荧光量子点法降钙素原(PCT)试剂盒的研制(20210216092944)

1、文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.专业课程设计荧光量子点法降钙素原(PCT)试剂盒的研制学 院专 业指导老师班级姓名学号摘要本产品运用免疫层析法的夹心免疫技术将量子点与PCT单克隆抗体结合，建立一种新型的免疫分析法进行特异性定性检测人血清或血浆中的PCT，使灵敏度显著提高，达到或超过某些酶联免疫吸附法 (ELISA)的水平。由于待检测PCT 与PCT抗体的反应，使得水溶性量子点的荧光强度产生变化，通过测定水溶性 量子点荧光强度变化的量来实现对待检测 PCT浓度的高选择性定量检测。本发 明中的降钙素原(PCT)检测试剂盒具有制备低廉、稳定性好、易于保存，利用荧 光量子

2、点标记方法检测灵敏度高、特异性强的优点，比较容易的在临床进行推广。1研究背景目前临床和科研实验室中均用免疫学方法检测 PCT浓度，包括胶体金法、 ELISA法和免疫化学发光法等。所有这些方法的前提都是制备 PCT特异性抗体， 且健康人血浆中含量极低，在200pg/mL以下，对抗体的亲和力等参数要求很高。 迄今为止这些检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备 PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供具有自主知识产权的关键原料， 对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。目前应用化学发光免疫分析技术建立人血清中降钙素原定量检测方法，采用固相包被降钙素原单克隆抗体，生物素

3、标记另一降钙素原单克隆抗体，建立人血清中降钙素原的双抗体夹心化学发光免疫定量检测方法。在此基础上，荧光免疫分析技术是利用荧光物质标记抗体或者抗原分子，通过与待分析物的特异性结 合后，检测荧光信号的强度变化，实现对目标分析物的定性和定量检测。制备荧光信号强、免疫活性好的量子点 -抗体( QD-Ab )复合物是将量子点应用于荧光 免疫检测的关键。 QD-Ab 的荧光信号放大效率主要是由量子点抗体偶联比例 以及量子点本身的荧光量子效率决定， 而其免疫活性则由 QD 表面偶联的抗体分 子的量效决定， 除了抗体自身亲和力对复合物的免疫活性产生影响外， 抗体与量 子点间的偶联位点和抗体分子在量子点表面的空

4、间构象也对QDAb 复合物的免疫活性有重要影响。2. PCT简介及临床意义PCT (降钙素原，procalcitonin)是一种无激素活性的降钙素前肽物质，来 自于定位 11号染色体上的单拷贝基因， 该基因由 2800个碱基对组成， 含 6 个外 显子和5个内含子，相对分子质量约为13X103。在正常代谢下，甲状腺 C细胞 产生PCT并分泌激素活性的降钙素。正常人血中 PCT浓度极低，当严重细菌、 真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。 在自 身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高；局部有限的细菌感染、轻微的感染 和慢性炎症也不会导致其升高。自1993年Assico

5、t等首次报道PCT可作为细菌 感染的早期标志物以来，PCT作为一个新的炎症指标广泛应用于细菌感染的诊断 与鉴别诊断，2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把 PCT作为诊断指标 之一。PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征( SIRS)和多器 官功能紊乱综合征(MODS)，即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些 病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细 菌移位可能诱导其升高。PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。 它的 测定可以作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。3. 量子点技术简介及研究进展量子点(quantum

6、 dots QDs)是纳米尺寸的半导体微粒，又称为半导体纳 米晶体(nanocrystals NCs)，是一种由U切族或川V族元素组成的、稳定 的、溶于水的、直径在210nm之间的纳米晶粒。当半导体材料减小到纳米尺 寸时，它与大块材料相比具有独特的光学特性。 目前， 量子点最有前途的应用领 域是在生物体系中作为荧光探针。QD的光学特性比传统的荧光染料探针有明显 的优越性：(1) 量子点被激发后可得到波长范围宽且光谱可调的荧光。(2) 量子点粒径大小不同，所激发的荧光也不相同。(3) 不同大小的量子点可以用同一波长的光激发而发出不同颜色的光， 这将给生物学的研究带来很大的方便。 由于量子点半峰宽

