活性芽孢杆菌的分离、鉴定

活性芽孢杆菌的分离、鉴定与育种,闫恒 黄瑞辉 段花蕊,引言,芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等而淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。现在淀粉酶主要来源于植物和微生物并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。本实验从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株,实验目的,掌握如何设计分离生物活性菌株的实验方案;掌握诱变育种各方法的基本原理和操作;掌握原核微生物多相分类的总体方法及表型、基因型和系统发育分析的主要技术:掌握微生物菌种的冷冻干燥保藏和液氮超低温保藏的原理和方法。了解活性菌株产物测定(淀粉酶活性，纤维素酶活性，蛋白酶活性) 的相关方法及其原理(测定方法，仪器的使用),实验材料与仪器,1、实验材料：河北大学生科楼院前土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计；3、培养基和试剂：（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、MR实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸,实验流程,活性菌株的分离筛选诱变育种高产菌株发酵条件优化活性菌株的鉴定菌种保藏,一、活性菌株的分离筛选,1.原理：目前，土壤芽孢杆菌分离方法主要有两种，一种是根据在平板上所生长的菌落，鉴定出芽孢杆菌，该方法主要问题是由于微生物种群繁多，会影响分离结果；另一种是先加热以杀死非芽孢细菌，再根据菌落特征，分离出芽孢杆菌，该方法简单易行，是目前常用的方法，筛选一些特殊芽孢杆菌时多用此方法。用于分离芽孢杆菌的培养基有多种，最常用的有牛肉膏蛋白胨琼脂和麦芽汁牛肉膏蛋白胨琼脂，其中麦芽汁培养基分离得到的菌落直观、分散，易于计数，可作为基础培养基。产淀粉酶的活性芽孢杆菌常使用淀粉培养基进行分离，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。淀粉培养基作为筛选培养基。测定淀粉酶的活性可以把待测菌株种在淀粉培养基表面，经培养后测定透明圈与菌落直径的比值（H/C值）大小来衡量淀粉酶活力高低。初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通过检测得到一些较优菌株；复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。,一、活性菌株的分离筛选,实验步骤：采集土样, 称取 5 g土样, 放入装有 45mL无菌水的三角瓶中, 震 荡 20m in后静置 5m in , 然后进行浓度梯度稀释到10-4、10-5、10-6 把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的d0 /d1 (d0 为水解圈直径, d1 为菌落直径 )。将出现水解圈的菌落进行芽孢染色，显微观察菌种形态。挑选有明显透明圈的单菌落, 制成斜面。复筛: 将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株,二、紫外诱变,诱变育种: 即用人工诱变的方法诱发微生物基因突变，通过筛选，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体。1.原理：紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。紫外线的波长在200380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，引起微生物突变或死亡），从而引起菌体遗传性变异。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。,二、紫外诱变,2.实验步骤：将初步筛选产酶能力强的菌株从斜面接种到液体培养基中,37振荡培养2d后,吸菌液以110的接种量转接到液体培养基中继续培养,培养1d后的菌液用于紫外诱变。取菌液4mL于灭菌后的培养皿中,置于20W紫外灯下25cm处间歇照射4min,用无菌水梯度稀释涂平板,然后用黑布包好置于37的恒温培养箱中培养,以未经紫外处理的为对照。第2天统计平板上的菌落数,计算致死率,正突变率,挑选突变菌株点种到淀粉培养基上,37培养42h,通过比较突变株与原始菌株的d0 /d1值,筛选产酶能力强的菌株。紫外诱变后所有操作在红灯下进行。将筛选的优良突变株进行第二次诱变,方法同原始菌株的诱变。诱变后将突变株点种到淀粉培养基上,以第一次诱变的突变株为对照,通过比较第二次诱变的突变株与对照的d0 /d1值,筛选产酶能力强的菌株。稀释菌液并涂布到淀粉培养基平板上，37下过夜培养，分别测水解圈的d0 /d1值，将正突变的菌种接种到种子培养基瓶中35培养12h。然后以5%的接种量接种于发酵培养基上，37，160r/min培养48h。发酵后24h补加碳酸钙。离心(4000r/min,20min),收集上清液即为待测粗酶液。,3.原始菌株及突变株产酶能力的测定及其产酶稳定性检测（1）.标准曲线的制作(见下表)取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在540 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。,表2 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值,(2)粗酶液淀粉酶活力测定按以下顺序操作：取20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号。取粗酶液1 ml于各只刻度试管中，于60水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60水中预热5min，取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入具塞刻度试管中,于60水浴中保温30min加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,迅速冷却,加蒸馏水定容至20 ml。定容后,摇匀,用分光光度计测定OD540 nm值。