中间型地中海贫血证候规律与方证效应的分子机制

密级密单位代码84502分类号学号845022005011318中国中医科学院二零零五级博士研究生学位论文中间型地中海贫血证候规律与方证效应的分子机制申请人王文娟指导教师吴志奎研究员专业中西医结合基础（分子生物学）研究方向肾生髓、髓生血理论与治疗地中海贫血临床实践中国中医科学院广安门医院2008年4月北京原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成的，文中除注明引用的内容外，不包含其他已经发表的科研成果。对本文研究做出重要贡献者，已在文中以明确方式表明。本声明的法律责任完全由自己承担。论文作者签名导师签名日期200851关于学位论文使用授权的声明本人完全知道中国中医科学院有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅或借阅。本人授权中国中医科学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名日期200851目录中文摘要1ABSTRACT7英文缩略语13文献综述17一、中医五脏生血理论及其临床应用与研究17二、地中海贫血现代医学研究进展23三、地中海贫血中医药研究进展30前言36临床研究38第一部分中间型地中海贫血患者中医证候分布规律研究381材料与方法382研究结果403讨论44第二部分中间型地中海贫血患者遗传背景与中医证候关系的研究47一、中间型地中海贫血患者基因型与中医证候的关系471材料与方法472研究结果473讨论52二、中间型地中海贫血患者中医证候的家系调查561材料与方法562研究结果563讨论59第三部分益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血临床研究62一、益髓生血颗粒治疗HBH病安慰剂平行对照研究621材料与方法622研究结果643讨论66二、益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血治疗前后自身对照研究681材料与方法682研究结果693讨论71临床研究小结73实验研究益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血疗效分子机制研究75一、益髓生血颗粒对中间型地中海贫血患者外周血红细胞膜蛋白MRNA表达的影响751材料与方法752研究结果783讨论82二、益髓生血颗粒对HBH病患者外周血红细胞膜蛋白组分的影响861材料与方法862研究结果903讨论92三、益髓生血颗粒对HBH病患者外周血红细胞膜过氧化损伤的影响961材料与方法962研究结果983讨论99四、益髓生血颗粒对HBH病患者外周血红细胞包涵体的影响1041材料与方法1042研究结果1053讨论107五、益髓生血颗粒对中间型地中海贫血患者骨髓幼稚红细胞DNA结构的影响1091材料与方法1092研究结果1103讨论111实验研究小结114结语116致谢121个人简历123附件1125附件2135中文摘要地中海贫血属世界上发病率高、危害最大的单基因遗传病之一，至今尚无有效治疗办法，我国南方也是本病的高发区。导师吴志奎教授从七十年代开始一直致力于肾生髓理论现代研究，首次提出“中医肾生髓、髓生血是中医药治疗地中海贫血的理论核心”这一假说，采用补肾益髓法的代表方益髓生血颗粒在广西高发区治疗地中海贫血取得了肯定的疗效，并从整体效应基因突变与疗效关系调控珠蛋白基因表达等不同层面深入研究了疗效的分子机制，验证了该理论假说的客观性，使中医药治疗地中海贫血整体水平达到了国际领先。本研究是在前期工作的基础上，以国家自然科学基金重大研究计划资助课题为依托开展的。我们对中间型地中海贫血患者的中医证候分布规律与特点、中医证候与遗传背景的关系等进行了较大样本的研究；并在益髓生血颗粒治疗地中海贫血的基础上，拓展到治疗HBH病的临床规范研究；在该药取得显著临床疗效的基础上，针对地中海贫血患者红细胞寿命短、溶血性贫血的临床特点，采用透射电镜、激光扫描共聚焦显微镜图像分析、REALTIMEPCR、SDSPAGE、脂质过氧化物含量及抗氧化酶活力检测等技术，从红细胞膜骨架蛋白组成及表达、红细胞膜氧化损伤、红细胞包涵体、幼稚红细胞DNA荧光强度等方面，从红细胞结构与功能角度探讨了益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血方证效应的分子机制，取得了有重要学术价值的研究结果1主要研究结论11中间型地中海贫血患者中医证候分布规律研究通过对168例中间型地中海贫血患者中医证候分布规律的研究，初步明确了中间型地贫患者的基本临床表现为自汗、口干咽燥、面色淡白或萎黄、爪甲色淡、倦怠乏力、潮热盗汗、易于感冒、心悸、舌质淡红、舌苔薄白、脉细数，其基本中医证型为精血亏虚、肝肾阴虚证。同时还发现，中间型地贫患者的中医证候积分与中医证型、血液参数RBC和HB水平、年龄等存在一定的关系，中医证型的分布与切脾与否亦存在一定的关系。这一研究结果可以为地中海贫血的中医辨证治疗提供一定的参考依据。12中间型地中海贫血患者遗传背景与中医证候关系的研究1）通过对166例中间型地中海贫血患者基因突变型和中医证候的关系进行分析，结果表明临床表型为0的中间型地贫、带有非缺失型突变的HBH病患者的中医证候（临床表现）较为严重，说明中间型地中海贫血患者中医证型的分布、中医证候积分的高低与基因突变型存在密切的关系。