甘草中甘草苷含量测定

长沙医学院毕业设计论文课题名称HPLC法测定参苓散中甘草苷的含量学生姓名姜声正学号12007050601039系、年级专业07级本科药学指导教师肖海英职称讲师2011年6月9日诚信声明本文郑重声明所呈交的学位论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名日期年月日I高效液相色谱法测定参苓散中甘草苷含量姜声正长沙医学院药学系07级药学本科摘要目的用HPLC法测定参苓散中甘草苷的含量。方法分别采用DIAMOSILC1846MM250MM5M和AGILENTTCC18250MM46MM5M），乙腈05冰醋酸（1090）为流动相，流速为10ML/MIN，检测波长为276NM，柱温为35，结果平均回收率为1016，RSD为19，R09998。结论本方法可作为参苓散中甘草苷含量质量控制的一种有效方法。关键词参苓散；甘草苷；高效液相色谱法；含量测定IIDETERMINATIONOFLIQUIRITININSHENLINGPOWDERBYHPLCJIANGSHENGZHENGGRADE2007，PARMACYDEPARTMENTOFCHANGSHAMEDICALCOLLEGEABSTRACTOBJECTIVEDETERMINATIONOFLIQUIRITININSHENLINGPOWDERBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYMETHODSBASEDONUSINGRESPECTIVELYDIAMOSILC1846MM250MM5M，AGILENTTCC18250MM46MM5M），ACETONITRILE05ANDGLACIALACETICACID（1090）FORMOVINGPHASEATTHEFLOWVELOCITYOF10ML/MIN，THEMETHODISTODETERMINEIFTHEWAVELENGTHIS276NMANDTHATCOLUMNTEMPERATUREIS35RESULTSAVERAGERECOVERYRATE1016RSD19R09998。CONCLUSIONTHISMETHODISANEFFECTIVEWAYTOQUALITATIVELYCONTROLTHECONTENTOFLIQUIRITININSHENLINGPOWDERKEYWORDSSHENLINGPOWDER；LIQUIRITIN；HPLC；ASSAYING目录摘要IABSTRACT前言11实验材料211仪器212试药22方法与结果321色谱条件322对照品溶液的制备323测定波长的确定324流动相的选择425线性关系考察626检测限627定量限728供试品溶液的制备729阴性对照溶液测定10210精密度试验11211稳定性试验12212重复性试验12213回收率试验13214样品含量测定133讨论1531流动相的选择1532提取方法的选择1533测定波长的选择15参考文献16综述17致谢281前言参苓散为湘潭飞鸽药业有限公司独家品种，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第八册。参苓散的主要成分是人参、茯苓、甘草、白术、党参等。因文献报道甘草苷14对大白鼠幽门结扎形成的溃疡有抑制作用，显示甘草苷成分与本品功能与主治“补气健脾，和胃渗湿”密切关联，故选择以“甘草苷”作为测定指标。现为提高的该药品的质量标准，加入了用高效液相色谱法测定药物中甘草苷的含量。张崇禧等5用HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量，并提出甘草苷在0406G范围内具有良好的线性关系，R09998，平均回收率N3为10050，RSD022。高玉峰等6用RPHPLC法测定了沙参止咳汤散中甘草苷含量，并提出采用SHIMPACKVPODS46MM150MM，5M色谱柱，流动相为乙腈一05冰醋酸溶液2080为流动相；流速10MLMIN1，检测波长276NM，柱温为30。结果甘草苷进样量在00210G范围内与峰面积线性关系良好，R09999，平均加样回收率为9675，RSD108N6。伍尉萍等7用HPLC法测定甘草中甘草苷的含量。本实验用HPLC法测定参苓散中甘草苷的含量。21实验材料11仪器仪器AGILENT1100高效液相色谱仪。检测器VWD色谱柱DIAMOSILC1846MM250MM5M柱温35色谱工作站LC系统化学工作站12试药参苓散（批号081125），甘草苷（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号11610200604）。