基于顺铂抗癌药物的合成及dna键和性质的研究

基于顺铂抗癌药物的合成及DNA键合性质的研究【摘要】癌症是严重威胁人类健康和生命的常见病和多发病，已经成为人类死亡的第二大病因。自1967年发现顺铂具有抗癌活性以来，经过30多年的发展，铂类金属抗癌药物的合成应用和研究得到了迅速的发展。与此同时，研究药物和DNA的相互作用是药物发现和药品研发过程中最重要的课题之一。G四链体是富含鸟嘌呤碱基的DNA通过氢键相互作用形成的四链螺旋结构。这种结构可以有效的抑制端粒酶的活性，它可以阻碍端粒酶对端粒DNA引物的识别，使细胞正常凋亡，从而达到抗肿瘤的效果，近年来，以G四链体为靶点的抗癌药物研究引起了人们的广泛注意。本文的工作重点是合成配合物，通过紫外滴定和荧光滴定手段研究已有钌配合物对G四链体稳定性、DNA对金属离子的特异性识别。【关键词】铂II配合物，G四链体，DNA，钌II配合物。APPLICATIONOFBJERRUMFUNCTIONINDETERMINATIONOFSTABILITYCONSTANTS【ABSTRACT】CANCERISACOMMONANDFREQUENTLYOCCURRINGDISEASESSERIOUSLYTHREATENINGHUMANHEALTHANDLIFE,WHICHHASBECOMETHESECONDLARGESTHUMANDEATHCAUSESINCECISPLATINWASFOUNDHAVINGANTICANCERACTIVITYIN1967,AFTER30YEARSOFDEVELOPMENT,THESYNTHETICAPPLICATIONSANDRESEARCHOFMETALANTICANCERDRUGSOFPLATINUMOBTAINEDARAPIDDEVELOPMENTATTHESAMETIME,THERESEARCHOFTHEREACTIONBETWWENDRUGSANDDNAISONEOFTHEMOSTINPORTANTISSUESINTHEPROCESSOFDISCOVERYANDDEVELOPMENTOFDRUGSGQUADRUPLEXISRICHINGUANINEBASESOFDNAWHICHFORMEDTHROUGHTHEHYDROGENBONDINGINTERACTIONOFTHEFORMATIONOFTHEFOURCHAINSPIRALSTRUCTURETHISSTRUCTURECANINHIBITTHETELOMERASEACTIVITYEFFECTIVELY,HINDERTELOMERASETOTELOMEREDNAPRIMERSRECOGNITION,ANDMAKENORMALCELLAPOPTOSIS,SOASTOACHIEVEANTITUMORPURPOSEINRECENTYEARS,THEGQUADRUPLEXTARGETCANCERDRUGRESEARCHHASATTRACTEDWIDESPREADATTENTIONTHISPAPERISFOCUSEDONTHESYNTHESISOFCOMPLEXES,USINGTHEULTRAVIOLETTITRATIONANDFLUORESCENCETITRATIONMETHODTOSTUDYTHESTABILITYOFEXISTINGMETALRUTHENIUMCOMPLEXESTOGQUADRUPLEXANDDNASIDENTIFICATIONTOTHESPECIFICITYOFTHEMETALIONS【KEYWORDS】PTIICOMPLEXES,GQUADRUPLEX,DNA,RUIICOMPLEXES目录1引言311基于顺铂抗癌药物的研究意义312金属铂抗癌药物的发展313核酸的组成与结构3131概述132DNA结构14G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系141G四链体142G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系15本文所作的工作32理论部分421DNA与配合物作用的研究方法422各种生成函数法的测定原理4221光谱学方法4222流体力学方法4223密度泛函计算与分子模拟43实验部分531引言532药品和仪器5321实验试剂5322实验仪器533配合物的合成及表征5321配体的合成322铂配合物的合成34不同辅助配体的多吡啶配合物与G四链体DNA的相互作用的研究341缓冲溶液的配制342配合物与DNA浓度的确定343配合物与G四链体相互作用的紫外可见光谱滴定344配合物与G四链体作用的荧光光谱滴定4结果和讨论641钌配合物与G四链体电子吸收光谱研究742钌配合物对端粒G四链体的选择识别研究75结论和展望851结论852展望8参考文献9谢辞101引言11金属抗癌药物的发展1965年ROSENBERG偶然发现顺二氯二氨合铂CISPTNH32CL2，又称顺铂对大肠杆菌的分裂有抑制作用，并于1969年首次报道了顺铂具有很强的抗癌活性。1975年顺铂成为第一个用于临床的金属配合物抗癌药物。从此以后，金属药物及其抗肿瘤机理成为人们关注的研究热点。但是顺铂水溶性差，且仅能注射给药，缓解期短，并伴有严重的肾、胃肠道毒性、耳毒性及神经毒性，长期使用会产生耐药性。为此，人们开始展开对其它铂系抗肿瘤药物的研究，但结果并不理想。铂系抗肿瘤药物在临床使用上具有毒副作用大以及耐药性的问题，促使研究者积极寻找非铂系抗肿瘤药物。目前非铂系金属抗肿瘤药物研究主要集中在钌、铑、锡、锗等金属配合物，特别是钌配合物。作为铂类配合物的对照物，钌配合物很早就被运用于抗肿瘤实验。