普通毒理方法学研究进展

1、2021-7-28Free template from 1普通毒理方法学研究进展普通毒理方法学研究进展急性经口毒性及皮肤刺激评价试验方法的研究进展 2021-7-28Free template from 2 一、急性经口毒性评价试验方法的研究进展概述概述急性经口毒性试验是毒理学安全性评价第一阶段最基础性的试验,LD50是其最为常用的评价指标。下面主要介绍了传统的LD50测试法以及3 种主要替代方法(上下增减剂量法,固定剂量法,急性毒性等级法) 的优缺点及其实际应用前景。2021-7-28Free template from 4急性经口毒性试验的意义急性经口毒性试验的意义 急性经口毒性试验目的主

2、要是求出受试物对试验动物的半数致死剂量(LD50 ) 通过观察急性毒性效应的临床表现,初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制;为亚慢性、慢性和其他毒性试验的剂量水平设计提供参考;为急性毒性分级和制定安全防护措施提供依据。2021-7-28Free template from 5LD50的概念的概念 表示急性经口毒性最常用的指标是LD50（半数致死量）。LD50是统计上来源于动物实验中某一物质单剂量反应引起50%的动物死亡所需的剂量。2021-7-28Free template from 6LD50的历史溯源的历史溯源 1927 年,英国生物学家Trevn 首先建议测定一些药物如毛地黄、胰岛素

3、、白喉类毒素等的毒性大小,用导致50 %动物死亡的剂量即半数致死量来表示,并发表于皇家学会杂志上,此即沿用至今的毒理学毒性评价经典方法之一。2021-7-28Free template from 7LD50历史溯源历史溯源Karber速算法速算法图解法图解法序贯法序贯法回归直线法回归直线法其它方法其它方法2021-7-28Free template from 8 目前在国外多采用Litchfield 和Wilcoxon 的坐标纸图解法。而我国普遍采用的方法大体上可以归纳为两类:其一是死亡率-剂量反应相关要求为正态分布的,其中概率单位图解法和寇氏法(Karber) 较为常用;另一类是不要求为正态

4、分布的(非正态分布) ,计算时只查对有关表格即可得到LD50值,如霍恩氏法(Horns) 等。2021-7-28Free template from 9LD50的意义的意义 LD50值是经统计处理计算得出的数值,与绝对致死剂量(absolute lethal dose , LD100 ) 、最大耐受剂量(maximal tolerance dose , LD0 ) 等相比有更高的重现性;其次,它可反映受试群体中大多数动物易感性的平均情况;最后,从剂量-反应关系曲线上看,它处于曲线上升的中段,是致死率对剂量变化最敏感的部位。2021-7-28Free template from 10LD50的测

5、定方法的测定方法 测定LD50常选用成年小鼠或大鼠两个种属。先通过预备试验确定正式试验剂量。正式试验时一般每组10 只动物(雌雄各半) ,在预测的LD100 及LD0之间安排57 个剂量组,各组间距应根据受试物的毒性大小和预备试验结果而定,一般以0.650.85的等比级数为宜。 2021-7-28Free template from 11LD50的缺点的缺点 LD50值只能表示一种外源化学物质引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度) ,即只能表示动物一半死亡、一半存活剂量点的界限,所以是一个质化反应,而不能代表受试化学物质的急性中毒特性。因此,只用LD50 来说明某一外源化学物质的急性毒性是不完善

6、的。有时,根据实际需要还应进行联合毒性试验等以获取其他有关试验参数,并仔细观察动物的中毒症状,以综合评价化学物质的急性经口毒性效应。2021-7-28Free template from 12替代方法的兴起替代方法的兴起 新的替代性实验方法的兴起可追溯到1876 年英国政府颁布的关于禁止虐待动物法,其中在动物实验法则中明确了动物的权益和动物保护的原则。 1959 年动物学家Russell 和微生物学家Burch 对动物实验提出了减少(reduction) 、替代(replacement) 、优化(refinement) 的3R 概念,即在生命科学研究中应采取其他手段来代替动物实验,改进实验方法

7、,减少动物数量和痛苦,但在当时并没有引起世人的重视。2021-7-28Free template from 13替代方法的兴起替代方法的兴起 直至20 世纪80 年代,随着生命科学、环境保护及化学工业的迅速发展,实验动物数量猛增,3R概念又重新引起人们的关注,许多国家还为此成立了代替法组织,并参加了代替法国际会议。在此次会议上,国际委员会的毒理学家们相继提出了代替传统LD50测定法的新的急性毒性评价方法,并陆续被官方所采纳和支持 。2021-7-28Free template from 14替代方法的兴起替代方法的兴起 1985 年,美国环境保护局(EPA) 不再主张传统的LD50 试验方法;