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。32方法与结果21色谱条件色谱柱DIAMOSILC1846MM250MM5M，流动相乙腈05冰醋酸（1090）；流速10MLMIN，检测波长276NM，柱温35。22对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品1854MG，置20ML量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液1ML，置25ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（3708G/ML）。精密量取储备液5ML，置100ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（4635G/ML）。精密量取储备液1ML，置50ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ML，置200ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（00927G/ML）。精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品819MG，置25ML量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ML，置100ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（1638G/ML）。精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品1162MG，置25ML量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ML，10ML量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（2324G/ML）。23测定波长的确定取上述对照品溶液，照紫外分光光度法，在200400NM范围内扫描（仪器UV2401PCSLIT10；快速扫描），结果在2758NM和218NM波长处有最大吸收，因考虑218NM为末端吸收，故选择276NM作为检测波长，见图21。4图21甘草苷对照品溶液紫外光谱24流动相的选择甲醇01磷酸3070）。甲醇05冰醋酸（3070）。乙腈05冰醋酸（1090）。|分别采用上述三种流动相，精密吸取对照品溶液10L，注入液相色谱仪，测定。其色谱峰结果见表21，其图见图22、23、24。观察色谱峰峰形，以流动相的色谱峰对称性较好，且理论踏板数明显高于前两种流动相，故选择流动相。表21流动相比较表流动相编号峰面积积分值理论板数拖尾因子9074467234420629016517335590638909583759910965MIN05101520253035MAU50510152025VWD1A,为276NME为2087为为为07501D32476图22流动相对照品色谱图MIN05101520253035MAU50510152025VWD1A,为276NME为2087为为为为01为D3508图23流动相对照品色谱图MIN05101520253035MAU010203040VWD1A,为276NME为2087为为08707208701546SIG107D24579图24流动相对照品色谱图成分甘草苷保留时间321分钟理论板数3442拖尾因子062成分甘草苷保留时间350分钟理论板数3559拖尾因子063成分甘草苷保留时间245分钟理论板数5991拖尾因子096625线性关系考察精密吸取对照品溶液（3708G/ML）1、2、4、6、8、10L，注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量（NG）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y19429X17405R09998。结果表明甘草苷对照品在37083708NG范围内线性关系良好，结果见图25、表22。图25甘草苷标准曲线图表22线性关系试验结果表进样量（NG）峰面积积分值3708680649074161468075014832280993872224843469821296645747227837087175656126检测限精密吸取对照品溶液（00927G/ML）4L，注入液相色谱仪，测定，信噪比为23，故检测限为03708NG（图26）。