在上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力酶活力测定公式：淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg）淀粉酶原液总体积（mL）/所加淀粉质量后培养：应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。,三、高产菌株发酵条件优化,1.原理：以淀粉酶的活力做为检测的指标。采用单因素试验筛选高产菌生长及产淀粉酶的最佳碳源和最佳氮源，通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。经相关文件检索，本实验选则碳源浓度、氮源浓度、无机盐浓度、接种量四个对于发酵较重要的因素进行优化。2. 材料与仪器： 高产菌株斜面控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、PH试纸、紫外分光光度计 种子液培养、初始发酵培养基蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、玉米粉1. 6%、酵母膏1. 6%、尿素0. 2%、黄豆饼粉1. 6%、005% CaCO3、Zn SO4、CuSO4、Mn SO4H2O、Mg SO47H2O,三、高产菌株发酵条件优化,3.实验步骤3.1 种子液培养 接种1环高产菌株于盛有50mL种子培养基的250m L 三角瓶中，37 ，180r /min振荡培养24h，调整菌液浓度为108 / m L，作发酵用种子液。3.2 摇瓶发酵培养 将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL 三角瓶中，28，180r / min振荡培养36h。进行单因素实验和发酵条件优化实验。3.3 单因素试验优化生产条件（1）培养基碳源对产酶的影响：在不含可溶性淀粉的培养基中，分别用等量的蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精替代初始发酵培养基中的葡萄糖做碳源进行碳源对产酶的影响的发酵试验，同时以初始发酵培养基为对照。按 50mL/ 250 mL装液量、6%接种量、pH7.0、以200 r/min在37 培养，测定摇瓶发酵24h后淀粉酶的活力。,三、高产菌株发酵条件优化,。2）培养基氮源对产酶的影响：以所选最优碳源为基础，其他成分不变，分别以等量的玉米粉1. 6%、酵母膏1. 6%、尿素0. 2%、黄豆饼粉1. 6%替代蛋白胨0.8%，同时以初始发酵培养基为对照。按 50mL/ 250 mL装液量、6%接种量、pH7.0、以200 r/min在37 培养，测定摇瓶发酵24h后淀粉酶的活力。（3）无机盐对产酶的影响：在所选最优碳、氮源为培养成分下，分别添加005% CaCO3、Zn SO4、CuSO4、Mn SO4H2O、Mg SO47H2O替代NaCl。同时以初始发酵培养基为对照。按 50mL/ 250 mL装液量、6%接种量、pH7.0、以200 r/min在37 培养，测定摇瓶发酵24h后淀粉酶的活力。,三、高产菌株发酵条件优化,3.4正交试验设计： 根据3.5.3的试验结果，采用四因素三水平设计正交试验，并以淀粉酶活力为主要参考指标，每组进行3次重复，确定最佳摇瓶发酵条件。,表1,表1 正交试验设计,三、高产菌株发酵条件优化,三、高产菌株发酵条件优化,3.5培养时间及摇床转速对摇瓶发酵的影响：（1）温度：采用最优培养基及接种量，按50mL/ 250 mL装液量、pH7.0、以200 r/min分别在25，28，30，37，42 培养，测定摇瓶发酵24h后淀粉酶的活力。（2）培养时间：采用最优培养基、培养温度及接种量，按50mL/ 250 mL装液量、pH7.0、以200 r/min培养，分别测定摇瓶发酵12，24，36，48 h后淀粉酶的活力。（2）转速：采用最优培养基、培养温度及接种量，分别以0，160，180，200 r/min摇床转速按50mL/ 250 mL装液量、pH7.0培养，测定摇瓶发酵最佳培养时间时的淀粉酶的活力。,四、活性菌株的鉴定,利用多相分类的方法对所分离的菌株进行鉴定：形态鉴定：个体和群体形态鉴定生理生化反应：将诱变得到的正突变菌株进行以下反应：糖发酵实验、甲基红实验、V.P实验、柠檬酸盐利用实验、吲哚实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、明胶水解实验、过氧化氢酶实验、酪素水解实验、耐盐实验。,四、活性菌株的鉴定,利用多相分类的方法对所分离的菌株进行鉴定：1.形态鉴定：取培养箱中的培养样品，挑取单菌落制片，对其进行革兰氏染色，镜检，观察记录染色结果；用孔雀绿、番红染色，镜检，观察记录菌体、芽孢的形态及芽孢着生位置。用培养平板，观察记录单个菌落形态特征。芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，呈直杆状，可产荚膜，可运动（周生鞭毛）；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，成椭圆至圆柱状；菌落粗糙、不透明、扩张、污白色或微带黄色。,四、活性菌株的鉴定,生理生化反应：将诱变得到的菌株进行以下反应：（1）糖发酵实验：取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，一支接种所分离菌种，另一支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管2支，同样1支接种所分离菌种，另一支不接种，作为对照。将已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37培养箱中培养24小时，观察结果。芽孢杆菌可以分解利用葡萄糖，但不能分解利用乳糖。（2）甲基红实验：在装有葡萄糖蛋白胨水培养液的试管中，接种所分离的菌株，经过夜培养后，加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”或“”表示。芽孢杆菌在滴加甲基红后会变红，结果呈阳性，说明芽孢杆菌代谢糖，产酸不产气。（3）V.P实验：在培养芽孢杆菌的试管中，加40%KOH15滴，震荡，再加等量-萘酚，震荡，37震荡培养30min,观察。结果不变红，呈阴性，说明芽孢杆菌不能代谢糖产非酸性或中性末端产物。（4）柠檬酸盐利用实验：将被检菌种接种于柠檬酸盐培养基上，于37培养1-4天，每日观察结果，若培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由淡绿色变为深蓝色，则为阳性；不能利用柠檬酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基不变色，为阴性。芽孢杆菌不能利用柠檬酸盐，无变蓝，结果呈阴性。