血，肝脏肿大胆囊扩张，肾脏表面有出血点15。舒港亮，翟国东和朱秀琴做了鸡的研究，结果如下急性铜中毒最后痉挛而死，中毒临床症状拉稀，缩头伏地食欲废绝，精神沉郁，腿部肌肉麻痹，呼吸困难，剖检可见肝脏肿大，呈块状土黄色胃粘膜充血，其中十二指肠较严重，胆囊肿大11。本实验通过研究小鼠铜中毒，了解和观察铜离子对小鼠心、肝、脾、肺、肾的影响，从而研究铜中毒对机体器官组织的病理损害，探讨发病机理，为临床诊断和基础研究提供科学依据。2材料与方法21试验材料211试验动物昆明种小白鼠24只，体重18G22G，购买于湖南吉首大学医学院实验动物中心。饲养室温度2327，每天光照12H。212实验试剂和仪器乙醇湖南江虹试剂有限公司、二甲苯上海实验试剂有限公司、苏木素上海标本模型厂、伊红染色素上海试剂三厂、切片石蜡上海标本模型厂、中性树胶上海标本模型厂、福尔马林、碳酸锂饱和液等。MOTIC奥林巴斯显微摄影系统、YD202型石蜡切片机。22实验方法221动物分组室内暂养一周后，试验小鼠被随机分成四组对照组、低剂量组50MG/KG，中剂量组100MG/KG、高剂量组200MG/KG。硫酸铜溶液经口灌胃小鼠，对照组以等量生理盐水代替硫酸铜。每天中午进行灌胃，不限饮水，自由采食，共连续灌胃15D。试验期间，温度在2226，光照12H。222临床观察试验期间每日进行临床观察，纪录临床症状。在试验进行的第10天和11天，高剂量组有3只小白鼠死亡，中剂量组在第14天有1只小白鼠死亡。死亡的小白鼠立即当天取其脏器，余下的小白鼠在试验期满时采用人工脱颈致死法进行剖杀，并取心、肝、脾、肺、肾进行观察，之后放入福尔马林固定液中固定。223病理组织学观察1取材取病变与正常组织的交界处的实质脏器心、肝、脾、肺、肾。2固定将所取病料置10的福尔马林固定液中固定48H,在固定6H小时后，对组织块进行修块。将修好的组织块放于白色的小包埋盒中，按设定好的程序进行脱水、透明、浸蜡，其具体的程序步骤为水洗80酒精1H90酒精15H95酒精2H95酒精2H100酒精1H100酒精15H100酒精15H二甲苯05H二甲苯1H石蜡2H石蜡2H。3包埋将小包埋盒的盖子去掉，将组织块从包埋盒中用小镊子轻轻取出，取出时注意仍将要切的面朝下，平放在已滴满石蜡的不锈钢包埋盒的中央位置，这一点非常重要，否则会将要切的面切不完整，放好组织块后，将白色的小包盒底部镶嵌在不锈钢包埋的上方，再在其上滴满石蜡。随后将已包埋好的不锈钢小包埋盒冷却使其凝固。当组织块已完全与石蜡凝固结合在一起时，将不锈钢包埋盒轻轻从要切的组织块底部轻轻去掉，将留有组织块的白色小包埋盒侧面的石蜡轻轻刮去。4切片将保留在白色小包埋盒的组织块固定在石蜡切片机上，先行修片，当修到完整的组织时，将切片的厚度调到57M，再行切片，切片时注意用力均匀，进行连续切片。5展片、摊片与烘片将切好的组织薄片用毛笔刷轻轻挑起，同时用小镊子轻轻将切好的组织薄片的起始部夹起，放入水浴锅展片，温度为4550。温度过高可将切片熔化，过低则切片不宜伸展。切片放入展片槽中时，立即用小镊子轻轻在其上面将其有皱缩的地方展平，此时将已准备好的载玻片垂直伸入液面下在载玻片的1/3处将薄层切片缓缓涝起，切片可自动贴附于载玻片上，将载玻片放在切片架上，再将其放在摊片架上。最后再将切片架移到烘片箱中烘干烘片箱中的温度为76，一般持续时间为40MIN。