01002003004005006007008000501001502002503003504007MIN051015202530354045MAU50050101502VWD1A,为276NMZW3208927046350921D为265413901图26检测限27定量限精密吸取对照品溶液（00927G/ML）20L，注入液相色谱仪，测定，信噪比约为10，故检测限为1854NG。28供试品溶液的制备取本品（批号081125）10袋内容物，混匀，备用。281仪器与试药仪器AGILENT1200高效液相色谱仪检测器VWD色谱柱AGILENTTCC18250MM46MM5M）流动相乙腈05冰醋酸（1090）其余色谱条件同前。282提取溶剂的选择取上述粉末五份，每份约5G，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，依次精密加入水、30乙醇、50乙醇、70乙醇、无水乙醇25ML，称定重量，密塞，超声处理（300W，25KHZ）30分钟（时时振摇），放冷，称重，分别用各溶剂补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10L，注入液相色谱仪，测定并计算，结果见表23。8表23提取溶剂选择结果比较表编号取样量（G）提取溶剂峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（MG/G）1701363849790水168616121693762500411299809575120830乙醇299677982997437800707364588625055750乙醇36388333642359600870327713075065670乙醇329988313288506900784370644550145无水乙醇3647997367722100088结果表明，用上述溶剂提取供试品，以50乙醇测得含量结果最高，因此选择以50乙醇为提取溶剂。283提取时间的考察取上述粉末四份，每份约5G，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ML，密塞，称定重量，分别超声处理（300W，25KHZ）15分钟、30分钟、45分钟、60分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法密吸取对照品溶液与供试品溶液各10L，注入液相色谱仪，测定，并计算，结果见表24。9表24提取时间选择结果比较表编号取样量（G）提取时间峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（MG/G）349197815009915分钟346306463477521400838353757175099230分钟355732123547446500840364588625055745分钟3638833364235960087036166555016860分钟364410033630377700874结果表明，15分钟和30分钟所得的提取得率稍低，45分钟和60分钟所得的提取得率相近，因此提取时间选择为45分钟。284提取方法选择取上述粉末5G，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ML，密塞，称定重量，超声处理（300W，25KHZ）45分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。表25提取方法选择结果比较表编号取样量（G）提取方法峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（MG/G）3645886250557超声处理45分钟3638833036423596008703315907050853回流提取45分钟3329216933225620078910取上述粉末5G，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ML，密塞，称定重量，回流提取45分钟，放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法精密吸取对照品溶液及各供试品溶液各10L，注入液相色谱仪，测定并计算，结果见表25。结果表明，超声提取方法测得含量结果较高，故选择超声处理为提取方法。