大豆蛋白的提取与含量测定

1、大豆蛋白的提取与含量测定,蛋白质性质与应用技术关系图,肽 氨基酸,疏水性 亲水性,纸 层 析,一、大豆蛋白的提取,目的要求 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率 实验原理 大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率,试剂和器材,1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1m

2、ol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 （4）PH试纸等,操作方法,1、水抽提 将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min， 3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。 其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌），用6mol/L和1 mol/L HCL，调PH4.55.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，放入表面皿上，60度烘干，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产

3、率,蛋白质产物重量 蛋白质产率= 100% 原料总重量 Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分,二、Folin酚法测定蛋白质含量,目的要求 掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法 实验原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷

4、钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物,由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少个别改进的操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上、保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法,试剂和器材,1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。 2、试剂： （1

5、）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200g/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月,4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO42H2O）100g，钼酸钠（NaMoO2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。

6、然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色瓶中保存，可使用多年。 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的浓度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点,3、器材,试管10支 试管架一个 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒温水浴 723型分光光度计,Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取6支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 K=0.308 B=-0.009 R*R=0.9909,2、样品测定：取三支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml和空白 ，如下操作,3.蛋白质浓度的计算： A650值