与顺铂相较，钌配合物毒性相对较小，在生物体内易于吸收，也易于代谢而且钌配合物有在肿瘤组织中发生聚集的特点，能够与DNA分子以共价键或者非共价键静电结合、沟面结合和插入结合方式缔合。从上世纪八十年代以来，钌配合物作为抗肿瘤药物的研究已经成为药物化学、化学生物学、配位化学以及生物无机化学的热点研究领域之一。12金属铂抗癌药物的发展自1967年美国密执安州立大学教授ROSENBERGB和CAMPV发现顺铂具有抗癌活性以来，经过30多年的发展，铂类金属抗癌药物的合成应用和研究得到了迅速的发展。顺铂、卡铂的开发成功和临床应用给癌症的治疗带来了一场新的革命。有数据表明，DNA链中许多相邻的碱基间两个氮原子距离为340PM，而顺铂中两个氯原子间的距离为330PM，两者恰好匹配，形成的铂化DNA寿命较长且不易被细胞蛋白如高移动组HMG蛋白识别并修复，因而将破坏肿瘤细胞DNA的复制，抑制细胞分裂，最终杀死肿瘤细胞。现在，顺铂和其他铂化合物已显示出它与病毒、细菌、寄生菌作斗争的潜力。除此此外，铂化合物也有希望用来诊断一些疾病。自从顺铂的抗癌活性被发现以来，铂类抗癌药物的研究和应用得到了迅猛的发展。如今，顺铂和卡铂已成为癌症化疗中不可缺少的药物。1995年，世界卫生组织对世界上近百种抗癌药物进行评价，顺铂的疗效、市场等综合评价得分名列前茅。顺铂和卡铂所获得的成就极大地鼓舞了各国学者积极研究更好、更有效的铂类抗癌新药。目前铂类配合物的合成已历经三代。顺铂是第一代铂类抗癌药物（结构如图11所示），该药的使用局限性是它的耐药性及剂量毒性人体器官尤其是对肾脏的损害较大。第二代铂类配合物（结构如图12所示），其中以卡铂为代表（结构如图12所示），其水溶性优于顺铂，肾毒性低于顺铂，主要不良反应为骨髓抑制。第三代铂类代表化合物乐铂（结构如图13所示），乐铂全称是环丁烷乳酸盐二甲胺合铂，研究表明，该药的抗肿瘤效果与顺铂、卡铂的作用相当或者更好，毒性作用与卡铂相同，且与顺铂无交叉耐药。图11第一代主要铂类抗癌药物的结构图12第二代主要铂类抗癌药物的结构图13第三代铂类抗癌药物结构目前铂类配合物研究的方向是寻找比顺铂和卡铂疗效更好，不良反应更小，药学特性得到改善的化合物、扩大抗癌谱、开发与顺铂和卡铂无交叉耐药性的新型药物。13核酸的组成与结构131概述构成生命物质的两类主要大分子是蛋白质和核酸。核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内，与蛋白质构成生命物质的两类主要的大分子。生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸是生物体的重要组成物质，在蛋白质的生物合成上占重要位置，与生物的生长、发育等正常生命活动以及癌变、突变等异常生命活动中起决定性的作用。因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。衰老和癌变是人类的两大医学难题，二者与端粒和端粒酶有密切关系。端粒是真核细胞染色体末端富含鸟嘌呤的DNA重复序列及一些结合蛋白组成的特殊结构。端粒除了提供非转录DNA的缓冲物之外，还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生密切相关。在生理状况下，随着细胞分裂次数增加，端粒在复制分裂过程中将逐渐丢失碱基，从而使端粒渐进性缩短。当端粒缩短至一定长度时细胞将进入生长停止衰老死亡阶段，即出现细胞的凋亡。研究发现，端粒酶能保证端丽的正常复制。除了胚胎组织、生殖细胞和少数造血肝细胞中具有端粒酶火星外，绝大多数体细胞中无端粒酶活性，但是，85以上的肿瘤细胞端粒酶表达呈阳性。因此，以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究已成为一种新的药物作用靶点，而且极有希望成为最安全、有效的治疗肿瘤的理想途径。核酸是生物体内的高分子化合物。单个核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸三部分构成的。根据所含戊糖的差异，核酸可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。核苷酸中的碱基分为嘌呤和嘧啶两类。DNA主要由含腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的核苷酸构成。RNA主要由含腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C和尿嘧啶U的核苷酸构成。132DNA结构DNA之所以能含有生物物种的所有遗传信息，是因为其结构非常复杂，每个人体细胞的DNA约含有100亿个碱基。DNA分子的结构，有以下三种第一，DNA的一级结构。四种脱氧核糖核酸按照一定的顺序，通过35磷酸二酯键连结，由一个核苷酸的戊糖环第3位羟基与另一个核苷酸的戊糖环第5位的磷酸以酯键相连，具有一定的方向性。碱基间遵循碱基互补配对原则，即腺嘌呤A一定与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G一定与胞嘧啶C配对。（如图14）因为它是指组成核酸的核苷酸之间连键的性质和排列的顺序，所以DNA的一级结构也被称为DNA碱基序列。图14核酸一级结构模型第二，DNA的二级结构。它是指磷酸和碱基按照一定顺序排列时，由于扭转角度和各种碱基排列方式不同而产生各种各样构型的DNA。DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。由WATSON和CRICK两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。在不同湿度和盐浓度下，DNA的双螺旋有着不同的构象。DNA的二级结构分为两大类一类是右手螺旋，如ADNA、BDNA、CDNA、DDNA等；另一类是左手双螺旋，如ZDNA。双链DNA的构象与其核苷酸序列和碱基组成有密切关系。一般地，含随机的碱基组成和序列的DNA双螺旋分子通常只能形成A、B、C构型；但严重重复的寡聚核苷酸则可形成其它的构型，如D、E、Z和P构型。改变一定的外界环境条件，如温度、相对湿度、盐的浓度以及有机溶剂等可以使这些构型进行相互的转化，并且这些转变从本质上都是改变核酸分子的内在运动来实现的。图15ADNA、BDNA和ZDNA第三，DNA的三级结构。它是指DNA中单链与双链、双链之间的相互作用形成的三链或四链结构，由DNA双螺旋进一步扭曲，包括线状双链中间可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋及环状DNA中诸如超螺旋和连环之类的各种拓扑学状态。在双螺旋DNA的大沟中存在多余的氢键给体和受体，这些氢键给体和受体可以和专一的结合分子如蛋白质发生相互作用，形成专一的复合物，也可以与单链DNA分子结合形成三螺旋DNA。三螺旋DNA一般是由一条寡核苷酸链通过与双链DNA形成HOOGSTEEN键或反HOOGSTEEN键，在其大沟处紧密缠绕而成。三螺旋DNA的组成结构基元是三碱基体，这些碱基体也具有专一性，具体体现在T、C、G、A分别要接在AT、GC、GC和AT碱基对上（见图16）。形成三螺旋DNA的第三条链的抗酶括性、水溶性、脂溶性和毒副作用等因素直接影响其作为治疗药物的可能性。因而合成能抗核酸酶能力强、水溶性和脂溶性适当、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA稳定性的主链修饰方法仍是目前的研究热点。图16三螺旋DNA结构14G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系141G四链体G四链体（GQUADRUPLEX）是一类特殊的DNA二级结构，在基因组中的一些鸟嘌呤富集区域，具有形成这一特殊结构的倾向。这些区域包括端粒末端G重复序列，以及一些重要基因的启动子区域，因此G四链体的形成或拆散可能涉及到体内的一些重要生理过程的调控，比如细胞凋亡、细胞增殖、信号转导和肿瘤形成等。此外，G四链体结构作为一种特殊的DNA二级结构，与普通双链具有显著的结构差异，可以成为药物选择性识别的靶点。因此，研发与G四链体相互作用的小分子抗癌药物受到了广泛的关注。四链体结构是由富含GDNA单链，在特定离子强度和PH值条件下，由单链之间或单链内对应的G残基形成HOOGSTEEN碱基配对，从而使四条或四段富GDNA单链旋聚成一段特殊的DNA二级结构。由于富GDNA中的G残基都是成串排列的，因此，当四条或四段富G单链DNA的G残基并肩形成HOOGSTEEN碱基配对时，就形成了一个由4个G残基的杂环平面联合形成的GQUARTET平面。在4条链中相应的的G之间形成的四分体平面层层堆叠，就形成一段极其稳定的四链体DNA结构（见图17）。由于这段四链体是以G残基为主形成的，故称为GQUADRUPLEX。其中每个G碱基既是氢键的受体，又是氢键的给体，他们在结构上是等价的。在两个相邻的四碱基体的中央会形成一个空腔，空腔内有负电性的羰基氧存在，使得此处易于结合阳离子。四链体四链体之间通过作用相互堆积结合在一起。GQUADRUPLEX特殊结构使得它能够成为特异性的DNA靶点。NNNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRHNHHO图17GQUADRUPLEX结构大量研究表明含不同G序列所形成的四螺旋结构是不同的，即使是相同的序列也可以按不同的方式进行组装。G四链体DNA可以通过单链，双链以及四链形成三种不同的四螺旋结构，每种结构又有多种异构体（见图18）。大量研究表明含不同G序列所形成的四螺旋结构是不同的，即使是相同的序列也可以按不同的方式进行组装。现在普遍认为通过控制适当的条件，如温度、DNA浓度、缓冲液中的NA和K的浓度等可以改变G四链体的构型。图18几种典型的G四链体结构A分子间四聚体结构平行；B分子间二聚体邻位发夹型结构反平行；C分子内椅状结构反平行；D分子内蓝状结构反平行；E分子内螺旋桨状结构平行；F分子内混合型结构142G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系端粒是由高度重复序列的端粒DNA和端粒结合蛋白组成的复合物。20世纪三四十年代，HERMANNMULLER和BARBARAMCCLINTOCK同时提出了端粒的概念。它是染色体末端的一种特殊结构，能防止染色体DNA降解、末端融合、缺失及非正常重组维持染色体的完整和稳定，并保证细胞正常分化。端粒的主体是双螺旋结构，富GT链与富CA链配对，但3末端突出为一段单链悬挂。由于缺乏模板的引导，染色体合成过程中传统的DNA聚合酶就无法完全合成这个末端悬挂，从而造成端粒缩短，这就是所谓的“末端复制问题”。端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊的核蛋白复合体，由高度重复序列的端粒DNA和端粒结合蛋白组成17。不同物种的端粒DNA序列存在差异，但都以富含鸟嘌呤G的重复序列为特征。