2）通过对地中海贫血73个家系共198人进行基因突变型检测与中医证候调查，结果表明中间型地贫患者（子代）其基因型或是与亲代中一人完全相同，或是为两个亲代的双重杂合，其中医证候（临床表现）都较亲代严重，子代血虚表现明显，而亲代则不明显。这种临床表现的差异可能与患者的基因突变型、遗传修饰成分等都有关系。中医证候与遗传背景关系的研究结果提示我们中间型地中海贫血患者的中医证候一定程度上受基因突变型的影响，但同时还可能受一些遗传修饰成分的影响。该研究结果为地中海贫血的中医辩证治疗提供了科学依据。13益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血临床研究1）通过对59例表现为精血亏虚、肝肾阴虚证的HBH病患者进行随机、安慰剂平行对照研究，结果显示HBH病患者经益髓生血颗粒治疗后，疗效性血液指标HB、RBC均明显提高（P005）；益髓生血颗粒治疗组中医证候量化评分较安慰剂组明显降低（P005），说明中药益髓生血颗粒能够改善地贫患者的溶血程度不是通过调节红细胞膜蛋白的组分，而是通过影响红细胞膜蛋白的基因表达来实现的。3）通过对22例HBH病患者益髓生血颗粒治疗前、后及22例正常人的红细胞膜脂质过氧化产物MDA含量以及红细胞内的抗氧化酶活力进行检测，发现HBH病患者与正常人比较，外周血红细胞中总SOD及GSHPX活力明显升高（P005），其原因可能有二，一是由于地贫红细胞中氧自由基较多，使SOD及GSHPX活力均代偿性升高，一定程度抑制了红细胞膜的脂质过氧化损伤；二是由于地贫红细胞寿命明显缩短，仅为正常红细胞寿命的1/4，患者外周血中分布的红细胞多为年轻红细胞，相应地膜过氧化损伤也稍轻。经中药益髓生血颗粒治疗后，HBH病患者SOD活力较治疗前明显增加（P005）。实验结果表明，益髓生血颗粒抗红细胞膜过氧化损伤，减轻红细胞溶血主要是通过明显提高HBH病患者外周血红细胞中SOD活力达到的。4）通过对6例HBH病患者益髓生血颗粒治疗前、后外周血红细胞包涵体进行透射电镜观察，发现HBH病患者外周血红细胞中分布有大量由过剩的珠蛋白链聚合而成的包涵体。经中药益髓生血颗粒治疗后，患者外周血红细胞中包涵体的数量与体积明显减少。研究表明益髓生血颗粒能明显减少HBH病患者外周血红细胞中的包涵体，从而有效改善患者的溶血程度。5）通过对4例中间型地中海贫血患者（地贫2例、HBH病2例）益髓生血颗粒治疗前、后及2例正常人的骨髓幼稚红细胞涂片进行激光扫描共聚焦观察，发现中间型地中海贫血患者骨髓幼稚红细胞核DNA缺损，与正常人比存在明显的凋亡现象。经中药益髓生血颗粒治疗后，患者骨髓幼稚红细胞核DNA缺损程度明显减轻。表明益髓生血颗粒能够影响骨髓幼稚红细胞的形态与结构，具有保护骨髓、促进造血的作用。通过从红细胞结构与功能这一角度，探讨中药益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血的疗效分子机制，实验结果表明益髓生血颗粒可通过促进红细胞膜蛋白的基因表达、对抗红细胞膜过氧化损伤、减轻红细胞包涵体（变性珠蛋白链）的沉积、增强骨髓幼稚红细胞核DNA的荧光强度等途径，有效地延长了地贫红细胞的寿命，减轻了地贫红细胞的溶血程度。该结果与临床研究结果相互印证，进一步验证了中医肾生髓、髓生血理论的客观性，并从分子水平揭示了其科学内涵。2主要创新点本研究的创新之处有以下几点1）首次系统地对中间型地中海贫血患者的基因突变型及中医证候分布规律进行较大样本的调查，总结提出了中间型地中海贫血中医证候分布的一般规律和临床特点、中医证候与遗传背景的关系，为地中海贫血的中医辩证治疗提供了科学的依据。在国内外地中海贫血的临床研究中未见同类报道。2）对73个家系共198人进行子代、亲代基因突变型检测和中医证候调查研究，分析了遗传背景、先天禀赋与中医证候的关系，发现子代比亲代临床血虚表现严重，这种临床表现的差异与基因突变型、遗传修饰成分等有关。该研究属国内外首次完成。3）在高发区采用安慰剂平行对照法研究益髓生血颗粒对精血亏虚、肝肾阴虚证的中间型地贫的临床疗效，证实益髓生血颗粒不仅可以有效治疗地贫，而且对证型相符的地贫也有明显的疗效。该研究结果体现了中医方证相应、异病同治的原则，拓展了中医药治疗单基因遗传病的手段，在地中海贫血临床研究中未见同类报道。4）从地贫患者红细胞膜骨架蛋白的表达、红细胞膜过氧化损伤、红细胞包涵体、骨髓幼稚红细胞DNA荧光强度等红细胞结构与功能的角度，探讨了中药益髓生血颗粒治疗中间型地中海贫血，促进有效红细胞生成，延长红细胞寿命，减轻红细胞溶血的分子机制，在地中海贫血疗效机制研究中未见同类报道。5）本研究从中间型地中海贫血中医证候分布规律，遗传背景与中医证候的关系，应证方剂与不同类型疗效分析，以及证型特点的分子基础研究等方面拓展了中医药治疗地中海贫血的方法手段，从一个侧面揭示了中医药治疗地中海贫血的科学性及其理论的科学内涵，使已领先的中医药治疗地中海贫血研究增加了新的亮点，研究为国际单基因遗传病临床治疗提供了新思路。