7、较窄， 这就允许使用不 同光谱特征的量子点， 而发光色谱不发生重叠或重叠较小， 可用于多种标记物的 同时检测生物体内的几种组分。量子点具有很多的优点， 如能解决量子点与生物分子的偶联问题， 就可以用 量子点代替有机荧光染料，在细胞器定位、信号传导、原位杂交、胞内分子的运 动和迁移等研究中发挥巨大的作用。量子点的制备方法有很多， 用于生物荧光探针的量子点通常采用胶体化学法 按所用的原料不同可以分为金属有机溶剂热分解和巯基分子作稳定剂的水 相合成两种路线。 对用于生物检测的纳米晶体的要求是可溶于水或缓冲溶液， 粒 径分布均匀， 量子产率高，并且稳定。因此制备发光效率高、 发光颜色可调性好、 对光热

8、稳定性好的量子点， 尤其是制备对于生物检测十分重要的受激发能在红外 区发光的量子点已成为近年来的研究热点。量子点作为荧光探针使用时，其表面需要修饰生物分子，如抗体、多肽、糖 类等。如何将生物分子有效的偶联在量子点表面并保持其生物活性， 是量子点生 物学应用中极为关键的一步。 到目前为止， 已经有一些类型的偶联技术在量子点 抗体偶联中应用。量子点的制备方法通常分为物理方法和化学方法两种。 用于生物探针的量子 点的合成方法主要采用胶体化学法， 通过在胶体溶液中进行纳米晶体的制备， 一 类是在高沸点的有机溶剂中利用前驱体（烷基（非）金属）热分解来合成，另一 类是利用稳定剂 （巯基小分子） 在水溶液中

9、合成。 采用胶体化学法在有机溶剂中 合成的量子点在用于生物标记时必须对量子点进行表面修饰， 使其具有一定的水 溶性和生物相容性，同时在量子点表面连接上可与生物分子连接的功能性基团， 可引入极性的官能团（如氨基或羧基等） ，再通过交联剂 NHS（N- 羟基琥珀酰亚 胺）或EDC （乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亚胺），完成量子点与生物大分子（蛋 白质、核酸、酶等）的共价偶联。目前量子点标记最为活跃的领域是在荧光免疫方面。 借助于抗原 抗体、生 物素亲和素等之间的特异性识别作用完成各种研究。 QDs 稳定性好， 荧光杂质 少，连接于生物分子后不影响其活性，特异性高。4. 产品技术及待解决问题本项目

10、参考 CN1A 中的方法将降钙素原检测试纸，作为一种量子点标记免 疫定量检测试纸， 包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、 过滤垫、 结 合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构， 各层膜结构之间部分重叠； 所述结 合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体 I、以及量子点标记的兔IgG; 所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体 II 的检测线、以及一条包被羊抗 兔 IgG 抗体的质控线。该试纸可方便快捷、准确定量地同时检测降钙素原。本发明同时参考一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，用以巯基丙酸（MPA）作为稳定剂合成的水溶性量子点 CdSe纳米粒 子，用N-羟基

11、琥珀酰亚胺（NHS）将量子点活化，用EDC （乙基-3-（二甲基氨 丙基）碳二亚胺）完成量子点与 PCT抗体的共价偶联。CdSe量子点表面覆盖有 巯基乙酸，在水溶性缩合剂 EDC 的作用下与抗体的氨基反应，使抗体以共价键 连到量子点表面。用修饰过的 QDs标记单抗，而此标记不影响PCT单抗与多克 隆抗体的反应，标记后的PCT抗体仍然具有生物活性。EDC与羧基反应形成氨 基反应活性的中间体一0-酰基脲，该中间体很不稳定，在水中会很快水解释放出 羧基，以及一 N-酰基脲。该副反应所产生的 N-酰基脲会结合在蛋白疏水区域的 羧基上，而 NHS 介入的反应，可以使形成的中间体在水溶液中保持稳定。整个

12、偶联过程简单，条件温和，量子点的荧光强度几乎不受影响。偶联过程中，会有 小部分量子点和抗体发生交联，生成大颗粒物，反应后离心即可去除。降钙素原测定试剂盒（荧光量子点法）项目设计方案1 设计目的和依据：目的：本发明目的在于提供一种利用荧光量子点法定量检测降钙素原（ PCT）的试剂盒， PCT 作为一种能直观反映全身炎症反应的活跃程度的蛋白而备受关 注。目前市场上运用荧光量子点法检测降钙素原（PCT）的产品较少，而该种方 法相较于其他化学检测方法拥有更加灵敏准确的优势， 相较于其他物理检测方法 也有着对设备加工工艺要求较低的优势。依据： 专利：1 、CN0A 一种降钙素原乳胶增强免疫比浊法检测试剂