8、 1987 年欧洲委员会正式修改过去的急性毒性试验规范,决定废除现行的LD50 试验法,规定用固定剂量法来代替LD50 试验法; 1988 年, 美国食品与药物管理局(FDA) 也签署了相关声明,表示将尽量减少动物用量,终止过去的LD50 试验法。2021-7-28Free template from 15替代方法的兴起替代方法的兴起 1989 年,英国毒理学会提出急性毒性试验可以不以动物死亡为终点,而是以“表现严重中毒,如再升高剂量则将会死亡”的效应作为评价的依据,结果由整个中毒剂量幅度转变为较低毒性剂量幅度,具有一定的实际应用价值。 1990 年,日本厚生省也废除了原有严格的LD50方法,

9、尝试用少量动物,将剂量间隔加大,来求得大概的致死量范围。2021-7-28Free template from 16替代方法替代方法替代方法上下增减计量法固定剂量法急性毒性登记法2021-7-28Free template from 17上下增减剂量法上下增减剂量法 上下增减剂量法(up and down procedure ,UDP) 是由Dixon 和Mood 等于1985 年利用优选法提出的LD50推测法,即用少数动物来推测大概的致死剂量(approximate LD50 ) , 而不要求得到精确的致死剂量。2021-7-28Free template from 18方法方法 其方法是先

10、设一个剂量试验,根据有无死亡(反应) ,再按等比级数将设计剂量上下移动,一般以1.3 倍级差上升或下降,这样进行510 次试验即可推定LD50值。试验仅需用510 只动物,且所得到的LD50 值与传统方法的结果基本相似。目前FDA、EPA 及美国实验材料协会(ASTM) 已接受其作为标准的试验方法。日本也主张采用大概致死量,但强调经口致死剂量在300mg/kg 以下的剧毒物质还应做精确的LD50值测定。 2021-7-28Free template from 19固定剂量法固定剂量法 固定剂量法(fixed dose procedure , FDP) 设固定剂量以观察动物的试验反应,不以死亡为

11、依据,而是按毒性症状来判断受试物质的毒性。2021-7-28Free template from 20方法方法 一个试验只需1020 只动物,首先采用1 只动物(多为雌性) 顺次间隔一定时间进行5、50 、500、2000mg/kg 固定剂量的毒性测试,如动物出现严重反应时应出于人道观念处死动物,并利用下一只动物继续较低剂量的试验,将直至确认出现毒性又无死亡时的剂量作为可行的正式试验剂量。然后以此剂量对雄雌动物分别进行观察,结果不满意则再做另一个剂量。其评价标准为高毒、有毒、有害、无明显毒性4 类。 2021-7-28Free template from 21方法方法 经济合作与发展组织(OE

12、CD) 进一步提出, 如500mg/kg 处理无毒性反应时则再做一次2000mg/kg的限度试验,仍无毒性反应,且动物全部存活时即可终止试验。2021-7-28Free template from 22 固定剂量法是由英国毒理学会(BTS) 于1984 年最早提出的,经布鲁塞尔协议后,欧洲委员会曾出资50 万英镑,由欧洲、日本、美国等地33 个研究室共同进行了20 个化合物的新旧方法急性试验,其毒性分级一致率为87.2 % ,结果证实可以用其代替从1927 年以来一直沿用的LD50 法,而且可为危险度评价提供较为足够的急性毒性试验资料,包括中毒作用性质,中毒发生时间、持续时间和结果等。布鲁塞尔

13、委员会也承认了固定剂量法的实际应用价值。2021-7-28Free template from 23急性毒性等级法急性毒性等级法 化学物质的急性毒性是最基本的毒理学依据。很多毒理学家认为,LD50 值虽然是急性毒性评价的重要内容,但不必要求其结果十分精确。在此理念指导下, 产生了急性毒性等级法( acute toxic classprocedure , ATC) 这种经典的LD50 测试修正方法,由于它仍是以死亡作为毒性终点,所以仍能提供粗略的LD50 值。2021-7-28Free template from 24方法方法 该方法早在1990 年由Sumiey 提出,是一种评估化学物质急性毒

14、性的简单方法。试验中每性别每一剂量仅需用3 只动物,首先用2000mg/kg 剂量处理,如无死亡即可结束试验,无需进一步试验。如有动物死亡则应采用200 或25mg/kg 剂量继续试验流程。传统的急性经口毒性试验需用40 只动物,而急性毒性等级法所用大鼠不超过12 只,因而有效地节省了实验动物用量。用该方法获得的试验结果同样可用于评价化学物质的急性毒性及进行毒性分级。2021-7-28Free template from 25结语结语 中国作为化学物质生产和使用大国,目前急性经口毒性试验方法的操作主要是依据国家技术监督局发布的国家标准农药登记毒理学试验方法和国家环境保护总局发布的化学品测试方法