关键词肾生髓理论；中间型地中海贫血；益髓生血颗粒；中医证候；临床疗效；分子机制；家系ABSTRACTBETATHALASSEMIAISANINHERITEDDISORDEROFHEMOGLOBINSYNTHESIS,WHICHCAUSESAHIGHWORLDWIDEMORBIDITYTODAYWESTILLHAVINGNOEFFECTIVEMEANSTOCUREITINTHESOUTHPROVINCESOFCHINATHEREARELOTSOFTHALASSEMICPATIENTSMYMENTORPROFESSORZHIKUIWU,FROMTHE70YEARSTONOWHAVINGENGAGEDINTHEMODERNRESEARCHOF“SHENSHENGSUITHEORY”HEPRESENTEDAHYPOTHESISTHAT“THESHENSHENGSUITHEORYISTHENUCLEARTHEORYWHICHDIRECTINGTHETHERAPYOFTHALASSEMIAWITHTCMMETHODS”THEHYPOTHESISWASPROVEDTOBEOBJECTIVEBYTWOWAYS,ONEISUSINGYISUISHENGXUEGRANULETOTREATBETATHALASSEMIAANDOBTAININGPOSITIVECURATIVEEFFECT,THEOTHERISSTUDYINGTHEMOLECULARMECHANISMOFCURATIVEEFFECTFROMTHREEDIFFERENTLAYERSTHEWHOLERESPONSES,THERELATIONBETWEENGENOTYPEANDCURATIVEEFFECT,THEGENEEXPRESSIONANDREGULATIONTHISRESEARCHWASCARRIEDOUTONTHEBASEOFTHEEARLIERSTUDIES,ANDWASSUPPORTEDBYNSFCWERESEARCHEDTHEDISTRIBUTINGCHARACTERANDREGULARITYOFTCMSYNDROMES,THERELATIONOFTCMSYNDROMESTOGENETICBACKGROUNDSINPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIA,ANDDEVELOPEDTHETCMMETHODSTOTREATINGHBHDISEASEANOTHERTHALASSEMICTYPEBASEONTHEMARKEDCURATIVEEFFECT,WEEXPLOREDTHEMOLECULARMECHANISMFROMTHEPOINTOFREDCELLSFUNCTIONANDSTRUCTURE,SUCHASTHEMEMBRANEPROTEINCOMPONENTSANDMRNAEXPRESSION,THEMEMBRANEOXIDATIVEDAMAGE,THEINCLUSIONBODIES,ANDTHEINTENSITYOFDNAFLUORESCENCEINERYTHROIDPRECURSORS,BYUSINGTHETECHNIQUESOFTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPY,LASERCONFOCALMICROSCOPY,REALTIMEPCR,SDSPAGE,MDACONTENTSANDANTIOXIDATIVEENZYMEACTIVITIESDETECTIONSWEHAVEOBTAINEDHIGHACADEMICVALUABLEDATA1THEPRIMARYRESEARCHCONCLUSIONS11STUDYONDISTRIBUTIVEREGULARITYOFTCMSYNDROMESINPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIABYEXPLORINGTHEDISTRIBUTIVEREGULARITYOFTCMSYNDROMESIN168PATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIA,WEFINDTHATTHEBASICCLINICALMANIFESTATIONSINPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIAARESPONTANEOUSPERSPIRATION,DRYMOUTHANDTONGUE,PALEORSALLOWCOMPLEXION,PALEFINGERNAILS,LASSITUDE,TIDALFEVERANDNIGHTSWEAT,FREQUENTATTACKOFCOLD,PALPITATION,LIGHTREDTONGUEBODY,THINORWHITETONGUECOATING,THREADYORRAPIDPULSETHEMAINSYNDROMICTYPEOFTHALASSEMIAINTERMEDIAISDEFICIENCYOFESSENCE,BLOOD,THEKIDNEYYINANDTHELIVERYINFURTHERMORE,SOMECORRELATIONFACTORSSUCHASAGE,SPLENECTOMIZEDORNONSPLENECTOMIZED,THELEVELSOFRBCANDHBCANAFFECTONTHEDISTRIBUTIONOFTCMSYNDROMES12STUDYONRELATIONBETWEENTCMSYNDROMESANDGENETICBACKGROUNDSINPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIA1）BYANALYZINGTHERELATIONBETWEENTCMSYNDROMESANDGENETICBACKGROUNDSIN166PATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIA,WEFINDTHATIFTHEPHENOTYPEOFPATIENTSWITHBETATHALASSEMIAINTERMEDIAIS0ORWITHALPHATHALASSEMIAINTERMEDIAISNONDELETIONALMUTATIONS,THEYWILLHAVEMORESEVERESYMPTOMSTHISINDICATESTHATTHEDISTRIBUTIONOFTCMSYNDROMICTYPEANDTHESYNDROMICSCORESHAVECLOSERELATIONTOGENOTYPE2）BYDETECTINGTHEGENOTYPEOFBETATHALASSEMIAIN73FAMILIESATOTALOF198PEOPLES,INVESTIGATINGTHEIRTCMSYNDROMES,WEFINDTHATTHEOFFSPRINGSGENOTYPEISTHESAMEASONEOFTHEIRPARENTSORISTHEDOUBLEHETEROZYGOUSOFTHEIRPARENTS,THEIRTCMSYNDROMESCLINICALMANIFESTATIONSAREMORESEVERETHANTHEIRPARENTSTHEOFFSPRINGSHAVEEVIDENTDEFICIENCYOFBLOOD,BUTTHEIRPARENTSARENOTTHEDIFFERENCEOFCLINICALMANIFESTATIONSMAYBERELATEDTOTHEGENICMUTATIONSANDOTHERGENETICMODIFIEDINGREDIENTSTHERESULTSOFSTUDYONRELATIONBETWEENTCMSYNDROMESANDGENETICBACKGROUNDSINPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIAINDICATETHATTHETCMSYNDROMESOFTHALASSEMIAINTERMEDIAPATIENTSAREINFLUENCEDBYGENICMUTATIONSANDOTHERGENETICMODIFIEDINGREDIENTSTHISSTUDYPROVIDESASCIENTIFICBASISTOTCMDIALECTICALTHERAPYWITHTHALASSEMIA13CLINICALRESEARCHONTREATINGTHALASSEMIAINTERMEDIAWITHYISUISHENGXUEGRANULE1）BYUSINGRANDOMIZEDPLACEBOPARALLELCONTROLLEDTRIALTOTREAT59HBHDISEASEPATIENTSWITHYISUISHENGXUEGRANULE,WEFINDTHATCOMPAREDTOTHATOFBEFORETREATMENT,AFTERTHREEMONTHSTREATED,THEBLOODINDEXESHB、RBCANDTHETCMSYMPTOMSOFPATIENTSINTHEYISUISHENGXUEGRANULEGROUPARESTATISTICALLYDIFFERENTP005THETOTALEFFECTIVERATEINTHEYISUISHENGXUEGRANULEGROUPBEING778,INTHEPLACEBOPARALLELCONTROLGROUPONLYBEING156,THETWOGROUPSHAVESIGNIFICANTDIFFERENTP005）THISINDICATESTOUSYISUISHENGXUEGRANULEREDUCETHEDEGREEOFHEMOLYSISMAYBEBYAFFECTINGTHEGENEEXPRESSION,NOTBYTHEPROTEINEXPRESSION3）BYDETECTINGTHEMDACONTENTSANDANTIOXIDATIVEENZYMEACTIVITIESIN22PATIENTSOFHBHDISEASEBEFOREANDAFTERTHETREATMENTWITHYISUISHENGXUEGRANULEAND22NORMALCONTROLS,WEFINDTHATTHEACTIVITIESOFSODANDGSHPXINPATIENTSWITHHBHDISEASEAREMOREHIGHERTHANTHATINNORMALCONTROLS（P005）THISINDICATESTHATTHEREARECOMPENSATORYMECHANISMSINHBHERYTHROCYTESTOCOPEWITHINCREASEDGENERATIONOFOXYGENFREERADICALSAFTERTREATEDWITHYISUISHENGXUEGRANULE,THEACTIVITIESOFSODHAVEANAPPARENTINCREASE（P005）THISRESULTINDICATESTHATYISUISHENGXUEGRANULECANPREVENTTHEREDCELLSFROMOXIDATIVEDAMAGEMAINLYBYINCREASINGTHEACTIVITIESOFSOD4）BYTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPY,WEOBSERVEDTHEREDCELLSINCLUSIONBODIESIN6PATIENTSOFHBHDISEASEBEFOREANDAFTERTHETREATMENTWITHYISUISHENGXUEGRANULEWEDISCOVERTHATINTHEREDCELLSTHEREAREPLENTYOFINCLUSIONBODIES,WHICHAREFORMINGBYTHETHEUNMATCHEDBETAGLOBINCHAINAFTERTREATEDWITHYISUISHENGXUEGRANULE,THEAMOUNTANDVOLUMEOFINCLUSIONBODIESHAVEANAPPARENTDECREASETHISINDICATESTHATYISUISHENGXUEGRANULECANREDUCETHEREDCELLSINCLUSIONBODIES,IMPROVETHEINTRAMEDULLARYHEMOLYSISANDRBCDESTRUCTIONINTHEPERIPHERALBLOOD5）BYLASERCONFOCALMICROSCOPY,WEOBSERVEDTHEINTENSITYOFDNAFLUORESCENCEINERYTHROIDPRECURSORSIN4PATIENTSOFTHALASSEMIAINTERMEDIABEFOREANDAFTERTHETREATMENTWITHYISUISHENGXUEGRANULEAND2NORMALCONTROLSWEFINDTHATTHEINTENSITYOFDNAFLUORESCENCEINTHALASSEMICERYTHROIDPRECURSORSAREWEAKERTHANTHATINNOMALCONTROLSAFTERTREATEDWITHYISUISHENGXUEGRANULE,THEINTENSITYOFDNAFLUORESCENCEINTHALASSEMICERYTHROIDPRECURSORSBECOMESSTRONGER,BEINGSIMILARTOTHATINNORMALCONTROLSTHISINDICATESTHATYISUISHENGXUEGRANULECANPROTECTTHESHAPEANDSTRUCTUREOFTHALASSEMICERYTHROIDPRECURSORS,PROMOTEHEMOPOIESISFROMTHEPOINTOFREDCELLSFUNCTIONANDSTRUCTURETOEXPLORETHEMOLECULARMECHANISMOFYISUISHENGXUEGRANULEINTREATINGPATIENTSWITHTHALASSEMIAINTERMEDIA,THERESULTSINDICATETHATYISUISHENGXUEGRANULECANIMPROVETHEGENEEXPRESSIONOFMEMBRANESKELETONPROTEINS,INCREASETHEACTIVITIESOFSOD,REDUCETHEINCLUSIONBODIESOFREDCELLS,INCREASETHEINTENSITYOFDNAFLUORESCENCEINTHALASSEMICERYTHROIDPRECURSORSTHESERESULTSAREINACCORDANCEWITHTHECLINICALRESEARCH,PROVETHETCMTHEORY“SHENSHENGSUI,SUISHENGXUE”TOBEOBJECTIVE,ANDREVEALITSSCIENTIFICCONTENTFROMTHEMOLECULARLEVELKEYWORDSTHEORYOFSHENSHENGSUITHALASSEMIAINTERMEDIAYISUISHENGXUEGRANULETCMSYNDROMESCLINICALCURATIVEEFFECTMOLECULARMECHANISMGENEALOGY英文缩略语英文缩写英文全称中文全称ACRACRYLAMIDE丙烯酰胺HBHALPHAHEMOGLOBINHDISEASE珠蛋白生成障碍性贫血血红蛋白H病ANK1ANKYRIN1锚蛋白AHSPALPHAHEMOGLOBINSTABILIZINGPROTEIN血红蛋白稳定蛋白APSAMMONIUMPERSULFATE过硫酸铵BISN,NMETHYLENEBISACRYLAMIDE甲叉双丙烯酰胺CATCATALASE过氧化氢酶CDNACOMPLEMENTARYDNA互补DNABFUEBURSTFORMINGUNITERYTHROID红系爆式集落形成单位CFUECOLONYFORMINGUNITERYTHROID红系集落形成单位CRFCASEREPORTFORM临床病例报告表CSFCOLONYSTIMULATINGFACTOR集落刺激因子CTTHRESHOLDCYCLE循环阈值DDH2ODISTILLEDDEIONIZEDWATER蒸馏去离子水DEPCDIETHYLPYROCARBONATE焦碳酸二乙酯DNADEOXYRIBONUCLEICACID脱氧核糖核酸DTNB5,5DITHIOBISNITROBENZOICACID二硫代二硝基苯甲酸EPOERYTHROPOIETIN促红细胞生成素FEPFREEERYTHROCYTEPROTOPORPHYRIN红细胞游离原卟啉GATA1GATA1TRANSCRIPTIONFACTOR红系特异转录因子1GATA2GATA2TRANSCRIPTIONFACTOR红系特异转录因子2GMGRANULOCYTEMONOCYTE粒细胞单核细胞GMCFUGRANULOCYTEMONOCYTECOLONYFORMINGUNIT粒细胞单核细胞集落形成单位GSHGLUTATHIONE谷胱甘肽GSHPXGLUTATHIONEPEROXIDASE谷胱甘肽过氧化物酶HBHEMOGLOBIN血红蛋白HBAHEMOGLOBINA血红蛋白AHBA2HEMOGLOBINA2血红蛋白A2HBFFETALHEMOGLOBIN胎儿血红蛋白HBHHEMOGLOBINH血红蛋白HHCLHYDROCHLORICACID盐酸HCTHEMATOCRIT红细胞压积HPFHHEREDITARYPERSISTENCEOFFETALHEMOGLOBIN遗传性持续胎儿血红蛋白综合症H2OWATER水H2O2HYDROGENPEROXIDE过氧化氢HS2HYPERSENSITIVESITES2高敏位点2MDAMALONYLDIALDEHYDE丙二醛MRNAMESSENGERRNA信使RNANCBINATIONALCENTERFORBIOTECHNOLOGYINFORMATION美国国立生物技术信息中心NFE2NUCLEARFACTORERYTHROID2红细胞核因子2O2OXYGEN氧O2SUPEROXIDEANIONRADICAL超氧阴离子自由基ODABSORBANCE吸光度PAGEPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链式反应PCPHOSPHATIDYLCHOLINE磷脂酰胆碱PEPHOSPHATIDYLETHANOLAMINE磷脂酰乙醇胺PSPHOSPHATIDYLSERINE磷脂酰丝氨酸PLTPLATELETCOUNT血小板计数RBCREDBLOODCELLCOUNT红细胞计数REALTIMEPCRREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION实时荧光定量聚合酶链反应RETRETICULOCYTE网织红细胞RNARIBONUCLEICACID核糖核酸SCFSTEMCELLFACTOR干细胞因子SDSSODIUMDODECYLSULPHATE十二烷基磺酸钠SFSERUMFERRITIN血清铁蛋白SODSUPEROXIDEDISMUTASE超氧化物歧化酶SPTA1SPECTRIN收缩蛋白SPTBSPECTRIN收缩蛋白SMSPHINGOMYELIN鞘磷脂TBATHIBABITURICACID硫代巴比妥酸TEMEDTETRAMETHYLETHYLENEDIAMINEN,N,N,N四甲基乙二胺文献综述一、中医五脏生血理论及其临床应用与研究血是循行于脉中而富有营养的红色液态物质，是构成人体和维持人体生命活动的基本物质之一1。血液运行于人体的脉道之中，循环不已，流布全身，为全身各脏腑组织器官提供了丰富的营养，因此血对人生命的维持、生理机能的发挥都起到了重要的作用。查阅中医历代文献，古人均从不同角度直接或间接地阐述了五脏在血液化生中的作用，经后世医家不断补充，逐渐形成了中医五脏生血理论。1五脏生血理论内涵11脾胃为气血生化之源水谷精微是化生血液的基本物质之一，包括营气和津液。营气化血，灵枢邪客篇2说“营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血”；金匮要略心典3也说“营者血之源”。津液化血，读书随笔4中说“津亦水谷所化，其浊者为血，清者为津”。营气和津液都是脾胃将摄入的饮食物进行运化转输而生成的，因此脾胃的运化功能在血液生成的过程中发挥着重要的作用，被称为“气血生化之源”。灵枢决气2云“中焦受气取汁，变化而赤，是谓血”。此处“中焦”指脾胃，“受气”就是脾胃受纳运化饮食物，“取汁”就是吸收其中的精微物质，“变化而赤”就是精微物质进入脉中化生为血液。景岳全书5云“血者，水谷之精气也，源源而来，而实生化于脾。”亦指出了脾胃在化生血液中的重要作用。脾胃通过运化功能，为血液的生成不断地提供着物质原料，因此脾胃运化功能的强弱直接影响着血液的化生。若脾胃运化功能长期失调，则可导致血液生成不足而形成血虚。12肺之气化蒸变与血的化生肺主一身之气，参与宗气的生成。脾胃运化的水谷精微要转输到肺，与肺吸入的清气相结合，经肺气的化合，贯注于脉中，才能变化成为红色的血液。医家秘奥6中提到“中气上升于肺而为气，从肺回下则化为血。”指出了肺在化生血液中的重要作用。灵枢营卫生会2中说“中焦亦并胃中，出上焦之后，此所受气者，泌糟粕，蒸津液，化其精微，上注于肺脉，乃化而为血”，即是说中焦水谷精气的化生，起源于脾胃之腐熟运化功能，而所受纳的水谷，必须经过“泌别糟粕”和“蒸发津液”的消化吸收过程，方能转化成水谷精微，且向上输注于肺脉，经肺的气化、蒸变、升降，将精微与津液合而成为血液。13心阳化赤以为血脾胃运化的水谷精微与肺吸入的清气结合后，还要贯注于心脉，在心气的作用下变化而成为红色的血液。血证论阴阳水火气血论7云“食气入胃，脾经化汁，上奉心火。火得之，变化而赤，是之为血”。清张志聪侣山堂类辨辨血8云“血乃中焦之汁，流溢于中以为精，奉心化赤而为血。”医碥血9提到“血色独红者，血为心火之化。”