DCCIK细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用

1、DC-CIKDC-CIK细胞的制备及在肿瘤细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用治疗中的应用 恶性肿瘤的治疗现状恶性肿瘤的治疗现状恶性肿瘤恶性肿瘤治愈治愈4545难于治愈难于治愈5555未缓解未缓解缓解后复发缓解后复发恶性肿瘤的多学科综合治疗恶性肿瘤的多学科综合治疗恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与不足恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与不足n肿瘤外科学肿瘤外科学n肿瘤放射治疗学肿瘤放射治疗学n肿瘤化学治疗学肿瘤化学治疗学n肿瘤生物学治疗肿瘤生物学治疗n侧重点不同侧重点不同n局部与全身局部与全身n早、中、晚期早、中、晚期肿瘤免疫学治疗的优点肿瘤免疫学治疗的优点n可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿可以有

2、效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的。治肿瘤的目的。n具有具有特异性强、适用性广、副作用轻特异性强、适用性广、副作用轻等优点。等优点。肿瘤免疫学治疗肿瘤免疫学治疗n非特异免疫刺激剂及细胞因子治疗：非特异免疫刺激剂及细胞因子治疗： IL2IL2、IL6IL6、IL12IL12、GM-CSFGM-CSF、TNFaTNFa、IFNaIFNa、IFNrIFNr等体内应用，装等体内应用，装载有细胞因子基因的细胞治疗。载有细胞因子基因的细胞治疗。n治疗性疫苗：肿瘤抗原或多肽抗原疫苗、装载肿瘤治疗性疫苗：肿

3、瘤抗原或多肽抗原疫苗、装载肿瘤抗原基因的病毒疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗、抗原基因的病毒疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗、APCAPC细胞疫苗、抗独特性疫苗细胞疫苗、抗独特性疫苗。nMabMab导向治疗：导向治疗： MabMab、Mab-Mab-毒素、毒素、Mab-Mab-同位素、鼠同位素、鼠- -人单抗、人源单抗、双特异性抗体。人单抗、人源单抗、双特异性抗体。n过继性免疫细胞治疗过继性免疫细胞治疗：供者淋巴细胞输注、供者淋巴细胞输注、LAKLAK、TILTIL、CIKCIK、多种方法诱导的多种方法诱导的CTLCTL、DC-CIKDC-CIK等。等。过继免疫疗法过继免疫疗法n通过把在体外扩增的大量

4、特异性效通过把在体外扩增的大量特异性效应细胞回输给患者后，产生直接杀应细胞回输给患者后，产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。伤肿瘤细胞的作用。DC-CIKDC-CIK培养及其应用培养及其应用nCIKCIK细胞：细胞：Cytokine Induced Killer CellCytokine Induced Killer CellnDCDC：Dendritic CellDendritic CellCIKCIK细胞特性细胞特性n分布：肝脏和外周血分布：肝脏和外周血n来源：来源：CD3+CD56+TCD3+CD56+T细胞和细胞和CD4-CD8+TCD4-CD8+T细胞细胞DCDC与与T T细胞细胞nDCDC

5、高表达高表达MHC-MHC-类、类、类分子，类分子，MHCMHC分子分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽- -MHCMHC分子复合物，递呈给分子复合物，递呈给T T细胞，从而启细胞，从而启动动MHC-IMHC-I类限制性类限制性CTLCTL反应和反应和MHC-MHC-类限类限制性的制性的CD4+ ThlCD4+ Thl反应反应 ；nDCDC还通过其高表达的共刺激分子还通过其高表达的共刺激分子(B7-1(B7-1、B7-2B7-2等等) )提供提供T T细胞活化所必须的第二信细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答号，启动了免疫应答。DCDC负载肿瘤抗原负载肿

6、瘤抗原肿瘤杀伤作用肿瘤杀伤作用n诱导抗原特异性诱导抗原特异性CTLCTL反应反应n增加增加CIKCIK细胞的扩增倍数细胞的扩增倍数n增强增强CIKCIK肿瘤杀伤效力肿瘤杀伤效力MHC：抗原提呈自分泌细胞因子：INF,IL-12等抑制CD4+CD25+调节T细胞生长CIKCIK细胞的制备细胞的制备PBMNC (CS3000 Plus)In a 3000ml Baxter bagSerum free culture mediumIFN 第一天第一天Il-2 第二天第二天CD3 mAb 第二天第二天IL 1 第二天第二天14 dayslCS-3000CS-3000采集采集PBMNCPBMNClFic