人的端粒约有15KB反复串联的TTAGGG构成的，并且以50200BP次分裂进行缩短，主要组成部分为515KB长的双链DNA和3末端100200BP长的G单链悬垂GOVERHANGDNA。端粒的主体是双螺旋结构，富GT链与富CA链配对，但3末端突出为一段单链悬挂。这段单链在名为SHELTERIN18/TELOSOME19的蛋白结构催化下折回到端粒内部双链，并将该端区域的一段自身链置换出来，取而代之与互补链配对，形成TLOOPTELOMERELOOP结构，而3末端单链被“包埋”在TLOOP中，端粒末端便形成了一个与外界隔绝的闭合结构。正是由于这个闭合结构，端粒显现出了对于染色体的稳定及其基因组的完整非常重要的作用，它为染色体末端提供保护性，防止染色体互相融合、重组及一些外切酶、连接酶的作用，防止DNA的损伤，并计数在线性DNA复制时出现的末端DNA片断的丢失。同时，这种结构也使端粒酶不可能持续与端粒3末端单链发生作用，从而保证了端粒长度的恒定。图19左图为人染色体末端的端粒DNA；右图为人端粒结构示意图正常细胞的端粒随着细胞分裂进行性缩短，在每一次的复制循环中端粒都要减少50100个碱基对，细胞在进行大约50次分裂后就开始衰亡。端粒的长短在细胞癌变和衰老中起着重要作用。而端粒的长短可由端粒酶调节。1985年GREIDER和BLACKBURN首次从四膜虫细胞提取液合成端粒的实验中，发现了端粒酶活性并同时证实了端粒酶具有维持端粒长度的作用。端粒酶是一种核酸蛋白质复合物，它能以自身RNA为模板，将真核生物染色体末端端粒DNA加以延伸的酶，所以它又被称为特化RNA依赖性DNA聚合酶、反转录酶、端粒末端转移酶。端粒酶由三个部分组成，包括端粒酶RNAHTR，逆转录酶催化亚基HTERT和端粒酶其它聚合蛋白TEP12，端粒酶的生物功能是合成染色体末端的端粒，是一种依赖于RNA的特殊的DNA聚合酶，属于逆转录酶类型。在胚胎发育期，端粒酶的活性很高，而在成熟体细胞中端粒酶的活性则会被关闭，以此来调控细胞的生长、分化和衰老。但是在大部分肿瘤细胞85中，端粒酶则表现出了很高的活性，而在癌周围组织和正常组织中端粒酶几乎是没有活性的。在正常的体细胞中，端粒酶的活性得到抑制，所以细胞每分裂一次，端粒就会缩短一些，当达到一个临界长度时，细胞染色体就会失去稳定性，然后细胞将发生衰亡和凋亡。而在肿瘤细胞中，端粒酶的活性被激活，使得它可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生长，因此这个细胞不能进入正常的老化和衰亡，从而获得一种永生性。由此说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持分裂增殖具有密切的关系。因此，以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究已成为一种新的药物作用靶点，而且极有希望成为最安全、有效的治疗肿瘤的理想途径。端粒酶抑制剂的研究主要针对其不同的组分及不同的结构，由于G四螺旋能阻断RNA聚合酶，因此当基因密码区的富含G重复序列形成G四螺旋而又不易解聚时，会起到抑制RNA聚合酶的作用，从而引起早期转录的停止。靶向端粒酶集中在以下三个方面第一个方面以端粒酶RNA为靶点，第二个方面是抑制端粒酶逆转录酶活性，第三个方面是G四链体的稳定剂，第四个方面是开发端粒酶抑制剂的新靶点。G四螺旋结构的稳定剂或G四螺旋形成诱导剂的优势在于G四螺旋结构具有特异性，故具备更强的选择性，从而大大降低了传统化疗药物的毒性。由此，以GQUADRUPLEX为靶点来寻求能够诱导、稳定或识别四链体结构的小分子是当前研究开发抗肿瘤药物重要途径之一。综合以上所述，G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系可以归结为下面这个流程图。图110G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系示意图15本文所做的工作本文将合成一种顺铂配合物，用荧光光谱、紫外光谱观察金属配合物与DNA的G四链体的键合作用及性质。主要做了以下工作（1）合成配体DPQDF。（2）合成铂配合物（3）对所合成的配合物进行核磁与质谱检测。（4）用荧光光谱、紫外光谱观察两种不同辅助配体的钌配合物与DNA的G四链体的键合作用及性质。2理论部分21配合物与DNA作用的基本形式作用于G四链体的小分子配体是通过识别和稳定G四链体而抑制端粒酶活性的，研究表明，小分子配体和不同结构的G四链体结合模式不同。分子模拟显示，配体可以非共价键结合形式堆积在末端G四分体上，结合在沟上、环上或插入两个G四分体平面之间。据文献报道，小分子配体与G四链体的作用模式主要有两种外部堆积模式和插入模式如图21所示。1外部堆积模式。即小分子配体和GQUADRUPLEX的末端G四链体形成共轭结构；2插入模式。即小分子配体插入到两个G四链体之间；3非特异结合模式。通过氢键和静电作用于沟槽、LOOP上。由于溶液中小分子配体G四链体之间的结合处于动态平衡状态，导致NMR图谱很难解析，因此，关于复合物的NMR结构数据非常缺乏，给研究小分子配体的结合模式带来了困难。总的来说，插入模式由于只有一部分碱基和配体结合，易失衡，从而导致整个GQUADRUPLEX结构的分解。外部堆积模式来有许多结构特点来维持整个分子能量稳定，末端G四分体更容易与配体形成共轭结构，结合位点较易识别，动力学稳定，化合物的作用模式更倾向于外部堆积模式。