血证论阴阳水火气血论7指出“血色者，火赤之色也。火者，心之所主，化生血液，以濡周身，火为阳而生血之阴。”均说明心脏的生理功能参与血液的生成。14肾精骨髓可化血病机沙篆10中说“血液之源在于肾”。侣山堂类辨8亦指出“肾为水脏，主藏精而化血”，说明血液的生成与肾密切相关，肾所藏之精是化生血液的重要物质。肾的化血功能具体表现为肾精化血、骨髓化血和肾阳的推动温煦作用。景岳全书5中说“血即精之属也，但精藏于肾，所蕴不多，而血富于冲，所至皆是”。类经脏象类11云“精足则血足”。均说明肾藏精，精能生血。张氏医通诸血门诸见血证12云“经言血之与气，异名同类，虽有阴阳清浊之分，总由水谷精微所化，其始也混然一区，未分清浊，得脾气之鼓运，如雾上蒸于肺而为气；气不耗，归精于肾而为精；精不泄，归精于肝而化清血；血不泄，归精于心，得离火之化而为真血”，指出了精气血的密切关系。故肾中精气充盈，则血液化生有源。若肾精不足，化血乏源则往往导致血液生成不足。唐宗海在中西汇通医经精义13中指出“盖髓者,肾精所生,精足则髓足”。素问生气通天论云“肾主骨，骨者髓之府”。素问生气通天论2云“骨髓坚固，气血皆从。说明肾藏精、主骨，精能生髓，髓充养于骨，而骨髓又可化生为血液。此外，肾阳具有推动、激发各脏腑生理功能的作用。脾阳根于肾阳，通过肾阳的温煦、推动可促进脾胃化生水谷精微，进而奉心化赤为血。如读医随笔4所说“夫血者，水谷之精微，得命门真火蒸化，以生长肌肉皮毛者也”。15肝藏血而又生血素问六节脏象论2说“肝者其充在筋，以生气血”，说明肝不仅能藏血，而且还能生血。肝的生血功能需与其他脏腑密切配合方能完成，具体表现为肝肾精血互生互化，即“肝肾精血同源”。肝藏血，肝血可养肾精。如诸病源侯论虚劳诸候14说“肾藏精，精者，血之所成也。”赤水玄珠15中云“夫血者，水谷之精气也，和调于五脏，洒陈于六腑，男子化而为精，女子上为乳汁，下为经水”。读医随笔4说“精者，血之精微所成”。故肝所藏之血充盈，则肾有所藏，精有所资。肾藏精，肾精亦可化肝血。肾中精气充盛，则肝有所养，血有所充。总之，血液的化生是一个复杂的过程，是以水谷精微和肾精为基本物质。水谷精微化血要在脾胃、心、肺等脏腑的共同作用下才能完成。饮食进入脾胃后，需经过脾胃的运化功能，吸收其中的精微物质，将其转输至心肺，与肺吸入的清气结合，再经心火的化赤，才能变为红色的液态物质，入于脉中即为血液。而肾精化血则主要与肝、肾两脏的功能密切相关。因此，血液的化生有赖于脾胃、心、肺、肝、肾正常生理功能的发挥，只有这五脏的生理功能正常，血液才能源源不断地得到化生。2五脏生血理论的临床应用与研究五脏生血理论对血虚的临床治疗具有重要的指导作用。血虚是血液不足或濡养功能减退的一种病理状态，因血生于脾，统于心，藏于肝，化于肾，故血虚多与心、肝、脾、肾密切相关。根据中医“虚者补之，损者益之”的原则，补血法为治疗血虚的基本方法。临床医家多根据五脏生血理论采用治五脏以补血的方法，如补心养血、养肝补血、补脾益血、补肾生血等，逐渐形成了一些有效治疗血虚的临床常用方剂。21补脾益血法补脾益血是补益脾胃中焦之气，以滋生血之源。血证论云“滋血尤须补脾胃”7。适用于因脾虚血亏而引起的气短、纳少、头晕、心悸、四肢倦怠乏力、消瘦、面色白或萎黄等。临床常用代表方有归脾汤、人参养荣汤等。归脾汤在临床上对于缺铁性贫血、营养不良性贫血、失血性贫血及原发性再生障碍性贫血、慢性肾病引起的贫血等有效16。人参养荣汤对再生障碍性贫血、妊娠贫血有效17。戴琼18采用健脾生血冲剂治疗缺铁性贫血，发现该药能升高患者的血红蛋白（HB）、血清铁蛋白（SF），降低红细胞内游离血卟啉（FEP），总有效率高于硫酸亚铁冲剂P800109/L者应给予阿司匹林、潘生丁等抗凝治疗。33基因活化药物治疗地贫虽然珠蛋白基因缺损，但其上游的胎儿珠蛋白基因保持完整，而HBF分子在成人体内仍然具有正常功能。因而近年来研究药物在成人红细胞中激活胎儿珠蛋白基因的表达，并进一步刺激合成具有正常功能的HBF，已成为治疗重型地贫的新探索12,13。5氮胞苷、马利兰14虽能使地贫患者珠蛋白合成增加，但由于其严重的毒副作用限制了进一步的临床应用。羟基脲15虽是一种低毒、有效的珠蛋白基因激活剂，但患者对该药的反应程度和速度差异较大。红细胞生成素需与其他有独立诱导胎儿血红蛋白（HBF）合成增加的药物联合应用才能显示协同作用。也有人用丁酸类药物16，如丁酸钠、正丁酸钠、正丁酸、氨基丁酸等进行治疗，但因其半衰期极短而阻碍了临床上的应用。阿糖胞苷、长春新碱、三尖杉酯碱可使珠蛋白链合成增加，但目前仅限于实验研究17,18。34肽链合成抑制剂17,18国内有人采用具有抑制肽链合成，纠正地贫肽链合成失衡作用的异烟肼治疗地贫，取得了一定的临床疗效，但不适合治疗其它类型的地中海贫血。35抗氧化药物治疗17,18地贫红细胞内相对过剩的珠蛋白链容易发生自身氧化，产生并释放大量氧自由基，从而介导红细胞膜发生脂质过氧化损伤，加重溶血。国内外有人采用具有抗氧化功能的药物，如维生素E、维生素C、阿魏酸钠等进行治疗，对地中海贫血有一定的辅助治疗作用。36造血干细胞移植19,20造血干细胞移植目前被认为是根治重型地贫的最佳方法，具体包括骨髓移植、脐血移植、外周血造血干细胞移植。但骨髓移植成功率很低，与患者HLA相合的骨髓难以寻觅，且治疗费用很昂贵。脐血移植虽然较骨髓移植的移植物抗宿主病（GVHD）轻，发生率低，但如何降低移植排斥率和移植死亡率以及昂贵的治疗费用，仍然限制了其在临床上的使用。