6脱蜡、染色与封藏将放有载玻片的染色架放入二甲苯中浸泡10MIN二甲苯中浸泡10MIN以充分脱蜡100酒精5MIN100酒精5MIN95酒精5MIN85酒精5MIN80酒精5MIN苏木素染液染色5MIN水洗（将切片架放入事先准备好的清水中冲洗5MIN）1盐酸酒精分化（这一步骤相当关键，它的主要目的是脱去胞浆的着色，时间过长可使胞核的着色脱去。）放进去后要迅速取出，时间一般掌握在46秒钟自来水缓缓冲洗1530MIN伊红染液染色13分钟95酒精3S100酒精3S100酒精3S二甲苯3S二甲苯3S。至此HE染色过程全部结束，将染色架上的载玻片取出，用干净的纱布将二甲苯液体蘸去，并在上面滴上中性树胶，将盖玻片封好，贴上标签作好标记后放入切片盒中,观察各个脏器的病理变化。3结果与分析31临床症状与病理变化高剂量组临床表现食欲废绝，精神沉郁，缩头，全身震颤，卧地不起，排黑褐色粪，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色，质脆易碎，胆囊膨大充满蓝绿色胆汁，死亡病例还可见肾轻度肿大。中等剂量组表现为食欲废绝，精神沉郁，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色。低剂量组的无明显的变化。32病理组织学变化肝脏低剂量组和中剂量组肝细胞肿大，胞浆内充满红染的细微颗粒，中央静脉、肝窦以及间质小血管内充满红细胞。高剂量组肝脏出现明显颗粒变性和脂肪变性，肝细胞肿大，胞浆内充满大量红染的细微颗粒或圆形空泡，细胞呈现蜂窝状外观图1。部分病例可见局灶性坏死，内肝细胞索排列紊乱，肝细胞胞浆红染，细胞核出现固缩和碎裂图2。中央静脉内红细胞不清楚，只见红染丝网状物质充满血管。图1肝细胞呈蜂窝状图2肝细胞核固缩和碎裂心脏在中剂量组和高剂量组可见心肌纤维肿胀，出现许多红染的细微颗粒图3。心肌纤维间毛细血管内充满红细胞。脾脏在中剂量组和高剂量组可见脾脏白髓区变小，中央淋巴细胞和边缘区淋巴细胞数量减少，网状细胞增生，红髓血窦扩张充血（图4）。高剂量组部分病例脾脏白髓淋巴细胞出现坏死。图3肌纤维肿胀和细微颗粒图4红髓血窦扩张充血肺在中剂量和高剂量组中小血管和毛细血管明显扩张，内充满红细胞图5。高剂量组中部分肺泡腔内有少量红染浆液，部分肺泡扩张出现肺泡性肺气肿图6。图5小血管和毛细血管明显扩张，内充满红细胞图6肺泡腔内有少量红染浆液肾脏低剂量组中肾小管出现颗粒变性，肾小管上皮细胞肿胀，使管腔变小或狭窄（图7），间质毛细血管扩张，充血。中剂量组肾小管出现明显颗粒变性，管腔中有许多红染蛋白质物质，出现管型（图8）。部分肾小管壁细胞结构被破坏。高剂量组肾小管上皮坏死、崩解、脱落于管腔中。图7肾小管出现颗粒变性，上皮细胞肿胀，使管腔变小或狭窄图8肾小管出现明显颗粒变性，管腔中有许多红染蛋白质物质4讨论本实验采用三组不同浓度的铜对小白鼠进行攻毒，分别为低剂量、中剂量和高剂量，时间为半个月。高剂量组小鼠在试验期间有死亡现象，临床病理症状表现为食欲废绝，精神沉郁，缩头，全身震颤，卧地不起，排黑褐色粪，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色，质脆易碎，胆囊膨大充满蓝绿色胆汁，死亡病例还可见肾轻度肿大。