图21小分子与G四链体的作用模式A外部堆积模式B插入模式C非特异性结合22DNA与配合物作用的研究方法221光谱学方法2211紫外可见光谱或电子光谱由于比较灵敏、直观、方便，它是研究金属配合物与DNA作用最常用的方法之一。一般来说，DNA加入金属配合物后，会对配合物的光、氧化还原等化学物理性质产生影响，通过研究DNA加入前后配合物性质的变化可对配合物与DNA的相互作用进行初步研究。吸收光谱是研究配合物与DNA相互作用比较直接的一种方法。配合物与DNA结合后，使合物所处的环境发生改变，吸收光谱波长和吸收强度发生变化，配合物与DNA作用方式不同，则波长和吸收强度变化不同。依据电子跃迁的机制，可将配合物的电子吸收光谱分为三种类型1）以金离子MN为中心的DD跃迁所产生的配位跃迁光谱；2）配体至金属或金属离子（LMCT）或金属离子至配体（MLCT）的电荷迁移光谱，简称荷移光谱；3）以配体L为中心的配体间的电子转移光谱（IL）。其中金属离子向配体的电子跃迁发生在金属离子具有充满的或接近充满的T2G轨道，而配体具有最低空轨道的配合物中。核酸分子由于其嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系，所以在紫外区260290NM处有特征的吸收，这种吸收随分子中各碱基的种类、所占比例以及碱基间的堆积方式等的改变而有所不同。一般来说，结构越有序，吸收值越低。因此，我们可利用紫外吸收光谱对上述各核酸分子结构的形成进行初步判断。当配合物插入到DNA碱基对时，对应的吸收峰产生明显的减色效应，并伴有一定程度的红移。2212荧光光谱荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。荧光物质在激发光的激发下，由基态跃迁到较高的能级激发态后，首先通过内转换过程消耗一部分能量，回到第一电子激发态的最低振动能级，同时以光量子的形式发射能量，即为荧光。配合物以插入方式与DNA作用后，由于它的振动模式受到抑制，或免受水分子的淬灭，配合物受到了DNA碱基疏水环境的保护，其发光强度一般会增强。并根据强度的变化来判断与DNA作用的强弱。2213圆二色谱及DNA解旋技术圆二色谱可以检测有无旋光物质的存在51，52，或比较左、右旋物质的混合物中哪种含量更多，测定透析后的配合物的CD光谱，还可帮助确定配合物与DNA的相互作用有无异构选择性。G四链体或IMOTIF结构在圆二色谱中有着特殊的峰结构平行型G四链体在265NM附近有正的最大吸收峰，240NM附近有负的最大吸收峰；反平行型的G四链体在295NM附近有最大正吸收峰，260NM有最大负吸收峰；混合式的G四链体构型则包括了290NM附近的正吸收以及特征的265NM附近的肩峰。加入配合物后，会使其吸收峰发生移动并改变其强度，明显影响G四链体的CD光谱。这样的一种现象便有了一定的选择性变化，更容易区分G四链体的构型转化，反应配合物和DNA的结合模式。又由于CD光谱法灵敏度高，样品在很低的浓度下就可以检测到特征吸收，圆二色谱成为一个很有效的检测手段。利用圆二色谱仪同时可以做热变性的实验。DNA的变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。核酸由多链结构双螺旋或四螺旋变为单链结构的中点温度反应了该结构的稳定性，该温度的变化也反应了结构稳定性的变化。配合物与DNA作用方式不同，则DNA熔化温度TM变化程度就不同。当配合物与DNA以插入方式作用时，DNA熔化温度TM变化最大。2214其他光谱法线二色谱LD和电二色谱ED线二色谱和电二色谱都是采用与固定光轴方向在流动梯度体系中旋转和外加电场，使DNA螺旋轴取向固定平行或垂直的平面偏振光，测量结合DNA后的配合物对垂直和平行于DNA的线偏振光的不同吸收。瞬时共振拉曼光谱可以探测微环境的变化对配合物激发态的性质或行为的影响，从而可以用来研究配合物与DNA的作用机理。222流体力学方法应用流体力学技术测试DNA双螺旋长度变化。在确定小分子化合物与DNA作用模式方面，流体力学方法如粘度53，沉降速度及在凝胶中的泳动速度等有其独特的应用。223密度泛函计算与分子模拟密度泛函理论能够很好地考虑到体系中电子的相对能量，特别适合于单线态金属配合物的计算。由于密度泛函方法考虑了电子相关，计算速度快，并且能有效地估算配合物的分子结构、电子结构及其与DNA相互作用的前线分子轨道，引起了理论化学家的注意。密度泛函理论的计算对于科学家们设计新的功能独特的配合物有着重要的理论指导意义。此外，还有PH滴定、热力学方法和电化学方法等，不过这些方法在研究小分子化合物与DNA键合机理方面不太常用。3实验部分31引言本章介绍了铂多吡啶配合物的合成步骤，及其配合物的表征。在表征过程中特别是质谱方面上，有些系列的配合物均与应得的分子量有偏差，说明反应过程中可能发生了其他的副反应，所以实验步骤还有待探索。现列出实验步骤，以供参考、指正，预防此后的科研出现不必要的重复工作。本文设计合成得出了铂配合物PTAPPTENPF62，通过核磁、质谱表征方法证明为此种配合物。32药品和仪器311实验试剂试剂名称纯度级别生产厂家或提供商1，10邻菲咯啉AR国药盐酸羟胺AR国药甲醇AR国药氯仿AR国药钯碳催化剂AR国药丙酮AR国药乙醇AR国药氢氧化钾AR国药浓硫酸AR国药石油醚AR国药氢氧化钠AR国药二甲基甲酰胺AR国药乙二醇AR国药四氯合铂（）酸钾AR国药乙二胺AR国药乙二醇AR国药六氟磷酸铵98阿拉丁乙醚AR国药氯化钾AR国药氯化钠AR国药TRIS碱AR国药312实验仪器核磁共振波谱BRUCKER400M核磁共振波谱仪记录；电喷雾质谱（ESMS）用LCMS2010A型液相色谱质谱联用仪；高纯水用SZ97自动三重蒸馏水发生器获得；电子吸收光谱用LAMBDABIO40紫外分光光度计测量；荧光光谱用HITACHIFP7000荧光光度计测量。