,四、活性菌株的鉴定,（5）吲哚实验：将菌接种至蛋白胨水培养基中,37下，在培养液中加入乙醚12ml，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”、阴性用“-”表示。无玫瑰红，结果呈阴性，说明芽孢杆菌不能产生色氨酸酶。（6）H2S实验：在SIM培养基中接种所分离的菌株，将所有试管置于37下培养24-48小时，观察接种线有无黑色产生，记录下来，依观察所见，判断各菌是否具有产生硫化氢之能力。无变黑，结果呈阴性，说明该菌株没有产生硫化氢之能力。（7）硝酸盐还原实验：待检菌接种于硝酸盐培养基中，37培养1-4d。将A、B液等量混合液(用时混合)0.1ml加于试管内，立即或10min内观察结果。做此试验时，应以一支未接种细菌的培养基做对照试验，只有对照管阴性时，才能判定。当结果出现红色为阳性反应。如欲检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色表明硝酸盐仍存在;若不出现红色，表示硝酸盐已被分解。(滴加格里斯试剂后，培养基颜色变为玫瑰红，结果呈阳性，说明该菌能顾将硝酸盐还原为亚硝酸盐)（8）明胶水解实验：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20培养，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。(结果呈阴性),四、活性菌株的鉴定,（9）过氧化氢酶实验：挑取培养基中菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。（有气泡产生，结果呈阳性，表明具有过氧化氢酶。）（10）酪素水解实验：牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接35株菌。适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。酪氨酸水解：将酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，115，20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，培养7到14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明（出现水解圈，结果呈阳性）（11）耐盐实验：配置一系列盐浓度梯度的培养基，接种所得菌，观察记录菌落生长情况和数目，找出菌浓度最高和最低时的培养基内盐浓度，记录。（盐浓度为3%、5%、7%的培养基中均有生长的菌落，其中盐浓度为3%的培养基中菌浓度最高，7%最少，结果呈阳性）（12）淀粉水解实验：将菌种涂布接种于淀粉琼脂平板或斜面，于37 培养（2448） h，或于20 培养5 d。然后将碘液直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘液于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环。阴性反应则无透明环。（变蓝，出现透明环，阳性结果）。综合上述实验，可确定所分离菌株是否为芽孢杆菌及其种类。,五、菌种保藏,原理：菌种保藏是指广泛收集并妥善保藏实验室和生产用菌种、菌株(包括病毒株、动植物细胞株、质粒等)，使之不死、不衰、不污染，以便于研究、交换和使用。本实验：将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用油纸将棉塞部分包扎好，置4冰箱中保藏。,二、附录（一）、培养基的配制1、淀粉培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂1520g，121灭菌20min2、牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，琼脂1520g，121灭菌20min，pH7.07.23、种子培养基蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，琼脂2%，可溶性淀粉0.25%4、发酵培养基玉米粉10g，淀粉15g，豆粉20g，酵母粉3g，KH2PO4 0.3g，ZnSO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，pH7.05、糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1.6g溴甲酚紫溶解到100mL乙醇中）12mL，pH7.6，另配20%糖溶液，蛋白胨水121灭菌20分，20%糖溶液112灭菌30 min，分别灭菌后再混合。6、明胶培养基牛肉膏蛋白胨液100mL，明胶1218g，pH7.27.4，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌溶化后调pH，121摄氏度灭菌30 min,7、柠檬酸盐培养基NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCl5g，MgSO40.2g，柠檬酸钠2g，琼脂1520g，蒸馏水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液10mL，将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121摄氏度灭菌20 min后制成斜面。8、醋酸铅培养基pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%醋酸铅水溶液1mL，将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶解，待冷却至60摄氏度加入硫代硫酸钠调pH7.2分装于三角瓶中，115摄氏度灭菌15 min。取出后待冷至5560摄氏度，加入醋酸铅水溶液，混匀后倒入灭菌试管中。9、吲哚培养基蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.6，121摄氏度灭菌20 min10、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、MR实验）蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，蒸馏水1000mL，将上述各成分溶于水中，调pH7.07.2，分装试管，112摄氏度灭菌30 min。11、硝酸盐液体培养基MgSO40.05%，K2HPO40.05%，KNO30.1%，蔗糖2%