中等剂量变现为食欲废绝，精神沉郁，脾脏体积缩小，重量减轻，色泽变淡，肝呈黄褐色，低剂量眼观无明显变化。本实验所获结果为动物铜中毒的系统研究提供了动物模型，也可供临床或发病现场诊断和治疗铜中毒做参考，从小白鼠发病时间、病程经过、死亡情况的综合分析，作者认为铜中毒低剂量和中剂量的引起慢性铜中毒。铜中毒高剂量引起小白鼠的急性铜中毒，表明铜的中毒病理表现因动物种类和铜中毒剂量各异。病理形态学的研究表明，小白鼠铜中毒病变靶器官是肝脏、肾脏、消化道和免疫器官，与铜盐的刺激和腐蚀作用，铜在体内组织分布及蓄积特点和铜排出密切相关。由于铜盐具有强烈的刺激和腐蚀作用，铜盐进入消化道便引起剧烈反应和造成严重的病理损害，表现为肌胃角质层增厚、龟裂乃至呈绒毛状，肠黏膜上皮变性坏死，肠绒毛断裂，这是铜盐直接作用于胃肠道黏膜的结果，导致胃肠功能受损，铜被吸收进入体内后主要在肝脏蓄积，随着时间的增长铜的蓄积量大幅度增加。铜的蓄积一旦超过肝脏对其的利用，在释放入血之前便对肝细胞造成直接的损害作用，引起肝细胞肿大，颗粒变性和脂肪变性，肝细胞肿大，胞浆内充满大量红染的细微颗粒或圆形空泡,细胞呈现蜂窝状外观。至于脏脏中蓄积的铜大量释放入血引起血铜升高时，肝铜含量仍未降低，且表现出极强的时间剂量效应，故肝铜可作为评价铜状态的一个敏感指标。肝铜蓄积到一定程度时则大量释放入血引起血铜升高，同时。肾铜浓度也随之升高，造成肾小管上皮细胞的损伤，导致肾功能受损。5结论本研究结合当前铜中毒的研究进展，从病原学、临床症状以及中毒后对机体各脏器的结构的影响等多角度详细的阐述了人工复制铜中毒的病理形态学，为人工复制铜中毒的预防及诊断提供了极其重要的技术依据。发生铜中毒时，造成了广泛性实质脏器的损伤和出血，尤其是肝脏、肠道和肾脏的病理性损伤更明显，肝脏低剂量组和中剂量组肝细胞肿大，胞浆内充满红染的细微颗粒，中央静脉、肝窦以及间质小血管内充满红细胞。高剂量组肝脏出现明显颗粒变性和脂肪变性，肝细胞肿大，胞浆内充满大量红染的细微颗粒或圆形空泡,细胞呈现蜂窝状外观，部分病例可见局灶性坏死，内肝细胞索排列紊乱，肝细胞胞浆红染，细胞核出现固缩和碎裂，中央静脉内红细胞不清楚，只见红染丝网状物质充满血管。肾脏肾脏低剂量组中肾小管出现颗粒变性，肾小管上皮细胞肿胀，使管腔变小或狭窄，间质毛细血管扩张，充血。中剂量组肾小管出现明显颗粒变性，管腔中有许多红染蛋白质物质，出现管型。部分肾小管壁细胞结构被破坏。高剂量组肾小管上皮坏死、崩解、脱落于管腔中。因此在铜离子作为饲料的添加剂，要确定好铜的含量。参考文献1王长青，李靖爱宋茜育成猪微量元素铜中毒的诊治J当代畜牧，2003，4331332王宗元动物营养代谢病和中毒病学J北京中国农业出版社1997，2（1）583王幼明，王小龙高钢的应用对畜禽的慢性中毒作用及对环境生态的影响J中国兽医杂志2005，37636384刘璐饮食铜的供给、状态及吸收P国外医学一地理分册1997，18L15205朱秀琴，张德寿鸡铜中毒的临床病理学研究J中国兽医科技2005，251211166刘成文，张怀礼，魏登山猪铜中毒的诊断J中国兽医杂志2001，37353547姚远峰猪谧用饲料添加剂引起铜中毒J广西畜牧兽医199713359638李建喜,王学智,杨志强钼和铜对小鼠抗氧化机能的影响J中国兽医科技,2004,221111159崔恒敏