32配合物的合成及表征321配体的合成1）5硝基邻菲罗啉的合成NNNN150，REFLUXH2SO4N3NO2MOLECULARWEIGHT1802MOLECULARWEIGHT250称取邻菲罗啉5G置于100ML圆底烧瓶，加入30ML浓硫酸，缓慢升温至150，再逐滴加入15ML浓硝酸，反应物继续回流3小时后停止反应，冷却至室温，将反应混合液倾入含500G冰的烧杯中，用事先配制好的NAOH溶液（50GNAOH溶于200ML左右蒸馏水）调节反应液的PH值至接近中性（PH5）。抽滤得浅黄色固体，用冰水洗涤三次以上，所得产物在50干燥后备用。产率87。2）5氨基6硝基邻菲罗啉NNNO2NH2OHCLKETNNNO2NH2MOLECULARWEIGHT250MOLECULARWEIGHT240将4G（178MMOL）5硝基6氨基邻菲罗啉溶于100ML无水乙醇并加热回流，待反应物全溶之后加入8G（1189MMOL）盐酸羟胺，此时析出浅黄色悬浮固体，并在45分钟之内，往上述混合液中滴加KOH的乙醇溶液（9GKOH溶于100ML无水乙醇），反应混合物逐渐变为棕黄色。继续回流30分钟后停止反应，冷却至室温后，将反应液倒入300600ML冰水中，静置一夜后抽滤，滤饼分别用水、甲醇和氯仿洗涤后干燥，得产物16G产率35。3）5，6二氨基邻菲罗啉NNNO2NH2N2H42OPD/CNNNH2NH2MOLECULARWEIGHT240MOLECULARWEIGHT2103将04G5硝基6氨基邻菲罗啉溶于400ML无水乙醇，加热回流至全溶，再加02GPD/C催化剂（10PD）搅拌混合均匀，并在15MIN之内逐滴加入4ML水合肼（80）。继续回流1小时后停止反应，趁热过滤，旋蒸浓缩滤液，再加入过量的石油醚后析出黄色固体，抽滤后用石油醚洗涤滤饼真空干燥。产率68。4）双呋喃基DPQDF的合成NNNH2NH2OOOONNNNOOCHEMICALFORULAC2H1N42MWEIGHT36CHEMICALFORULA12H0N4MOLECULARWEIGHT2103CHEMICALFORULAC10H6O4MOLUWEIGHT95DMF1402D5，6二氨基1，10邻菲罗啉（025G，12MMOL），2，2双呋喃二酮（023G，12MMOL），溶于20MLDMF置于100ML三颈瓶中，在氮气保护下回流2天。反应结束后，冷却抽滤，所得固体用温甲醇洗涤，干燥，产物黄绿色絮状固体，净重025G，产率57。322铂配合物的合成对于铂配合物的合成，设计了如下一种，并对其进行了合成。因时间关系，没有对其进行再次的纯化。1DPQDFPTCL2的合成将DPQDF01822G05MMOL加入一圆底烧瓶中，向其中加入35ML乙二醇加热近沸，全部溶解后，缓缓加入用5ML高纯水溶解的02090G05MMOL的K2PTCL4梅红色晶体，130OC加热回流6小时，出现红棕色沉淀。将其自然冷却至室温，避光放置过夜。过滤，用水洗涤，去掉未反应的K2PTCL4，然后用少量乙醇、乙醚洗涤并进行干燥。最后得红棕色粉末固体02432G，产率7715。2DPQDFPTENPF62的合成将乙二胺240L加入混有20ML乙二醇和02400GDPQDFPTCL2的圆底烧瓶中，加热100OC回流3H，未全部溶解。待反应完成后，加少量水稀释，过滤出不溶物为反应的配体，向滤液中加入NH4PF6饱和溶液，产生沉淀，静置一夜后，用慢速滤纸因沉淀颗粒太小两层进行过滤。用乙醇、乙醚洗涤干燥，得到咖啡色固体02804G，产率81。3DPQDFPTENPF62的表征图31DPQDFPTENPF62的1HNMR谱图42PTAPPTENPF62的质谱示意图33不同辅助配体的多吡啶配合物与G四链体DNA的相互作用的研究331缓冲溶液的配制缓冲溶液用高纯水配制缓冲溶液1100MMKCL，10MMTRIS，PH7缓冲溶液2100MMNACL，10MMTRIS，PH7332配合物与DNA浓度的确定3321配合物浓度的确定配合物1RUBPY2DPQDF2配合物2RUPHEN2DPQDF2称取一定质量配合物分别用高纯水和缓冲液1、2、3、4溶解3322DNA的处理和浓度确定1）富G单链DNA取一定质量富G单链DNA，溶于高纯水，放入4冰箱保持24H，备用。浓度确定用紫外分光光度计测量DNA在260NM的吸光度值A260。摩尔消光系数为2285105M3CM1，DNA浓度DNAKA260/2285105（K是稀释倍数），单位是MOLL1。2）富G四螺旋DNA取两份一定质量富G单链DNA（核苷酸序列为5AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG3），分别溶于缓冲液1及缓冲溶液2中，缓冲溶液476UL，密封加热到90，并保持5分钟。然后自然冷却到室温，放入4冰箱中保持24小时，备用。浓度确定用紫外分光光度计测量DNA在260NM的吸光度值A260。摩尔消光系数为2285105M3CM1，取DNA50UL，再加入4950的缓冲液，稀释倍数为100倍，DNA浓度DNAKA260/2285105（K是稀释倍数），单位是MOLL1。3223配合物与G四链体相互作用的紫外可见光谱滴定在紫外可见吸收光谱仪的双光路系统中，先往参比池中加入475UL缓冲溶液做参比，基线稳定后，往样品池中加入浓度为10UM的配合物溶液25UL，用微量进样器每次往参比池和样品池中加入5UL的DNA储备液，混匀5MIN后，使DNA在配合物溶液中的浓度比值不断增加，直至饱和。