外周血造血干细胞移植治疗某些遗传病、血液病及实体瘤近来也有报道，但患者发生慢性GVHD的机会增多，其治疗效果仍需进一步临床实验加以完善。37基因治疗21,22随着对地贫发病机制的深入研究，地贫成为了最早被尝试用于基因治疗的疾病之一。一般基因治疗的模式是将地贫患者的造血干细胞取出，在体外导入并整合正常的珠蛋白基因后再植入患者体内，使转移的珠蛋白基因随干细胞分化获得红细胞特异的高水平表达，达到治疗地贫的目的。但因同源重组率很低而很难进行，临床应用尚需时日。参考文献1张俊武,龙桂芳主编血红蛋白与血红蛋白病广西广西科学技术出版社,20031562152BUNNHF,FORGETBGHEMOGLOBINMOLECULAR,GENETICANDCLINICALASPECTSSAUNDERS,PHILADELPHIA,19863WEATHERALLDJTHALASSEMIA,INTHEMOLECULARBASISOFBLOODDISEASES,3RDED,EDITEDBYGSTAMATOYANNOPOULOS,AWNIENHUIS,PWMAJERUS,HVARMUSSAUNDERS,PHILADELPHIA,20004ALAINJTHALASSEMIASANDRELATEDDISORDERSBAYLORUNIVERSITYMEDICALCENTERPROCEEDINGS,2007,20127315ROUYERFP,SCOTTMD,LEROYVK,ETALANNNYACASSCI,1990,612SUPPL1061176SHINARE,SHALEVO,RACHMILEWITZEA,ETALERYTHROCYTEMEMBRANESKELETALABNORMALITIESINSEVERETHALASSEMIABLOOD,1987,701587YUANJ,RUBINE,ALJURFM,ETALDEFECTIVEASSEMBLYOFMEMBRANEPROTEINSINERYTHROIDPRECURSORSOFBETATHALASSEMICMICEBLOOD,1994,8426326378ZEREZCR,TANAKAKRIMPAIREDERYTHROCYTENADSYNTHESISAMETABOLICABNORMALITYINTHALASSEMIAAMJHEMATOL,1989,321179BOOKCHINRM,ORTIZOE,SHALEVO,ETALCALCIUMTRANSPORTANDULTRASTRUCTUREOFREDCELLSINTHALASSEMIAINTERMEDIABLOOD,1988,725160210FABRYOVAVNEWVIEWSONTHEETIOPATHOGENESISOFBETATHALASSEMIAVNITRLEK1992,38659860211SCHRIERSL,ANGELUCCIENEWSTRATEGIESINTHETREATMENTOFTHETHALASSEMIASANNUREVMED,2005,5615717112OLIVIERINFREACTIVATIONOFFETALHEMOGLOBININPATIENTSWITHTHALASEMIASEMINHEMATOL,1996,33244213WOODWGWEATHERALLDJDEVELOPMENTALGENETICSOFTHEHUMANHEMOGLOBINSBIOCHEMJ,1983,21511014梁植权,刘利娟,杨克恭,等试用马利兰治疗地中海贫血中国医学科学院学报,1991本山,方亦兵,郑敏翠,等羟基脲治疗地中海贫血临床研究中华临床新医学,2005,51353616PERRINESP,GINDERGD,FALLERDV,ETALASHORTTERMTRIALOFBUTYRATETOSTIMULATEFETALGLOBINGENEEXPRESSIONINTHEGLOBINDISORDERSNENGLJMED,1993,3282818617钟永,张锦地中海贫血治疗进展国外医学儿科学分册,1994,212707318张新华,黄有文,王荣新,等地中海贫血的治疗进展临床荟萃,2002为国,李夏新,杨明,等骨髓移植治疗重型地中海贫血二例报告中华儿科杂志,2000,38532032220方建培,陈纯,黄绍良,等异基因外周血造血干细胞移植治疗重型地中海贫血中华儿科杂志,2000,38956056321李文益地中海贫血基因调控治疗概况及展望中国小儿血液,2000,5310310422钟永,邓素辉,张锦地中海贫血的基因治疗国外医学儿科分册,1997,244178180三、地中海贫血中医药研究进展地中海贫血患者临床上常表现为面色苍白或萎黄、头晕、心悸、唇舌色淡、脉沉细或虚数等贫血症状；有的还表现出黄疸、皮下出血等溶血症状；此外病人还多伴有不同程度的腹部膨隆、肝脾肿大、发育较差、头颅方大、颧骨突起、鼻梁凹陷、眼距增宽等体征。中医古籍中对地中海贫血虽无专门论述，但历代医家多根据患者的临床表现将该病归属于中医“血证”、“血虚”、“虚劳”、“童子劳”、“虚黄”、“积聚”、“五软五迟”等范畴。本文搜集了近二十年来国内中医药方面有关地中海贫血的文献报道，分别综述如下。1病因病机、辨证分型王小超等1,2先后共治疗100例地中海贫血（40例血红蛋白H病，60例地贫），均辨证为肾阴虚型。认为地中海贫血的主要病机为肾阴虚，肾虚必致脾弱，气血生化乏源。孙锦乡3治疗1例地