【精品推荐】胎盘球蛋白的制备及体内外的免疫抑制作用医学论文_医药学论文_39308

论文范文题目胎盘球蛋白的制备及体内外的免疫抑制作用医学论文_医药学论文编辑小小作者刘凌波，黎纬明，何伟，邹萍【摘要】为了研究小鼠急性粒单核白血病细胞株WEHI3细胞表面免疫应答分子FAS、FAS配体（FASL）、CD80分子表达以及FASL的功能，应用流式细胞术检测WEHI3细胞表面FAS、FASL和CD80分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTDR）掺入法检测FASL功能。结果表明WEHI3细胞表面CD80和FAS表达率分别为（506041）、（675231）（N5），但FASL表达率高达（6373523）（N5），当WEHI3（效应细胞，E）和FASYAC1细胞（靶细胞，T）以31、101和301混合培养时，YAC1细胞的凋亡率分别为（2645），（3532）和（4327）（N5）。结论WEHI3细胞高表达FASL，低表达FAS和CD80，并能诱导FASYAC1细胞凋亡。【关键词】急性粒单核细胞白血病EXPRESSIONOFIMMUNERESPONSEMOLECULESANDFUNCTIONOFFASLIGANDONSURFACEOFAMLWEHI3CELLSABSTRACTTHEPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOINVESTIGATETHEEXPRESSIONOFFAS、FASLIGAND（FASL）ANDCD80ANDFUNCTIONOFFASLONTHESURFACEOFACUTEMYELOMONOCYTICLEUKEMIACELLSFROMWEHI3LINETHEEXPRESSIONOFFAS、FASLANDCD80ONTHESURFACEOFWEHI3WEREDETECTEDBYFLOWCYTOMETRY，THEAPOPTOSISOFYAC1CELLINDUCEDBYFASLONTHESURFACEOFWEHI3WEREDETECTEDBY3HTDRINCORPORATIONTHERESULTSSHOWEDTHATTHEEXPRESSIONRATEOFFAS、FASLANDCD80ONTHESURFACEOFWEHI3CELLSWERE675231（N5）、6373523（N5）AND506041（N5）RESPECTIVELYTHEAPOPTOSISRATEOFYAC1CELLS（TARGETCELLS）COCULTUREDWITHWEHI3CELLS（EFFECTORCELLS）ATTHERATEOF13、110AND130WERE2645、3532AND4327（N5）RESPECTIVELYITISCONCLUDEDTHATWEHI3CELLSHAVEHIGHEXPRESSIONOFFASLANDLOWEXPRESSIONOFFASANDCD80ONTHEIRCELLMEMBRANE，ANDCANINDUCETHEAPOPTOSISOFFASYAC1CELLSKEYWORDSACUTEMYELOMONOCYTICLEUKEMIAFASLFASCD80WEHI3CELL白血病细胞免疫逃逸可能是白血病发生、发展的重要环节。文献报道，肿瘤细胞可能主要通过以下途径逃逸机体T细胞的免疫监视肿瘤细胞膜高表达AS配体FASLIGAND，AS，并通过ASAS途径反击T细胞，肿瘤细胞膜缺失或低表达免疫反应的正性调节因子，如共刺激分子CD80，使T细胞对肿瘤细胞抗原刺激无能应答14。因此，本研究调查小鼠急性粒单核细胞白血病（ACUTEMYELOMONCYTICLEUKEMIA，AML）细胞株WEHI3细胞表达AS、AS和CD80的状况及其功能，初步探讨急性粒单核细胞白血病的可能的免疫逃逸机制。材料和方法细胞株和试剂小鼠急性粒单核细胞白血病细胞株（WEHI3）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。小鼠T淋巴瘤细胞株YAC1购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。DMEM培养液、RPMI1640培养液、胎牛血清购自GIBCOBRL公司。3HTDR（北京原子能研究所产品），液体闪烁测量仪为FJ2107型（西安262厂产品），FITC标记的CD80单克隆抗体和同型对照抗体（SOUTHERNBIOTECH公司产品），生物素标记的抗小鼠FASL抗体和同型对照抗体，PE标记的链酶亲和素和FC封闭抗体（CD32抗体）购自PHARMINGEN公司，FITC标记的抗FAS单克隆抗体和同型对照抗体购自SOUTHERNBIOTECH公司。WEHI3表面CD80表达率检测WEHI3细胞在含10胎牛血清、02MMOL/L左旋谷胺酰胺、青霉素100U/ML、链霉素100G/ML的DMEM/高糖培养液中，于37、5CO2、完全饱和湿度条件下传代培养。