综合上述三个方面的考察结果，确定供试品溶液制备方法为取本品装量差异下的内容物混匀，取约5G，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ML，密塞，称定重量，超声处理（300W，25KHZ）45分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。29阴性对照溶液测定按处方称取除甘草外的其余各药材，制成缺甘草的阴性对照样品，同法制成缺甘草的阴性对照溶液，依法测定。MIN05101520253035MAU50510152025VWD1A,为276NME为209为为0923092408530791D图27阴性对照溶液色谱图MIN05101520253035MAU50510152025VWD1A,为276NME为209为为为0923092518024102D26034成分甘草苷保留时间260分钟理论板数5578拖尾因子08311图28样品溶液色谱图MIN05101520253035MAU50510152025VWD1A,为276NME为209为为为09230925180254102D25831图29对照溶液色谱图结果阴性对照溶液的色谱图中，在与甘草苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，说明阴性样品无干扰（图27、28、29）。210精密度试验精密吸取同一供试品溶液，进样6次，每次10L，依法测定，其甘草苷峰面积积分值的RSD为13，结果表明仪器精密度良好，见表27。表27精密度试验结果表编号峰面积积分值平均RSD1349705702356845583349457064357296055361344856355395363550074313成分甘草苷保留时间438分钟理论板数5983拖尾因子083成分甘草苷保留时间258分钟理论板数5283拖尾因子09112211稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后的0、1、2、4、6、8、10、12小时，精密吸取10L，注入液相色谱仪，测定，结果见表28。结果表明供试品溶液在配制后12小时内稳定。表28稳定性试验结果表时间（H）峰面积积分值平均峰面积RSD03497057013568455823494570643572960563613448583553953610358276551235493222355406671312212重复性试验表29重复性试验结果编号取样量（G）峰面积积分值峰面积积分值平均值测定结果（MG/G）平均值（MG/G）RSD349701575014034665591348178740083835194305500953497580335085054008463524616450252355107763537847000850360987345026035741766359202500086336172195501023610045536136325008713602123750385361833313610228400865008551513取同一批号（0704016）样品6份，依法制备供试品溶液并测定，结果见表29。结果表明本方法重复性较好。213回收率试验取已测定含量的同一批号（081125）样品粉末（含甘草苷0086MG/G）约27G，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中，各精密加入对照品溶液（2324G/ML）1ML，回收溶剂至干，放冷，依法制备供试品溶液，测定并计算。结果见表210。结果表明本方法加样回收率较好。表210回收率试验结果表编号取样量（G）样品中甘草苷含量（MG）添加甘草苷量（MG）实测甘草苷量（MG）回收率（）平均回收率RSD127399023560465999022798102378047831034327521023390473810324275480236904750102452778702389047721025627521023660232404677994101619214样品含量测定对湘潭飞鸽药业有限公司提供的样品（081125、0704016、0704026、0704036）进行含量测定，结果见表211。该品种因市场原因，生产单位很少生产，上述四批样品为生产单位为提高行动计划研究工作生产。以上四批样品甘草苷平均结果为0032MG/G，按平均结果约75计算，暂定本品每1G含甘草以甘草苷（C21H22O9）计，不得少于0025MG。按中国药典2005年版一部“甘草”项下限度规定，计算理论转移率为112。