13、盒2 、CN2A 基于量子点荧光检测的酶芯片及其制备方法和应用3 、 CN1A 降钙素原和 C 反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法4 、CN3A 一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法5 、CN6A 一种基于荧光量子点检测炭疽芽孢杆菌的方法6 、 CN1A PCT/CRP 联合检测用胶体金试纸条及其制备方法文献：1 宋健,范佳,宋大千,毕丽荣,周广宇,张皓,魏景艳,杨柏. 量子点偶联抗体型夹心免疫传感法 检测心肌肌钙蛋白 IJ. 高等学校化学学报 ,2009,10：1940-1944.2 郑怡麟,何莹,陈安,易维京,胡川闽. 抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初

14、步应用J.第三军医大学学报，2013,06:523-526.3 张鹏飞，宋杰，陈佳,陆慧琦，韩焕兴.量子点与抗乙肝表面抗原 （HBsAg）抗体的偶联研究J. 分析化学 ,2013,06:846-850.4 邢仕歌,熊齐荣,钟强,张悦,卞素敏,金涌,储晓刚. 量子点抗体偶联技术研究进展J. 分析化学,2013,06：949-955.5 马慧莲.发光CdTe量子点生物偶联产物制备、性质及应用研究D.东北大学,2005.6 白亚龙 . 一种基于量子点荧光微球的高灵敏度免疫层析技术初步研究D. 上海师范大学,2010.7 谢颖,徐静娟,于俊生,陈洪渊. 水溶性的 CdSe/ZnS 纳米微粒的合成及表征

15、 J. 无机化学学 报,2004,06：663- 667.8 邱婷,彭洪亮 ,何治柯 . 水溶性量子点 CdSe/ZnS 与蛋白质非特异性相互作用研究 J. 化学 传感器 ,2007, 02：26-30.9 胡晓武 ,李之珍 ,田雪 ,刘辉宇 . 胶体金法测定降钙素原试剂盒的研究J. 中华全科医学,2014,02：271-273.10 谢玉玲 ,戴振贤,柳丽娟,许胜,薛正翔 ,吴玉水. 降钙素原化学发光免疫定量检测方法的建11 Shehabi Yahya,Seppelt Ian. Pro/Con debate： is procalcitonin useful for guiding antib

16、ioticdecision making in critically ill patients?J. Critical Care （Online）,2008,123：211.12 Xiao-Feng Hua,Tian-Cai Liu,Yuan-Cheng Cao,Bo Liu,Hai-Qiao Wang,Jian-Hao Wang,Zhen-Li Huang,Yuan-Di Zhao. Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodiesJ. Analytical and Bioanalyt

17、ical Chemistry,2006,3866：1665-1671.13 Snider R H,Nylen E S,Becker K L. Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation： immunochemical characterization.J. Journal of investigative medicine ： the official publication of the American Federation for Clinical Research,1998,459：552-600.

18、 立及临床应用价值 J. 福建医药杂志 ,2013,06：10-12.说明书：参照罗氏厂家试剂盒说明书。2 开发过程遵循标准：1 医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定（局令第 10 号）2 GB/T15000.2-94 标准样品工作导则3 JJF 1005-2005 标准物质常用术语和定义4 YY 0648-2008 测量、控制和试验室用电气设备的安全要求 第 2-101 部分：体外诊断 （IVD ）医用设备的专用要求5 临床化学体外诊断试剂盒通用技术要求6 JJF 1001-1998 通用计量术语及定义7 GBT 19703 体外诊断医学器具 -生物源样品中量的测量 -参考物质的说明8 G

19、BT 19702-2005 体外诊断医疗器械 生物源性样品中量的测量 参考测量程序的说明9 WS-T 124-1999 临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则10 YY/T0638-2008/ISO 18153:2003 体外诊断医疗器械 -生物样品中量的测量 -校准品和控 制物质中酶催化浓度赋值的计量学溯源性11 EN 980 200312 GB9969-1-1998 工业产品使用说明书总则13 GBT21415-2008 体外诊断医疗器械 -生物样品中量的测量 -校准品和控制物质赋值的计量 学溯源性14 JJG810-1993 波长色散 X 射线荧光光谱仪15 GB/T 13551-1995

20、火焰原子吸收光谱法16 GB/T 31364-2015 能量色散 X 射线荧光光谱仪主要性能测试方法3 知识产权评估和论述：本项目采用的 ODs 标记抗体的技术为国内和国际通用技术。 本设计依据罗氏 诊断降钙素原（PCT）说明书（001V1 ）中荧光量子点标记抗体的原理，及其双 抗体夹心法的方式参考研制而成。4 临床意义PCT （降钙素原，procalcitonin）是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生 虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时， 它在血浆中的水平升高。 自身免疫、 过 敏和病毒感染时 PCT 不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症 也不会导致其升高。PCT反映了全身炎症