在200800NM范围内检测配合物的电子吸收光谱的变化。3224配合物与G四链体作用的荧光光谱滴定在样品池中加入1950UL的缓冲溶液以及50ULDNA储备液，测定溶液在620NM（440NM激发）处发光强度，随后样品池中每次加入10UL浓度为200UM的配合物1、2溶液，用移液枪反复吸吐，混匀，5分钟后检测荧光情况，如此反复，滴加10次。4结果和讨论41配合物与G四链体电子吸收光谱研究紫外光谱是研究小分子配合物与DNA相互作用的一种最简便、最常用的技术。价键理论认为，每个分子都有一系列严格分立的能级，处于低能级的分子受到光的能量激发时，可吸收特征频率的光子而跃迁到较高的能级，进而产生吸收光谱。许多小分子配合物本身在紫外可见光区有特征吸收峰，当小分子配合物与DNA相互作用时，通常会出现相应的特征变化，表现为吸收谱带变宽、吸收峰红移或蓝移及减色效应）。这种现象的产生往往来源于小分子配合物发色团与DNA碱基电子云的强烈相互作用。因此，紫外可见吸收光谱可以用来研究小分子配合物与G四链体DNA的相互作用，进而根据其产生的相应特征变化推测其作用模式。在紫外光谱图中图41、42、43、44，300NM以下的吸收峰为配体间的跃迁峰（IL，而可见光区450NM附近的吸收峰为配合物的MLCT峰，可以归属为RUDDPQDF的跃迁吸收。但是由于两个吸收峰所在波长比较接近，因此在图中只表现为一个宽的吸收带。配合物与两种端粒DNA作用后的LC峰和MLCT峰表现出了明显的减色效应和一定程度的红移现象，因为DNA在可见光区没有吸收，推测配合物1、2在K、NA缓冲溶液环境中都能与G四链体发生某种相互作用。同时，一般认为配合物与DNA作用时，峰值减小并伴随红移，电子吸收值改变越大，则配合物与DNA作用越强。从图中可以看出，对于K缓冲条件下，以MLCT峰看，配合物与DNA作用后的减色率比在NA缓冲条件下的减色率大。产生以上现象的原因可能是由于K环境下形成的DNA微观结构更有利于其与配合物的键合。30405001ABSWAVELNGTH/NM合5ULDNA105ULA20DN5ULA图41钾离子缓冲溶液配合物1与端粒GQUADRUPLEX作用的紫外滴定曲线,RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。30405001ABSWAVELNGTH/NM合5ULDNA105ULA20DN5ULA图42钠离子缓冲溶液配合物1与端粒GQUADRUPLEX作用的紫外滴定曲线,RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。30405001ABSWAVELNGTH/NM合5ULDNA105ULA20DN5ULA305ULDNA40图43钾离子缓冲溶液配合物2与端粒GQUADRUPLEX作用的紫外滴定曲线,RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8M。30405001ABSWAVELNGTH/NM合5ULDNA105ULA20DN5ULA305ULDNA40图44钠离子缓冲溶液配合物2与端粒GQUADRUPLEX作用的紫外滴定曲线,RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8M。四种配合物在260280NM附近出现较强的吸收峰，在450NM附近出现较弱的的吸收峰，均可归属为配体中的跃迁，450NM附近的吸收峰对应于金属钌配位体电荷转移（MLCT）。从图中显示，随着AG3T2AG33浓度的逐渐增加，配合物在紫外区吸收光谱都能够出现明显减色现象和一定红移，但MLCT峰的峰值与位移变化不大。以上信息表明配合物可以与AG3T2AG33的碱基发生强烈的作用。根据图45、46、47、48，DNA滴定缓冲溶液450NM附近的吸收峰变化趋势图表明，DNA结合了钌配合物，保护了钌配合物的主配体，使得吸收峰减小。一般对于双链DNA来说，当配合物以插入方式进入DNA的碱基对时，与碱基对发生电子堆积效应，其空轨道与碱基的电子轨道发生耦合，能级下降，从而导致跃迁能减小，产生红移现象。同时，耦合后的轨道因部分填充电子，使跃迁几率减小，产生减色效应。但是，对于插入剂结合到四链体里面的G四分体之间是相当困难的，不仅仅是因为四链体是一个稳定和刚性的结构，同时因为破坏四链体的完整性需要耗费很高的能量。因此，推测配合物1是通过堆积到G四链体末端的四分体与G四链体作用的，即以外部堆积模式结合的。012345015001501600165017001750180INTESITYCONCETRATION/UM图45DNA滴定钾离子缓冲溶液配合物1在450NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。01234501501520153015401501560157015801590160INTESITYCONCETRATION/UM图46DNA滴定钠离子缓冲溶液配合物1在450NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。0246801340136013801400142014014601480150INTESITYCONETRATION/UM图47DNA滴定钾离子缓冲溶液配合物2在450NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。