发酵法生产丙酸的工艺研究

1、发酵法生产丙酸的工艺研究发酵法生产丙酸的工艺研究丙酸是一种重要的工业产品,目前主要以化学法生产。随着化石原料的资源匮乏,化学品的生物制造越来越重要,丙酸的发酵法生产技术成为研究新热点。谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)w125是工业化生产腺苷钴胺素(维生素b_(12)的优秀菌株,该菌株发酵胞内积累腺苷钴胺素的同时胞外积累丙酸和乙酸,由于丙酸产量不足2%,没有提取的经济价值而随废水排放,造成浪费与污染。本课题研究的主要内容就是维持维生素b_(12)发酵产率不变的前提下,提高胞外丙酸的产量,为工业化联产丙酸和维生素b_(12)奠定基础。主要研究成果如下:建立了简

2、便、精确测定丙酸、乙酸和腺苷钴胺素的色谱方法。调查了propionibacterium shermanii w125的代谢特性,确立了标准化三级发酵操作程序。以谢氏丙酸杆菌w125为出发菌株,经紫外诱变、定向筛选分离获得一株生长快、产酸高、维生素b12产量不降低的耐渗突变菌株w321。研究了p.shermanii w321的批次发酵,结果表明该菌株在葡萄糖6%,玉米浆 2.5%(干物质),磷酸二氢钾0.2%,氯化钴10 mg/l,接种量为20%,培养温度30,ph 6.5条件下,发酵周期为66 h,丙酸产量 2.87%,维生素b_(12)产量42g/ml。与w125发酵相比,丙酸产量提高3 6

3、.7%,发酵周期缩短30 h。研究了补糖工艺对p.shermanii w321产酸的影响:初始葡萄糖6%,发酵48 h、72 h、108 h分别补入3%的葡萄糖,最终产酸达到 4.5%,糖酸转化率为30%,湿重为 7.82%,维生素b_(12)产量44g/ml,发酵周期168 h,与批次发酵工艺比,丙酸终浓度提高5 6.8%、湿重提高1 1.6%、维生素b_(12)提高 4.7%,发酵周期延长102 h。研究了抗渗剂ks对p.shermanii w321产酸的影响,结果表明ks可以明显加速菌体的生长和产酸速率。结合补糖发酵工艺,在含有0.3%ks的条件下,初糖浓度提高到9%,60 h、84 h

4、分别补糖3%,发酵周期114 h。丙酸产量达 5.35%,糖酸转化率为3 6.1%,湿重为9.9%,维生素b_(12)产量达到51g/ml,发酵周期114 h,与6%初糖的补料发酵工艺比,丙酸终浓度提高了1 8.9%,糖酸转化率提高20.3%,湿重提高2 6.6%,发酵周期缩短54 h,维生素b_(12)产量提高1 5.9%。发酵液经过滤后,菌体沉淀用于维生素b_(12)的提取,过滤上清液经脱色处理后可以得到无色透明的液体,为工业法制备丙酸提供了依据。首次报道了减压条件下,p.shermanii w321的发酵动力学变化,发现,负压(-0.07mpa)发酵细胞生长量和产物合成都降低,从代谢循环

5、途径看,co_2参与了wood-werkman途径中由甲基丙二酰coa转羧酶催化的转羧反应,减压可能降低了发酵液中co_2的水平,影响co_2参与转羧反应,最终使丙酸合成和细胞生长量降低。总之,本实验通过对p.shermanii w125的诱变和对突变株发酵工艺的研究,使丙酸发酵水平由2%提高到 5.35%,提高幅度268%,维生素b_(12)由40g/ml提高到51g/ml,提高幅度20.7%。本文的研究工作使发酵法生产丙酸并联产维生素b_(12)技术体系进一步成熟。 摘要4-6abstract6-11第1章 绪论11-19 1.1 丙酸的性质和用途11 1. 1.1 丙酸的性质11 1.

6、1.2 丙酸的用途11 1.2 丙酸的市场11-13 1. 2.1 世界丙酸市场11-12 1. 2.2 中国丙酸市场12-13 1.3 丙酸的生产方法13-14 1. 3.1 化学合成法13-14 1. 3.2 微生物发酵法14 1.4 丙酸发酵工艺的研究现状14-18 1. 4.1 发酵菌种14 1. 4.2 发酵机理14-15 1. 4.3 发酵工艺15-17 1. 4.4 丙酸分离提取工艺17 1. 4.5 发酵液中丙酸含量检测17-18 1.5 发酵法生产丙酸面临的问题18 1.6 本课题主要研究的内容18-19第2章 发酵液中丙乙酸快速气相色谱检测方法建立19-26 2.1 材料与

7、方法19-21 2. 1.1 材料及发酵培养19-20 2. 1.2 方法20-21 2.2 结果与讨论21-25 2. 2.1 线性关系21-23 2. 2.2 测定方法的重复性检验23 2. 2.3 测定方法的精密度检验23-24 2. 2.4 发酵液中丙乙酸测定24-25 2. 2.5 发酵液中测定方法的重复性检验25 2.3 小结25-26第3章 腺苷钴胺素快速液相色谱检测方法建立26-35 3.1 次级代谢产物维生素b_(12)26-30 3. 1.1 维生素b_(12)结构及性质26-27 3. 1.2 维生素b_(12)的功能及市场27 3. 1.3 维生素b_(12)的生产工艺

8、及提取27-28 3. 1.4 维生素b_(12)的检测28-30 3.2 发酵液中维生素b_(12)的检测30-34 3. 2.1 材料与方法30-31 3. 2.2 结果与讨论31-33 3. 2.3 结果分析33-34 3.3 小结34-35第4章 菌株代谢特性及标准化三级发酵35-43 4.1 实验材料及方法35-36 4. 1.1 实验菌种及仪器35 4. 1.2 主要试剂35 4. 1.3 检测方法35-36 4.2 propionibacterium shermanii w125基本生物学特性36-41 4. 2.1 丙酸杆菌属及谢氏丙酸杆菌w125菌株的基本特性36-37 4.

9、 2.2 w125菌株的碳源需求37 4. 2.3 w125菌株的形态及发酵产物37-39 4. 2.4 w125菌株的耐渗研究39-40 4. 2.5 反馈抑制的研究40-41 4.3 标准化三级发酵操作程序41-42 4. 3.1 三级发酵过程41-42 4. 3.2 标准操作程序42 4.4 小结42-43第5章 菌种诱变与抗渗筛选43-46 5.1 实验材料及方法43 5.2 紫外诱变及筛选方法43-45 5. 2.1 菌种诱变及抗渗性筛选策略43-44 5. 2.2 发酵复筛44-45 5.3 小结45-46第6章 批次发酵工艺研究46-53 6.1 实验材料及方法46-47 6.

10、1.1 实验菌种46 6. 1.2 主要仪器46 6. 1.3 主要试剂46 6. 1.4 检测方法46-47 6.2 实验结果及讨论47-52 6. 2.1 批次发酵工艺研究47-51 6. 2.2 优化后批次发酵生长曲线51-52 6.3 小结52-53第7章 分批补料发酵工艺研究53-61 7.1 实验材料与方法53 7.2 实验结果及讨论53-58 7. 2.1 分批补料发酵工艺53-55 7. 2.2 ks对分批补料工艺的影响55-58 7. 2.3 分批补料工艺氮源加入量研究58 7.3 发酵上清液的脱色58-60 7.4 小结60-61第8章 负压发酵实验61-65 8.1 实验材料与方法61-62 8. 1.1 实验菌种6