21、反应的活跃程度。影响 PCT水平的因素包括：被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。另外，PCT只是在少数患者的大型外科术后14d可以测到。PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些 病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。5 原理 本试剂是利用免疫双抗体夹心法测定分析方法来定性检测人血清或者血浆 中的PCT。首先，用EDC/NHS的欧联作用将ODs标记到Anti-PCT单克隆抗体（标记抗体，一抗）上同时包被于固相载体上，当样品中的PCT与标记抗体结合后，利用检测

22、线上的另一种 Anti-PCT单克隆抗体（一抗）来捕捉结合了 标记抗体的PCT，并设置质控线，质控线上设有抗 Anti-PCT单克隆抗体（一抗 ）的抗体（二抗），用来捕捉未和PCT结合的标记抗体，来对照说明试剂条的 质量稳定，形成“抗体抗原抗体”复合物，之后激发量子点发出荧光， 样本中的PCT含量与系统所检测的相对荧光强度成正比，从而测出样品中PCT含量。6文档来源为 ：从网络收集整理 .word 版本可编辑 .文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.6技术创新点（1）相较于CRP等蛋白检测，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度且更为灵 敏。（2）相较于物理检测方法，荧光检

23、测更为便捷，对设备及加工工艺要求较低。（3）相较于化学检测方法，荧光检测检出限低，更为灵敏准确。7仿制试剂理化指标分析（后附血液中降钙素原（ PCT荧光量子点试剂盒项目仿制试剂理化指标测试报告）8基础配方及配方中各物质的作用（1）固相试剂名称含量（mmol/L）分子量每毫升用量作用牛血清白蛋白0.0147680000.1 g封闭剂MES100213.50.1 g缓冲液成分氢氧化钠10039.9971缓冲液成分Anti-PCT单抗（一抗）4.5g检测线抗体抗Anti-PCT单抗（二抗）4.5g质控线抗体（2）标记试剂:名称含量（mmol/L）分子量每毫升用量作用MES100213.50.1 g缓

24、冲液成分氢氧化钠10039.9971缓冲液成分EDC100191.700.0197g偶联剂NHS100115.090.01151 g活化剂Cys121.15稳定齐UAnti-PCT单抗（一抗）4.5g被标记抗体ODs0.001标记物（3）洗涤试剂:名称含量分子量每升用量作用(mmol/L)MES100213.50.1 g缓冲液成分氢氧化钠10039.9971缓冲液成分9关键技术及解决方案关键技术：此试剂盒的关键技术分为以下几个方面，(1) 特异性：本方案要求特异性既达到要求又节省成本，特异性不合格会影响临 床测值出现假阳性。(2) 灵敏度：灵敏度是产品的一个重要指标，用来判定产品测定样本的敏感

25、程度。(3) 稳定性：本方案要求试剂稳定性要求达到 12个月。解决方案：(1) 特异性：A筛选抗原：筛选不同厂家的标记抗体，一抗，以及二抗。B量子点的选择运用双抗体夹心法提高检测时的专一性和准确性。灵敏度：A定向包被乙基-3-(二甲基氨丙基)碳二亚胺，其表面的的氨基( NH2)直接与蛋白 质或多肽共价结合，实现抗体的定向包被，不再需要表面活化，提高试剂灵敏度。B确定检测线和质控线相关指标实验确定T线包被浓度，实验确定C线包被浓度，实验确定C、T线在NC 膜上的合理距离关系。C EDC/NHS 偶联EDC和NHS 旦偶联则很难分离，经NHS舌化后的ODs在ED*用下在其 表面可以结合多个Anti

26、-PCT抗体，增加了检测时的捕捉能力，从而提高灵敏度。D非蛋白封闭剂的应用新型的非蛋白型封闭剂，不仅可以比传统的蛋白型封闭剂更进一步降低背 景，提高实际灵敏度，同时由于不含蛋白，保存也很简单，放在室温也不用担心 蛋白降解或长菌变质。E多聚BSA应用多聚BSA消除非特异性干扰引起的背景问题，能阻断检测组分与固相的非特 异性链接，从而降低背景信号并改善检测的灵敏度。 BSA多聚体带有阴性电荷， 适用于多价干扰的清除，如多价抗体/聚合物或抗原。稳定性：固相、标记试剂为含具有生物活性抗体的液体试剂，为维持试剂的稳定性， 可通过加入以下几种物质：A稳定剂固相试剂和标记试剂中均含有抗体，为延长试剂的有效期