7、ollFicoll分离分离PBMC,PBMC,洗洗2 2次次l1-21-210106 6/ml/ml接种至含无血清培养基接种至含无血清培养基的培养袋中，的培养袋中，1000ml/1000ml/袋，加入袋，加入IFN-IFN-1000U/ml1000U/ml，放置，放置3737，5%5%的的CO2CO2孵箱孵箱中培养中培养24h24hl加入加入IL-1IL-1 100U/L 100U/L，CD3CD3单抗单抗50ng/ml50ng/ml，重组人，重组人IL-2 300U/LIL-2 300U/L，继续，继续培养，每培养，每3 3天半量换液，并补加天半量换液，并补加IL-2 IL-2 300U/m

8、l300U/ml。 l 分别于第分别于第5 5，7 7，9 9天取细胞做细胞表天取细胞做细胞表型分析（型分析（FCMFCM检测），细胞杀伤实验检测），细胞杀伤实验（MTTMTT法）法）l收集细胞，含收集细胞，含0.5%0.5%白蛋白的生理盐水白蛋白的生理盐水洗涤洗涤l回输回输CD3CD3主要促主要促CIKCIK细胞增殖，促细胞增殖，促IL-2IL-2自分泌，也提高自分泌，也提高CIKCIK杀伤活性杀伤活性IFN-r/IL-1IFN-r/IL-1，上调细胞表面，上调细胞表面IL-2RIL-2R表达，表达，IFN-rIFN-r先于先于IL-2IL-2加入，有效激活效应细胞，增强抗肿加入，有效激活效

9、应细胞，增强抗肿瘤活性瘤活性DCDC的的培养培养Tumor antigenDC-CIKDC-CIK共培养共培养+05101520251234567 cell numberdaysCIKCIK细胞的增殖细胞的增殖02004006008001000FSC-Heightmajinlan070907d9.003R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070907d9.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070907d9.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070905d6.003R110010110

10、2103104CD3 PerCPmajinlan070905d6.003R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070905d6.00302004006008001000FSC-Heightmajinlan070829d0.001R1100101102103104CD3 PerCPmajinlan070829d0.001R2100101102103104CD4 FITCmajinlan070829d0.00162.%84.7%89.5%28.2%43.1%52.3%012253035404550556065Cytotoxixity % AML ALLlCIK细胞对自体

11、原代白血病细胞有明显杀伤作用，且其细胞毒作用随着效靶比的增加而进一步增强，在效靶比为20：1时，其中位杀伤率分别为51.33%,52.95%1:51:101:200102030405060 %cytotoxicitytarget:effector ratio ALL AML NHL肿瘤细胞冻融物肿瘤细胞冻融物肿瘤细胞坏死物肿瘤细胞坏死物正常生长的肿瘤细胞正常生长的肿瘤细胞无肿瘤细胞无肿瘤细胞无无DCDC-CIKDC-CIK对肿瘤杀伤作用对肿瘤杀伤作用DC-CIKDC-CIK对肝癌细胞的杀伤活性对肝癌细胞的杀伤活性* *DCDC与与CIKCIK共培养后，共培养后，CIKCIK增殖能力和杀伤活性明

12、显增强增殖能力和杀伤活性明显增强DC/CIK治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究CIK/DC-CIKCIK/DC-CIK治疗恶性血液病合并丙肝治疗恶性血液病合并丙肝CIKCIK治疗治疗1 1例白血病合并丙肝后肝功的变化例白血病合并丙肝后肝功的变化新技术新技术nRetroNectin activated killer cell（RAK）nDC相关的技术RetroNectin activated killer cell（RAK）n重组人纤维蛋白片段(RetfoNectin)可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。该产品已注册美国药典和国际专利。n当包被在培养皿和培养瓶中时，RetroNectin能显著提高逆转录病毒转染入哺乳动物细胞内的效率。nRetroNectin还可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖，可增加体外CIK细胞扩增倍数，及肿瘤杀伤活性。RetroNectin activated killer cell（RAK）zoledronate acid/唑来膦酸 n转染AFP质粒的腺病毒感染DCnDC-CIK共培养n杀伤活性检测健康供着DC和CIK肝癌患者DC和CIKCIK/DC-CIKCIK/DC-CIK