15、进行,其中前者主要采用霍恩氏法,后者主要采用传统的LD50 值法(霍恩氏法) 、固定剂量法和上下增减剂量法。 2021-7-28Free template from 26结语结语 国际上对于化学因素对健康危害的预防和控制技术研究更为重视,目前已制订出一系列限制性的法律和法规,其中都明确规定了对化学物质的毒理学安全性评价要求。特别是欧盟委员会为对化学物质实行统一有效的管理,制订并执行了一套较为完善的毒理学试验规程,其中急性经口毒性试验主要采用固定剂量法和急性毒性等级法进行。近年来,随着动物保护意识的兴起,固定剂量法、上下增减剂量法、急性毒性等级法等已日益成为人们关注的毒性试验替代方法。2021-

16、7-28Free template from 27结语结语 传统的LD50值法(霍恩氏法) 作为经典的急性经口毒性评价方法虽被使用多年,但它存在许多不完善的地方。3 种替代方法的特点在于不以获得精确的LD50数值为核心,不必以死亡作为毒性观察评价的终点,而更多地关注如何从人性化角度出发减少试验消耗,简化试验操作过程,保护动物权益等科学研究的实际应用领域,从而节省了大量的人力和物力资源,是更为适应信息化、产业流式化时代要求的良好的科研开发运作方式。但在评价数据的准确度和精确度方面略逊色于霍恩氏法。2021-7-28Free template from 28结语结语 急性经口毒性试验作为毒理学安全

17、性评价最为基础的方法和试验实施阶段,对于化学物质的毒性评估起着关键的作用。综合分析国内外的情况,目前在实际研究中对上述方法的使用还较为含混,所测得的化学物质毒性资料相互间的可比性不强。因此今后应在有条件的情况下,通过合理的动物实验设计,运用可靠的数据资料综合比较上述各方法的优缺点,去粗取精,建立起一整套程序化、规范化的急性经口毒性实验模式,从而为化学物质急性经口毒性实验标准的确立和毒性大小的评估提供一个统一量化的基础和相互沟通交流的平台,同时也可为陆续建立其他一系列标准化、国际通用的毒理学安全性评价方法提供经验和技术上的参考。2021-7-28Free template from 29二、皮肤

18、刺激动物实验替代物研究的现状与发展2021-7-28Free template from 30概述概述 对化学物是否引起机体皮肤刺激反应进行预测是化学物安全性评价或危害鉴定的重要组成部分。传统常用方法是由John Draize (1944) 建立的皮肤刺激性和腐蚀性实验(Draize 实验) 。 2021-7-28Free template from 31背景背景 Draize 实验本身存在的许多问题,如实验评分主观性强,结果重复性差,因种属间差异而影响其结果应用于人体的可靠性等,使人们质疑动物实验的预测能力,而且近40 年来国际动物保护和动物福利运动的兴起,特别是近20 年,不再以动物模式为

19、基础的毒理学研究系统和评价方法已被广泛接受,欧盟甚至制定法规来禁止销售采用动物做实验的产品和原料,推动着动物实验替代方法研究的快速发展。2021-7-28Free template from 32背景背景 与此同时,组织细胞体外培养技术和生物组织工程技术等现代生命科学技术以及计算机模拟统计分析技术的不断进步与完善,拓宽了替代方法的研究领域,加快替代方法的验证和应用。国内外科学家在发展科学可靠的皮肤刺激反应实验替代方法方面进行了大量探索.2021-7-28Free template from 33皮肤刺激动物实验替代方法皮肤刺激动物实验替代方法皮肤刺激动物实验替代方法体外细胞培养皮肤组织培养重组

20、人皮肤替代物皮肤角质形成细胞培养皮肤成纤维细胞培养人皮肤组织块体外培养模型非灌注猪耳朵实验体外小鼠皮肤完整功能实验EpiskinTM (聚碳酸酯滤器)EpiDermTM (醋酸纤维素滤器)SkinEthicTM (胶原凝胶)2021-7-28Free template from 34体外细胞培养的优缺点体外细胞培养的优缺点 体外细胞培养模型有着很多的优点,如模型制作以及实验操作相对简单、方法重现性好、冷冻保存相对容易,然而,单层细胞培养存在着不少的缺陷,最重要的是模型缺乏完整皮肤的一些重要的特征,如表皮细胞排列紧密、表皮选择性渗透屏障以及皮肤不同细胞类型之间的相互作用,不能模拟正常人的皮肤。而