收集悬浮细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95的WEHI3细胞制备密度为20106/ML的单细胞悬液，取05ML单细胞悬液，加入FITC标记的CD80单克隆抗体或同型对照抗体05G，4染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。WEHI3表面FASL表达率检测WEHI3细胞经消化液消化后以每管5105细胞悬浮，加入98L含2FCS的细胞悬液和2LFC封闭抗体，4、5分钟后加入同样浓度的4L抗小鼠FASL单克隆抗体或同型对照抗体。洗涤后加入含2FCS的PBS96L和PE标记的链酶亲和素4L，进行流式细胞仪检测。同样实验重复5次。WEHI3表面FAS表达率检测收集悬浮的WEHI3细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95的WEHI3细胞制备密度为20106/ML的单细胞悬液，取05ML单细胞悬液，加入FITC标记的抗FAS单克隆抗体或同型对照抗体05G，4染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。FASL功能实验采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTHYMIDINE，3HTDR）掺入法检测5FASL功能。实验设立样品组、空白对照组和最大释放组。取01ML（5106个）YAC1细胞，除空白对照组外每组加入1MCI的3HTDR，用含10FCS的RPMI1640培养液于37、5CO2过夜培养（15小时）。离心洗去未掺入的3HTDR。用同位素微量加样器各取100L12104个YAC1细胞和100L各种浓度的WEHI3细胞混合于96孔培养板中；最大释放组不加WEHI3细胞，而加抗FAS单克隆抗体100NG/ML（可引起YAC1细胞100凋亡）。37孵育24小时，取100L培养上清加入含闪烁液的测量杯中，用液体闪烁测量仪检测放射强度，结果以每分钟脉冲数（CPM）表示，并用最大释放作用进行标化。效应细胞FASL功能，即诱导凋亡的百分率（实验组CPM自然释放CPM）/（最大释放CPM自然释放CPM）。同样实验重复5次。统计学处理数据以均值标准差（XSD）表示。结果WEHI3表面的CD80表达CD80是有效活化肿瘤特异CTL必需的共刺激信号之一，它的缺乏往往导致肿瘤特异CTL无能，使肿瘤细胞逃逸免疫监视；为此，我们检测了CD80在WEHI3细胞表面表达的情况，结果发现CD80抗原的表达率很低，仅为（506041）（N5）（图1）。这提示WEHI3细胞可能存在类似的免疫逃逸机制。WEHI3表面的FAS表达FAS是FASL启动细胞凋亡的重要信号传导分子，肿瘤细胞往往通过低表达FAS而逃避T细胞的杀伤。本研究发现WEHI3细胞表面FAS的表达率仅为（675231）（N5）（图2），这表明WEHI3细胞表面同样低表达FAS。WEHI3表面的FASL表达率FASL在很多肿瘤细胞中高表达，并杀伤FASCTL，发生免疫逃逸。本实验发现WEHI3表面FASL表达率为（6373523）（N5）（图3），提示WEHI3表面高表达FASL分子。WEHI3表面的FASL功能实验为了探讨WEHI3表面高表达的FASL分子能否诱导FAS细胞凋亡，本研究将WEHI3细胞（效应细胞，E）与YAC1细胞（靶细胞，T）以31、101和301混合培养24小时后，发现YAC1细胞的凋亡率分别为（2645），（3532）和（4327）（N5）（图4），从而证实WEHI3表面的FASL具有诱导FAS细胞凋亡的能力，这一结果高度提示WEHI3表面的FASL可能参与其免疫逃逸。讨论WEHI3是小鼠急性粒单核白血病细胞株，目前尚未见关于其免疫逃逸机制的报道。近几年来的研究证实，FASL/FAS系统反击是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。T细胞活化为细胞毒T淋巴细胞（CTL）后，高表达FASL，通过FASL来诱导FAS靶细胞的凋亡，发挥细胞毒效应；但FASL也高表达于多种肿瘤细胞，这样T细胞激活后上调FAS并对FAS介导凋亡敏感时，肿瘤细胞便可能通过FASL反向攻击杀伤T细胞。本研究证实，WEHI3细胞的FASL表达率高达6373，并具有诱导FASYAC1细胞凋亡的作用，与BUZYN3等的研究一致。同时，肿瘤细胞还可以通过低表达FAS，对FASL/FAS系统介导的凋亡信号不敏感而发生FASL/FAS系统抵抗。本研究发现WEHI3细胞的FAS表达率仅为675，与BREMNER等5的研究结果类似，提示WEHI3细胞可能通过高表达FASL杀伤FASCTL，通过低表达FAS而抵抗CTL的FASL攻击，导致WEHI3逃逸CTL的免疫监视。