27、，拟添加相应的稳 定剂，如：明胶、甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸盐、多聚 精氨酸，脱脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性杂蛋白。B表面活性剂表面活性剂具有固定的亲水亲油基团， 起到增溶、分散和防腐等作用。常用 的表面活性剂有吐温20(Tween)、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP, 经实验筛选后选择最佳表面活性剂。C防腐剂常用的防腐剂有叠氮钠、柳硫汞、ProCIin300和山梨醇，经实验筛选最有利 于维持试剂稳定性的防腐剂。D金属螯合剂某些金属螯合剂，具有螯合金属的能力，可保护试剂中抗原、抗体的稳定性， 如 EDTA、DTPA、NTA。10主要原料的选择材料名称价格/规

28、格易获得性生产厂家Anti-PCT单克隆抗体(一抗)1000 元 /mg长期供应博雅享达Anti-PCT单克隆抗体一标记抗 体1000 元 /mg长期供应抗标记抗体的单抗(二抗)1000 元 /mg长期供应ODs4300 元 /mg长期供应深圳海王英特龙11提高稳定性措施试剂在2C8C条件下，干燥、避光、密封贮存，有效期 24个月，机内稳定 28天。校准品用去离子水复溶后28C稳定100天。固相、标记试剂为含具有生 物活性抗体的液体试剂，为维持抗体的活性及试剂的稳定性，添加以下物质：A. 稳定剂固相试剂和标记试剂中均含有抗体，为延长试剂的有效期，拟添加相应的稳 定剂，如：明胶、甘油、蔗糖、海藻

29、糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸盐、多聚 精氨酸，脱脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性杂蛋白。B. 添加表面活性剂表面活性剂具有固定的亲水亲油基团， 起到增溶、分散和防腐等作用。常用 的表面活性剂有吐温20(Tween)、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP， 经实验筛选后选择最佳表面活性剂。C. 添加防腐剂常用的防腐剂有叠氮钠、柳硫汞、ProCIin300和山梨醇，经实验筛选最有利 于维持试剂稳定性的防腐剂。D. 金属螯合剂某些金属螯合剂，具有螯合金属的能力，可保护试剂中抗原、抗体的稳定性， 如 EDTA、DTPA、NTA。12抗干扰、特异性研究三酰甘油(TG，蛋白质,PCT在体内的半衰

30、期为4-6h半衰期较短,EDC/NHS有可 能产生一定抗体聚合物，对本品有干扰，可以进行干扰试验。13技术要求根据罗氏说明书编制项目指标特异性 99.0%灵敏度 99.0%抗干扰三酰甘油1.7mmoI/L精密度阳性质控批内精密度：CV 15.0%稳定性试剂有效期24个月，开封后有效期均为100小时；14溯源：15生产过程控制：(1) 生产用水要用电导率0.5卩s/cr的纯水。(2) 试剂存放：试剂要存放在高密度聚乙烯塑料容器中。(3) 抗体忌反复冻融(4) 要严格控制试验中的温度，湿度以及PH。参考专利、文献：专利：1、CN0A 一种降钙素原乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒2、CN2A基于量子点荧

31、光检测的酶芯片及其制备方法和应用3、CN1A降钙素原和C反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法4、CN3A 一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法5、CN6A 一种基于荧光量子点检测炭疽芽孢杆菌的方法6、CN1A PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条及其制备方法文献：1 宋健,范佳，宋大千,毕丽荣，周广宇，张皓，魏景艳,杨柏量子点偶联抗体型夹心免疫传感法检测心肌肌钙蛋白lJ.高等学校化学学报，2009,10:1940-1944.2 郑怡麟，何莹，陈安，易维京湖川闽.抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用J.第三军医大学学报，2013,06:523-526.3 张鹏飞，宋杰，陈佳，陆慧琦，韩焕兴.量子点与抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的偶联研究J.分析化学,2013,06:846-850.4 邢仕歌，熊齐荣，钟强,张悦,卞素敏，金涌,储晓刚.量子点抗体偶联技术研究进展J.分析化学,2013,06:949-955.5 马慧莲.发光CdTe量子点生物偶联产物制备、性质及应用研究D.东北大学,2005.6 白亚龙.一种基于量子点荧光微球的高灵敏度免疫层析技术初步研究D.上海师范大学,2010.7 谢颖,徐静娟，于俊生，陈洪渊.水溶性的Cd