14表211参苓散中甘草苷含量测定结果批号取样量（G）峰面积积分值峰面积积分值平均值测定结果（MG/G）测定结果平均值（MG/G）3497015750140346655913481787400833519430508112550095349758033508505400840083645158600155016865468256499205500156611726001507040165038166733546642540001500156651749001649755664953466506415001666360290016070402650303679755667167925001600166743661001649731686756568056130016690873400160704036500226881810689527200160016153讨论31流动相的选择流动相分别试验了甲醇01磷酸3070），甲醇05冰醋酸（3070），乙腈05冰醋酸（1090）经试验采用乙腈一05MOLL冰醋酸1090系统时，甘草苷能够与其他成分有效分离，且峰型较好。32提取方法的选择取上述粉末四份，每份约5G，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ML，密塞，称定重量，分别超声处理（300W，25KHZ）15分钟、30分钟、45分钟、60分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液。结果表明，15分钟和30分钟所得的提取得率稍低，45分钟和60分钟所得的提取得率相近，因此提取时间选择为45分钟。33测定波长的选择取甘草苷对照品溶液，照紫外分光光度法，在200400NM范围内扫描（仪器UV2401PCSLIT10；快速扫描），结果在2758NM和218NM波长处有最大吸收，因考虑218NM为末端吸收，故选择276NM作为检测。该方法以乙腈05MOLL冰醋酸1090为流动相，采用超声提取的方法测定甘草中甘草苷的含量，实验简单、精密度高，结果准确可靠，可作为参苓散中甘草苷含量质量控制的一种有效方法。16参考文献1中国药典一部M2005592彭励，胡正海甘草生物学及化学成分的研究进展J中草药，2009，3611174417473ZHANGJ，YAOJ，YANGYL。ANALYSISANDMENSURATECONTENTSOFALKALOIDINLIQUORICEJAETABOTBOREALOECIDANTSIN，2001，215125912624植物药有效成分手册M人民卫生出版社，1986年第一版6735张崇禧，杨春花，蔡恩博HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量，中国中药杂志。2008，2875935976高玉峰，巴图德力根，青玉RPHPLC法测定沙参止咳汤散中甘草苷含量，中国中医药科技，2010，5（17）2322337伍尉萍，阎宏涛，孙文基HPLC法测定甘草中甘草苷的含量J药物分析杂志，2004，24（4）42517综述国内甘草苷测定方法研究进展摘要综述了近年来国内甘草苷测定方法研究概况，系统介绍了目前国内常用的甘草苷含量测定方法高效液相色普法、反相高效液相色谱法、薄层扫描法等，并预测了甘草苷测定方法未来的发展趋势。关键词甘草苷；含量测定；方法；综述甘草为豆科甘草属植物，其根茎是常用的中草药和经济植物1，素有“国老”之称。甘草具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的作用。现代药理研究证明，甘草具有抗炎、抗变态反应、抗溃疡、抗HIV、诱生干扰素、调节细胞免疫功能、抗癌等作用2。甘草苷作为甘草中的主要有效成分，在医药、食品、化妆品、卷烟等行业有着极其广泛的应用3。甘草及其产品中常以甘草苷作为定量指标，用于评价药材、成药的质量，制剂稳定性的优劣，制订药品质量标准等4。甘草配方品种繁多，成分多样，而且含量变化不一，即使同一配方的药物，因产地、栽培方法、生长环境和采收季节的不同，其成分及含量相差很大。甘草有效成分的分析测定是一项复杂而艰巨的工作。因此，见诸于文献的甘草苷含量定量分析方法有很多，主要有原子吸收法、一次展开二维薄层色谱电泳法、小波变换二次微分示波计时电位法、薄层紫外分光光度法、双波长薄层扫描法、薄层层析法、离子抑制色谱法、重量法、RPHPLC法、比色法、极谱催化波法、高效液相色谱气相、色谱法等。近几年来，高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和RPHPLC法应用比较广泛，尤其是应用高效液相色谱法定量分析甘草苷含量发展迅速。