肿瘤抗原负载DC激活的CTL对裸鼠移植瘤作用的研究

1、肿瘤抗原负载DC激活的CTL对裸鼠移植瘤作用的研究 11-03-29 11:34:00 编辑：studa20 作者：王雪峰 ， 张莉，杜晓媛，梁雯，远洋【摘要】 目的 研究负载人喉癌细胞系Hep-2冻融抗原的树突状细胞(DC)体外活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在裸鼠Hep-2移植瘤发生、发展中的作用。方法 以健康人外周血贴壁单核细胞体外诱导DC并负载Hep-2冻融抗原，经MTT法检测其激活的同基因型T淋巴细胞在体外对Hep-2的杀伤活性后，将此Hep-2特异性CTL预防性接种于裸鼠皮下(预防组6 只，对照组16 只),3 天后接种Hep-2，观察其移植瘤的发生率：再将此CTL分以1 次、2

2、 次治疗性接种于已荷瘤裸鼠皮下(对照组6 只;治疗组和加强治疗组各5 只)，观察移植瘤的生长情况。结果 预防组Hep-2移植瘤的发生率明显低于对照组(预防组33%，对照组00%，P=0.0002);治疗组与加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于对照组(P0.05，P0.01)，且加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于治疗组 (P0.05)。结论 负载Hep-2冻融抗原的DC活化的CTL不仅能预防裸鼠Hep-2移植瘤发生而且能抑制其移植瘤的生长。 【关键词】 树突状细胞;肿瘤免疫治疗;喉癌;裸鼠Abstract： Objective To study the effect of the cytotoxic T

3、lymphocyte (CTL)activated by dendritic cell (DC) loaded with human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 lysates on the Hep-2 implanted tumor occurrence and its growth in nude mice.Methods In vitro DC was induced by monocyte isolated from human peripheral blood mononuclear cells and loaded with antige

4、ns from Hep-2 tumor lysates. Also in vitro the efficacy of killing Hep-2 cell with Allogeneic T lymphocyte activated by DC was examined through MTT. In vivo the tumor occurrence rate of nude mice previously subcutaneously injected the specific CTL (6 from precaution group， 16 from control group) and

5、 its growth among the 16 Hep-2 implanted tumor nude mice treated by specific CTL once or twice were observed (6 from control group， 5 from treatment group and 5 from retreatment group respectively). Results Within 20 days the tumor occurrence of the precaution group was significantly reduced compare

6、d to that of the control group (p-0.0002); the Hep-2implanted tumor size of the treated and retreated group were significantly inhibited (P0.05，P0.01) compared with the control group， and the retreated was more significantly than the treated (P0.05).Conclusions The CTL activated by DC loaded with an

7、tigens from Hep-2 lysates can not only protect the nude mice against the challenge of Hep-2 cell but also inhibit the growth of the Hep-2 implanted tumor in nude mice.Key words：dendritic cell; tumor immunity; laryngeal carcinoma; nude mice树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting

8、 cell，APC)，它因能刺激并致敏初始T细胞和启动早期免疫反应而在肿瘤免疫治疗中占有重要的地位。国内、外已有实验应用DC疫苗治疗一些恶性肿瘤并获得初步肯定，但在治疗喉癌方面尚未见有报导。本实验研究以Hep-2抗原负载的DC在体外激活同基因型T淋巴细胞产生的特异性CTL，能否直接在体内预防裸鼠Hep-2移植瘤的发生和抑制其移植瘤的生长，为进一步探讨DC疫苗用于临床治疗喉癌提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验动物与细胞裸鼠BALB/C22只，雌性，46周龄，(202)g，购于中国医科大学SPF级动物实验中心。人喉癌细胞系Hep-2购自北京耳鼻咽喉研究所;健康人新鲜外周血购自锦州市中心血站。

9、1.2 主要试剂及仪器完全培养基：RPMI-1640(GIBCO公司)、20%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺、20 mmol/L HEPE是(SIGMA公司)、l mmol/L丙酮酸纳、100 U/mL青霉素、80 U/mL庆大霉素：rhGM-CSF(华北制药厂)，rhIL-4、rhIL-2 (BIO公司)，rhTNF-(EC公司);淋巴细胞分离液(天津)，尼龙毛 (上海);四氮唑蓝盐(MTT)(华美生物公司);小鼠抗人CD83McAb(深圳裕盛佳公司)，S-P免疫细胞化学染色试剂盒(迈新生物公司)。WJ-6C。二氧化碳孵育箱(日本)，DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂

10、)。1.3 肿瘤细胞冻融抗原的制备收集处于对数生长期的Hep-2肿瘤细胞，用生理盐水洗2 次，制成浓度2108/mL，反复冻融(-70 /37 )4 次，2 000 r/min离心1 h取上清，过滤除菌，4 保存备用。1.4 DC的诱导与鉴定取健康人新鲜外周抗凝血，用Fic。11不连续密度梯度离心法分离获得单个核细胞，低渗裂解红细胞，PBS洗去血小板，以含20%FBS的RPMIl640调整细胞浓度至1107/mL，取5 mL加入T-25塑料培养瓶，37 ，5%CO2孵箱培养2 h后，吸除未贴壁细胞即获贴壁单核细胞，加入完全培养基、rhGM-CSF 1 000 U/mL、rhIL-4 1 000

11、 U/mL常规培养，每2 d换液1 次。第四天将细胞分为2 组：负载组另加Hep-2冻融抗原5106/mL (抗原量以冻融前Hep-2细胞数计)、rhTNF-200 U/mL;未负载组不加冻融抗原，继续培养4 d，收集悬浮细胞，部分用完全培养基重悬浮备用：余用小鼠抗人CD83McAb以S-P免疫细胞化学染色法鉴定。1.5 CTL的体外诱导及活性检测取与DC来源相同的新鲜外周抗凝血，同上法用含20%FBS的RPMIl640调整单个核细胞浓度小于1108/mL，注入自制的T细胞尼龙毛柱，37 温育1 h后用上述培养基冲洗出非粘附细胞即为T淋巴细胞;将其分与两组DC按10：1的比例混合，加含IL-2

12、 1 000U/mL的完全培养基，37 ，5%CO2孵箱培养72 h，分收集细胞(CTL)。用含10%FBS的RPMI-1640重悬细胞，将各效应细胞(负载组的特异性CTL、未负载组的非特异性CTL和单纯T细胞，5104/孔)与靶细胞(处于对数生长期的Hep-2细胞5103/孔)按效靶比10：1混合，置于96 孔平底培养板中(0.2 mL/孔);同时分设效应细胞(5104/孔)与靶细胞(5103/孔)平行对照孔(0.2 mL/孔)，每组复设5 孔，37 ，5%CO2孵箱培养72 h后，加入5 mg/mLMTT溶液0.2 mL继续培养4 h，离心沉淀、去上清、无水乙醇溶解，用酶联免疫检测仪在波长570 nm测各孔光密度值(OD)，计算效应细胞对靶细胞的杀伤率：杀伤率二(靶细胞OD值+效应细胞OD值效靶细胞杀伤反应后OD值)/靶细胞OD值100%。1.6 制备接种液分取处于对数生长期的Hep-2细胞和Hep-2抗原特异性CTL，PBS (pH7.2)洗2 次(1 000 rpm/min)再重悬，经台盼蓝拒染