机体抗白血病免疫应答的有效产生需要下列两种信号白血病抗原肽主要组织相容性复合物（MHC）与T细胞的抗原受体（TCR）结合，提供T细胞活化的第一信号；同时，白血病细胞和抗原呈递细胞（APC）表达共刺激因子，与T细胞上的相应配体结合，提供T细胞活化的第二信号。双信号模式是T细胞充分活化的必需条件，缺一不可6。与WHITEWAY等4的研究结果类似，本研究发现，WEHI3细胞表面的CD80表达率极低，仅为506。WEHI3细胞低表达CD80分子，使得白血病抗原在缺乏必要的共刺激信号的条件下非正常地呈递给T细胞，最终可能导致T细胞无能，从而逃避机体免疫系统的攻击。总之，本研究对WEHI3细胞系的部分免疫逃逸机制进行了初步的探索，为发展白血病的免疫治疗提供了实验基础。但目前发现很多机制导致肿瘤免疫逃逸，包括肿瘤抗原表达异常、MHC依赖性抗原提呈途径异常、以及T细胞信号转导缺陷等79，在WEHI3细胞是否也同时存在，仍需进一步研究证实。【参考文献】1WALKERPR，SAASP，DIETRICHPYROLEOFFASLIGANDCD95LINIMMUNEESCAPETHETUMORCELLSTRIKESBACKJIMMUNOL，1997158452145242LICKLITERJD，KRATZKERA，NGUYENPL，ETALFASLIGANDISHIGHLYEXPRESSEDINACUTELEUKEMIAANDDURINGTHETRANSFORMATIONOFCHRONICMYELOIDLEUKEMIATOBLASTCRISISEXPHEMATOL，199927151915273BUZYNA，PETITF，OSTANKOVITCHM，ETALMEMBRANEBOUNDFASAPO1/CD95LIGANDONLEUKEMICCELLSAMECHANISMOFTUMORIMMUNEESCAPEINLEUKEMIAPATIENTSBLOOD，199994313531404WHITEWAYA，CORBETTT，ANDERSONR，ETALEXPRESSIONOFCOSTIMULATORYMOLECULESONACUTEMYELOIDLEUKAEMIABLASTSMAYEFFECTDURATIONOFFIRSTREMISSIONBRJHAEMATOL，20031204424515BREMNERTA，CHATTERJEED，HANZ，ETALTHP1MONOCYTICLEUKEMIACELLSEXPRESSFASLIGANDCONSTITUTIVELYANDKILLFASPOSITIVEJURKATCELLSLEUKRES，1999238658706BROUWERRE，ZWINDERMANKH，KLUINNELEMANSHC，ETALEXPRESSIONANDINDUCTIONOFCOSTIMULATORYANDADHESIONMOLECULESONACUTEMYELOIDLEUKEMICCELLSIMPLICATIONSFORADOPTIVEIMMUNOTHERAPYEXPHEMATOL，2000281611687FURUKAWAY，KUBOTAR，TARAM，ETALEXISTENCEOFESCAPEMUTANTINHTLVITAXDURINGTHEDEVELOPMENTOFADULTTCELLLEUKEMIABLOOD，2001979879938MOHTYM，JARROSSAYD，LAFAGEPOCHITALOFFM，ETALCIRCULATINGBLOODDENDRITICCELLSFROMMYELOIDLEUKEMIAPATIENTSDISPLAYQUANTITATIVEANDCYTOGENETICABNORMALITIESASWELLASFUNCTIONALIMPAIRMENTBLOOD，200198375037569CHENX，WOICIECHOWSKYA，RAFFEGERSTS，ETALIMPAIREDEXPRESSIONOFTHECD3ZETACHAININPERIPHERALBLOODTCELLSOFPATIENTSWITHCHRONICMYELOIDLEUKAEMIARESULTSINANINCREASEDSUSCEPTIBILITYTOAPOPTOSISBRJHAEMATOL，2000111817825转贴于MZKDUJI6TMDXCS3AX3SI9XKX_Q6CUTMDMDB9Q|TOPWPZG_9EM4UVSDRGIZP67GYNBMVMHCQCUWYT|5A5IVVQ1VIKNYMNBZY|MHDF|N1HEJNOHG_KKKYFIQ6WNEZIIDU0ABH5GZIMDW10TRXEMBNCDKHAE_QRWUONZKTIQTAO2TYXU4ENRP0SVGXYZ3VNBPAMC1TMDVODPURH9GAL5KACANOBTCUF3A7JN_SSXW42JV3X1KFDZXEDJTI|ISLRW5CV7DW1D