181高效液相色谱法20世纪60年代，在HORVATHLIPSKY，KIRLAND和HUBER等人研制出高效液相色谱HPLC仪后，由于HPLC和其它分离方法相比具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重复性好和操作方便等优点，很快就在中草药化学研究中得到了广泛的应用，随着HPLC方法的发展和完善，现在已成为中草药化学中不可缺少的主要分离方法之一5。在甘草苷测定过程中，应用最广泛的是分析型HPLC。蓝煜6采用高效液相色谱法测定独活寄生丸中甘草苷含量的结果表明，方法准确，快速，可靠。仪器为岛津LC6A高效液相色谱仪SPD6AV紫外检测器色谱条件INERTSILODS25MM，46250MM流动相水乙腈8515检测波长230NM流速08ML/MIN柱温30。范吕林7采用高效液相色谱法测定复方甘草合剂中甘草苷的含量，结果较为满意。研究时应用美国WATERS公司高效液相色谱系统，色谱条件色谱柱NOVAPAKC184M，39150MM流动相为水乙腈醋酸63372检测波长254NM流速10ML/MIN柱温30。梁月琴等8用高效液相色谱法测定甘草及其制剂中甘草苷含量，发现此法提取简单，测定迅速，精密度较好。使用设备为美国PERKINELMER液相色谱仪，LC235C紫外检测器，1022LC数据处理仪，WATERS不锈钢色谱柱NOVAPAKTMC185M39MM150MM，流动相为甲醇0066MOL/L乙醇溶液6535，流速1ML/MIN，检测波长155NM。张和平等9建立了一种简便、快速测定血液中微量甘草苷含量的HPLC法，该方法利用的是BECKMAN高效液相色谱系统，色谱条件流动相为甲醇水乙腈冰乙酸6023161，流速1ML/MIN，紫外检测波长252NM，量程02AUFS。色谱柱ODSC18柱250MM46MM。张继等10通过HPLC法对刺果甘草进行的甘草苷定量分析，为甘草的质量评价提供了依据美国VARIAN公司5000型高效液相色谱仪，美国VARIAN公司CDS401型数据处理机，PAKSPMCH5，40MM150MM不锈钢色谱柱，流动相为70甲醇30水05冰乙酸。机温30，流速10ML/MIN，紫外检测器波长254NM。宋洪杰等11采用高效液相色谱法测定胃脘舒冲剂中甘草苷的含量，以对羟基苯甲酸丁酯为内标物，甲醇水36醋酸65287为流动相，SHIMPACKCLCODS柱60MM150MM，流速10ML/MIN，检测波长254NM。曹爱兰等12建立了高效19液相色谱测定方法，测定了54份样品。仪器为日立63850型高效液相色谱仪，635M多波段紫外检测器，色谱柱PRC1846MM220MM，10M，流动相为甲醇水36醋酸71281，流速1ML/MIN，检测波长250NM。王荣等13运用高效液相色谱法系统地对7种不同剂型的甘草复方制剂中甘草苷的含量进行测定以ZORBAXODS46MM25CM为固定相，流动相为乙腈1ML/L乙酸3362，紫外检测波长为238NM，实验表明，运用HPLC对甘草复方制剂中的甘草苷进行质量控制的结果是可信的，令人满意。米慕真等14以HPLC外标工作曲线法，选择ODS色谱柱，甲醇四氢呋喃1醋酸372179449为流动相，对甘草的6个品种的24个样品进行了含量测定，结果表明，不同品种、不同产地的甘草中甘草苷含量差异较大。崔铉玖等15采用韩国盈仁科学仪器公司高效液相色谱仪色谱柱BONDAPACKC18，39MM300MM，流动相为乙腈15MOL/L冰醋酸水溶液3565，紫外检测波长254NM测定了芎芷香苏散流浸膏中甘草苷的含量，结果表明，本方法操作简便，被测成分分离完全，测定结果准确。马德明等16用美国SP8810高效液相色谱仪SP8450检测器，ODS46MM150MM色谱柱，流动相CH3CNNAH2PO4缓冲液4070，检测波长254NM测定精致银翘解毒片中甘草苷的含量，发现该方法具有良好的稳定性，方法可靠。邵国良等17采用美国WATERS高效液相色谱仪色谱柱C185150MM5MM，流动相甲醇水36醋酸683205，检测波长254NM测定克尔迈口服液中甘草苷的含量，实验结果表明，结果稳定，操作简便，测定迅速。杜海燕等18采用日本岛津LC6A高效液相色谱系统ODS分析柱46MM150MM，流动相为005MOL/LKH2PO4PH25MECN2110，检测波长254NM测定牛黄清心丸中甘草苷含量，结果表明，该方法简便，准确。朱兰等19采用美国WATERS高效液相色谱仪色谱柱BONDAPAKC18，39MM300MM流动相为甲醇15MOL/L冰醋酸水溶液6832检测波长254NM测定胃脘舒冲剂中甘草苷的含量，其方法简便、准确、重现性好。刘荣华等20采用高效液相色谱仪USAWATERS510双泵，U6K进样器，996PDA检测器USA，MILLENNIUM2010V20色谱管理系统，色谱柱NOVAPAKC1839MM150MM，401M。