21、且,因为缺乏角质层的屏障作用,化学物对细胞产生直接的细胞毒性,使细胞模型呈现高敏感性。2021-7-28Free template from 35体外细胞培养的优缺点体外细胞培养的优缺点 所以,单层细胞实验所获得的结果一般难以用来解释体内情况或与体内情况相联系。此外,模型要求受试物必须溶于培养液且性状不能影响指标的测量,从而限制了模型广泛应用于各种不同的化学物。但是,鉴于现有的许多模型比细胞培养系统费用要更加昂贵,大多数科学家仍认为细胞培养系统是一种有用的皮肤刺激物的筛选工具。2021-7-28Free template from 36皮肤组织培养的优点皮肤组织培养的优点 科学家从正常人或动物

22、身上获取完整的皮肤组织块,因为组织块具有正常的结构和所有的细胞成分,因而能很好地模拟真实的体内情况。将皮肤样本置于网格或特制的培养板上以防止细胞生长超出离体的组织,同时培养于空气-培养液界面,既可以模拟现实皮肤解剖结构,又可以直接局部应用受试物,且不受受试物性状的限制,与真实暴露情况一致,可广泛应用于检测各种不同的化学物。 2021-7-28Free template from 37皮肤组织培养的缺点皮肤组织培养的缺点 但是,研究发现皮肤组织培养仅适用于短期染毒,因为组织体外存活的时间很短。离体皮肤组织在气液界面培养超过3 d 后,皮肤细胞会逐渐出现细胞变性,同时,伴随着各种蛋白质分化标志物的

23、表达和表皮脂质成分的修饰,以及角质层屏障功能损伤,极大地影响模型的预测能力,从而限制模型的广泛应用。2021-7-28Free template from 38重组人皮肤替代物重组人皮肤替代物 皮肤组织培养虽然模拟现实能力强,但鉴于其皮肤来源有限、伦理学限制以及存组织工程学的出现与发展,使体外重构有活性皮肤替代物成为现实。 2021-7-28Free template from 39类型类型重组皮肤替代物表皮替代物全层皮肤替代物2021-7-28Free template from 40重组人皮肤模型优缺点重组人皮肤模型优缺点 研究表明,重组人皮肤模型具有天然组织所具有的所有的主要的特征。 然

24、而, 皮肤替代物与正常人皮肤仍存在着相当大的差异。与正常人皮肤比较,皮肤替代物表皮屏障功能有所缺陷,主要表现为其物质角质层穿透率变化很大,比正常人皮肤高大约1030 倍。而且,两者细胞组成不同,在正常皮肤中,尚存在着血管内皮细胞、炎症细胞以及神经组织,这些组成成分相互作用对皮肤症状的产生是必需的。所以科学家不得不采用更加复杂的参数并且多种指标相结合的方式去评价受试物的刺激性。2021-7-28Free template from 41 现在常用的几种重组皮肤替代物主要包括由EpiskinTM 、EpiDermTM和SkinEthicTM ,因其呈现良好的重现性和预测能力而被ECVAM 所采纳,

25、现已进入正式验证研究。2021-7-28Free template from 42EpiskinTM(聚碳酸酯滤器聚碳酸酯滤器) EpiskinTM (Episkin SNC , Lyon , France) : EpiskinTM是将人胶原薄层覆盖在型胶原上形成真皮类似物,将由人角朊细胞组成的复层表皮接种于真皮类似物上。Episkin SNC 根据ISO9002 标准将EpiskinTM制成标准试剂盒Episkin2SMTM ,每盒包含有12 个表皮亚单位。2021-7-28Free template from 43EpiDermTM(醋酸纤维素滤器醋酸纤维素滤器) EpiDermTM (M

26、atTek , Ashland , MA , USA) : EpiDermTM是由正常人表皮角朊细胞经培养后形成的多层的高分化的人表皮模型。该模型现已经商业化将EpiDermTM组织(“Epi-200”;0.6 cm2 ) 培养在特别制备的细胞培养嵌入物(Millicells) 上,每24 块组织组成一个试剂盒,将试剂盒放在航运琼脂糖上转运到其他实验室。2021-7-28Free template from 44SkinEthicTM(胶原凝胶胶原凝胶) SkinEthicTM (Laboratoire Skinethic , Nice , France) : SkinEthicTM是一种通过将从人包皮中提取出来的正常成人角朊细胞培养在聚碳酸酯滤器上构建而成的重组人表皮模型。现该皮肤模型已商品化。2021-7-28Free template from 45 除了以上几种重组人皮肤模型以外,不同实验室还构建了自己的重组人皮肤模型,如ApligrafTM 、Skin2、Testskin 、LSE-high、Cosmital ,结果显示与人体试验结果呈现相当好的相关性。2021-7-28Free template from 46重组人皮肤模型前景重组人皮肤模型前景 重组人皮肤模型是现在最具有发展前景的动物实验替代方法,它不仅能最大程度地模拟现实人体