0246801001501200125013001350140INTESITYCONCETRATION/UM图48DNA滴定钠离子缓冲溶液配合物2在450NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM,450NM左右的吸收峰变化是由于DNA浓度的增加从0,1,2,3,4,5M。42钌配合物对端粒G四链体与DNA作用强度的研究人类的端粒含有重复衔接的双链DNA序列5TTAGGG5CCCTAA。这些重复序列的DNA可能形成特殊的拓扑结构。富G的链能在K、NA等阳离子诱导下形成由堆积的四分体组成通过氢键稳定的GQUADRUPLEX结构。G四链体被认为对体内端粒酶延长端粒具有负向调控作用。目前，G四链体被认为是潜在的癌症治疗靶标。通常认为，多吡啶钌配合物与DNA结合后，如果出现荧光增强现象，说明配合物与DNA之间发生了某种方式的结合。荧光增强幅度的大小，基本上可以反映出配合物与DNA作用的强弱。因此，我们也可以根据作用强度差异表现出的荧光强度变化来识别不同种类的DNA。从图49、410、411、412中可以看出，DNA在钾、钠离子缓冲溶液中几乎没有发光。当加入配合物1、2后，荧光显著增强，推测产生以上结果是由于G四链体末端的四分体结构便于平面芳香环堆积，所以荧光大幅增强。说明配合物与G四链体的键合能力很强。因此可以通过观察荧光强度的变化情况来识别特异性端粒结构，图中变化情况还显示K环境下G四链体的加入对配合物1，2的荧光强度影响大于NA环境下的荧光强度变化。也说明K缓冲环境对着两种结构识别区分效果更好，这可能是由于K缓冲条件下形成的的G四链体更有利于其与配合物的作用。5050606507075080050101502025030INTESITYWAVELNGTH/NMDNA10UL合1230UL14合50UL1670UL合1890UL11合图49钾离子缓冲液中，配合物1与GQUADRUPLEX作用的荧光滴定曲线，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。50506065070750800501015020250INTESITYWAVELNGTH/NMDNA10UL合1230UL14合50UL1670UL合1890UL1图410纳离子缓冲液中，配合物1与GQUADRUPLEX作用的荧光滴定曲线，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。5050606507075080050101502025030INTESITYWAVELNGTH/NMDNA10UL合1230UL14合50UL1670UL合1890UL11合0UL1图411钾离子缓冲液中，配合物2与GQUADRUPLEX作用的荧光滴定曲线，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。5050606507075080202040608010120140160180INTESITYWAVELNGTH/NMDNA10UL合1230UL14合50UL1670UL合1890UL1图412钠离子缓冲液中，配合物2与GQUADRUPLEX作用的荧光滴定曲线，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。根据图413、414、415、416，由配合物滴定DNA钾、钠离子缓冲溶液，由于DNA是多齿配体，可以与配合物进行多方面结合，荧光强度不断增强，结合比大于一比一。0246810501015020INTESITYCONCETRATION/UM图413配合物1滴定DNA钾离子缓冲溶液在600NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。02468100501015020INTESITYCONCETRATION/UM图414配合物1滴定DNA钠离子缓冲溶液在600NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物1浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。02468101250101502025030INTESITYCONCETRATION/UM图415配合物2滴定DNA钾离子缓冲溶液在600NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物2浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。02468102040608010120140160180INTESITYCONCETRATION/UM图416配合物2滴定DNA钠离子缓冲溶液在600NM左右的吸收峰滴定趋势图，RU10UM，600NM左右的吸收峰变化是由于配合物2浓度的增加从0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10M。5结论和展望51结论本文设计合成了一个铂配合物，运用两种手段研究了钌配合物与端粒DNAG四链体结构的键合作用，得到了以下结论（1）通过核磁、质谱表征方法证明首次合成了铂配合物即PTAPPTENPF62，只是由于时间限制，没有进行再次提纯。（2）紫外吸收光谱发生一定的增色效应，但变化幅度很小，钌配合物很有可能与DNAAG3T2AG33的作用模式是外部堆积模式，又由于此