流动相为甲醇水7030，用冰醋酸调至PH56，检测波20长254NM测定炙甘草汤中甘草苷含量，为中药的复方制剂研究提供了实验依据。虽然高效液相色谱法是最常用的分析手段，有很多优点，但目前仍需对其中一些重要内容加以研究，如长期自动化操作后其可信程度的保护、自动获取数据系统的建立、评价和识别偶然干扰以及测定专属性药物时进行的条件优化等。2反相高效液相色谱法反相高效液相色谱是HPLC中应用最广泛的一个分支，其操作方便，稳定性和重复性好，价格便宜。用作流动相的水以及能与水互溶的有机溶剂在价格和获取方便的程度上都比正相色谱中的烃类溶剂有利。特别是化学键合固定相上样品的不可逆吸附和溶剂的记忆效应小，使得极性组分以及在甲醇或乙腈中可溶解的非极性和弱极性组分在反相HPLC体系中都能有很好的溶解度和分离效率，更为突出的是分析对象多样化，灵活性大21。近年来，反相HPLC在甘草制剂质量控制中的应用得到了迅速发展。朱维华等22应用WATERS高效液相色谱仪6000A型高压泵U6K进样器，PSD1型可调波长UV/VIS检测器，CR1B微处理机。色谱柱YWGC1810M，不锈钢柱39MM250MM，流动相为乙腈甲醇水含有105HAC501585，检测波长248NM分析了甘草苷含量很少的太阳神口服液，结果表明这种方法简单、快速。王兰霞23利用SP8800型高效液相色谱仪美国SPECTRAPHYSICS，色谱柱为RP18220MM46MM，5M，美国SPECTRAPHYSICS，流动相为水乙腈醋酸36372，流速15ML/MIN，检测波长254NM测定了五味沙棘口服液中甘草苷的含量，结果表明这种测定方法操作简便、分析快速、重现性良好，可作为原料、中间体及制剂的质量控制手段。汪国华等24采用美国WATERS液相色谱仪510型恒流泵，996PDA检测器，U6K进样品，MILLENNIUM2010V20色谱管理系统，色谱条件YWGC18柱，200MM4MM，10M，G4ODS保护柱流动相甲醇水02冰醋酸7030，PH5，流速10ML/MIN，检测波长249MM测定了复方炙甘草颗粒中甘草苷的含量，结果表明这种方法可消除样品中阿胶等其他中药成分及辅料的干扰，操作简便，结果准确，重现性好。杨义芳等25应用日本WATERS公司的201型液相色谱仪色谱柱21YGWC18300MM4MM，粒径10M，流动相为甲醇1醋酸6832，柱温35，检测波长254NM测定了胖大海口含片中甘草苷的含量，表明本法灵敏、快速、准确、专属性强、重现性好。马鹏等26用反相高效液相色谱法测定了各中成药中甘草苷的含量。仪器为日本岛津LC9A高效液相色谱仪，包括SPD6AV紫外可见检测器，CR4A数据处理机，SCL6B自动进样品，CQ250超声振荡器，分析柱为SHIMPACKCLCODS60MM150MM，流动相为甲醇水6337含0005MOL/LTBAH，PH65，检测波长为254NM。在该色谱条件下，作为甘草的确认峰，该峰尖锐，对称，可进行定量测定。马鹏等27用反相高效液相色谱法测定葛根芩连汤的甘草苷含量，结果满意。仪器为日本岛津LC9A高效液相色谱仪，SPD6AV紫外可见进样器CR4A数据处理机色谱柱SHIMPACKCLCODS60150MM流动相甲醇水6535，含0005MOLTBAH，磷酸调PH65，检测波长254NM。荣志芬等28采用RPHPLCUV方法测定了复方止咳冲剂中甘草苷的含量，结果良好。仪器为VARIANHPLC系统，9010泵，9050UV检测器色谱柱C1839MM25CM，流动相为CH3OH05HACH2O05HAC257，检测波长254NM。官曙光等29采用LC6A高效液相色谱仪日本岛津，用反相高效液相色谱法测定桂甘胶囊中甘草苷的含量以RESOLVEODS柱为分析柱，流动相为甲醇水醋酸693105，检测波长254NM，方法简便可靠，精密度高。刘宝玲30应用岛津LC6A型高效液相色谱仪，INERTSILODS25柱5M、46MM250MM，日本岛津SPD6AUV检测器采用反相高效液相色谱法测定双料参茸中甘草苷的含量，流动相为含有0005MOL/LTBAH四丁基铵水甲醇3862，以磷酸调PH60，检测波长254NM，在这样的条件下，甘草苷得到较好的分离，方法重现性好。倪坤仪等31用反相高效液相色谱法测定了银翘解毒片中有效成分甘草苷的含量，该法准确、可靠，重现性好。仪器为WATERS高效液相色谱仪，510高压泵，490紫外可见波长检测器，740数据处理机。色谱柱YQGC18柱39MM200MM，5M，流动相为乙腈水4951，甘草苷检测波长248NM。杨吉田等32用反相高效液相色谱法对止痛胶囊中甘草苷含量测定方法进行了研究，仪器为日本岛津LC6A型高效液相色谱仪，SPD6AV可调波长检测器，色谱柱为岛津SHIMPACKCLCODS6150MM，流动相甲醇水36醋酸溶液65287，检测波长22254NM。实验结果证明，本法测定止痛胶囊中甘草苷的含量，方法简单、快速、容易，结果准确。王静竹等33以甘草苷单铵盐标准品为对照，应用反相高效液相色谱法测定了甘草及其炮制品中甘草苷的含量，所用仪器为WATERS高效液相色谱仪，510型泵，490E型紫外检测器，色谱柱为BONDAPAKC18柱39MM15CM，流动相为甲醇水醋酸67267，检测波长为256NM。结果表明该方法准确度高，重现性好，操作快速、简便。尽管反相高效液相色谱法有其优点，但也存在着弊病，即分析时间长、试剂成本太高。此外，该技术的应用受到限制的最大原因是需要标准样品才能定性。在实际使用中还需要考虑延长色谱柱的使用寿命问题。3薄层扫描法薄层扫描法TLCSCANNINGMETHOD，是薄层色谱技术与光密度计和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定，简便快速、灵敏准确、专属性好34。袁珂等36应用CS9301薄层扫描仪日本岛津，采用薄层扫描法测定复方冬凌草含片中甘草苷的含量，操作简便，不用显色剂即可在紫外灯254NM下定位，色斑清晰，显紫红色斑点，实验方法灵敏可靠。何桂霞等37采用薄层扫描法测定开胃健脾胶囊中甘草苷的含量。展开剂正丁醇冰醋酸水613上层液，测定波长为252NM，参比波长500NM，方法简便、快速，可作为该制剂质量控制标准。吴容军等38采用薄层扫描法测定术苓口服液中甘草苷的含量日本岛津CS930型薄层扫描仪，扫描条件测定波长252NM，散射参数SX3，反射法锯齿扫描。这种方法可靠，重现性好，被认为可作为该制剂内在质量的控制标准。王立新等39，采用薄层扫描法对十全大补丸中的活性成分甘草苷进行了测定，结果表明方法简便，准确可靠。虽然薄层扫描法也是一种较好的分离方法，但影响薄层扫描结果的因素较多，而且分辨率不高，限制了它的应用。因此使用时要求应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。23此外，甘草苷的定量测定还可以采用薄层比色法35、双波长薄层扫描法测定40、小波变换二次微分示波计时电位法41、离子抑制色谱法42，43、极谱催化波法44，45、气相色谱法53等。通过对以上几种方法的比较，可以看出HPLC作为一种广泛、有效的分离手段，在甘草有效成分分析中有很好的应用前景。它的微量，解决了甘草有效成分提取的困难。它的高效，使甘草复方中多种成分的同时分离成为可能，它的快捷提高了分析效率。可以相信，HPLC作为一种强有力的分析技术，势必在甘草有效成分分析中发挥更大的作用。甘草有效成分分析分离方法的着眼点应放在实用、易推广和快速，而且操作要简单，适用于常规分析和自动化操作上。因此，在分析方法的选择上应具有明显的时代性，应尽快地采用新技术新方法。近年发展起来的热分析法、X射线衍射法等得到了人们的广泛关注，有待去努力开拓。为了适应和推动甘草有效成分测定的需要和发展，甘草有效成分的测定仪器还必须是具有高灵敏度达原子级、分子级水平、快速、自动、简便、经济的特性，并可以通过提高信噪比来提高甘草有效成分测定仪器的灵敏度。随着现代分析化学的发展，甘草有效成分的测定仪器也需要向痕量与超痕量分析NG/G至PG/G以及FG/G和AG/G甚至ZG/G的方向发展，这将推动甘草有效成分测定仪器的技术进步。21世纪甘草有效成分测定技术发展的主流是应用先进的科学技术研究建立有效而实用的原位INSITU、在体INVIVO、实时REALLINE、在线ONLINE和高灵敏度、高选择性的新型动态分析测定方法，实现甘草有效成分测定分析仪器的微分析系统TAS化，并向微型化、智能化方向加速发展。希望随着科学技术的发展，测定手段的完善，人们还能寻找出最简便，灵敏度高，最可行的甘草苷定量测定方法。24参考文献1傅克治中国甘草野生变家植哈尔滨东北林业大学出版社，19892胡汉芳，阎正用比色法测定不同产地甘草中甘草苷的含量河北大学学报，19981843713743江苏新医学院编中药大词典上海上海人民出版社，1977102324程晓霞，向瑛甘草及其制剂中甘草苷的定量方法研究概况时珍国医国药，2000，1143803815王亚丽高效液相色谱在中草药研究中的应用甘肃中医学院学报，1998，15356576蓝煜高效液相色普法测定独活寄生丸中芍药甙和甘草苷的含量中成药，1994，9127范吕林高效液相色谱法测定复方甘草合剂中甘草苷的含量广西医学，1999，211127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