22基因工程载体噬菌体载体09

1、2012.09第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 2噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）一、一、 噬菌体载体噬菌体载体二、单链噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体四、柯斯质粒载体一、一、 噬菌体载体噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（噬菌体是一类细菌病毒（bacteriophage）（一）噬菌体（一）噬菌体的一般特性的一般特性结构：结构： 蛋白质外壳内包裹蛋白质外壳内包裹着着dna（双链、单（双链、单链、线性、环状链、线性、环状等）。等）。71. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将溶菌周期指噬菌体将dnadna注入寄主细胞后很快

2、环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体dnadna是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌

3、体dnadna被被称为原噬菌体。称为原噬菌体。噬菌体噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体烈性噬菌体, ,只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期分为两种：分为两种：（1 1） 溶菌周期：溶菌周期：噬菌体噬菌体的生活周期的生活周期烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)virulent phage)（2 2） 溶原周期：溶原周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的dnadna整合整合到细菌的染色体到细菌的染色体dnadna中。形成这中。形成这一过程称为溶源化一过程称为溶源化温和噬菌体（温和噬菌体（temperate

4、phage)temperate phage)2 2、 噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：结构：无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、 线状体型线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性dnadna、 双链环形双链环形dnadna、 单链环形单链环形dnadna、 单链线形单链线形dnadna、 单链单链rnarna。3、-dna的物理图谱的物理图谱 -dna为线状双链为线状双链dna分子，两端各有一个分子，两端各有一个12核苷核苷酸的互补单链（粘性末端）酸的互补单链（粘性末端）gggcg

5、gcgac ct, cccgccgctgga，称为，称为cos区，全长区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。因组中聚集在一起。噬菌体噬菌体 组成特点组成特点： 双链线状双链线状dnadna分子，分子， 全长全长50kb50kb， 含含6565个基因，个基因， 在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为coscos位点。位点。 噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（溶菌性生长（lyticlytic path

6、way pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其噬菌体感染细菌后，借助其2 2个个coscos位点互补成环，在宿位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长溶源性生长(lysogenic(lysogenic pathway) pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身噬菌体感染细菌后，可将自身dnadna整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂中去，与

7、之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解解 。噬菌体 a wb def z j att xis n cl cro o p q sr 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos位点位点 cos 位点位点ararecori目的基因ecoriecori插入型置换型a w b c d e f z u v g h m l k i j b2 ci cro cii o p q s r att int xis gam red ciii ncos cos 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 dnadna合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生

8、长非必须区段ci ci基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构5-cggggcggcgacctcg-33-gccccgccgctggagc-5 cleavage ligation(during packaging) (after infection) gggcgggcgacctcg-35-cg + gc-53-gccccgccgctggathe phage cos endscircular form linear form （二）（二）噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型 （1） 插入式载体插入式载体 一种只具有一个可供外源一种只具有一个可供外源

9、dnadna插入的克隆位点的插入的克隆位点的 派生载体。派生载体。 （2 2） 替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的两个位点之间的dna区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的dna片段所取代。片段所取代。 （3 3） 凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体（2） 替换型载体（取代型载体） 外源外源dnadna取代噬菌体染色体中对于噬菌体取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段的感染和复制非必要的片段 ( 20 kb)( 20 kb) 高感染效率高感染效率 (10(109 9 转化株转化株/ug/ug 载体载体 d

10、na, dna, 比质比质粒高粒高100-100-倍倍) )e.g. embl3, dash替换替换式载体式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源dna可以取代这一片段，例如charon 4a、 embl 3/ 4、charon40等载体，这些载体是用lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的lac z）替换入噬菌体的中间区段，同时将lac 5作为选择标记，使用时用ecori水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染e.coli使之在e.coli内繁殖，并裂解e.coli，形成空斑。换型噬菌体是使用最广泛的载体。 （3 3）凯伦噬菌体

11、载体）凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源承受外源dnadna的能力：几个的能力：几个kbkb到到23kb23kb（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） （三）体外包装（三）体外包装 噬菌体噬菌体dnadna体外重组后，一般必须经体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组重组dnadna导入导入e.colie.coli细胞内。这是因为以感细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达染方式导入细胞的频率可达10106 610108 8/gdna

12、/gdna，而以转染（，而以转染（translationtranslation）的方式导入的频率仅为的方式导入的频率仅为10103 310105 5/ gdna/ gdna。 噬菌体的包装限制为野生噬菌体噬菌体的包装限制为野生噬菌体dnadna（约（约48.5 kb48.5 kb）的）的75%105%75%105%。 由于由于噬菌体包装时，当dna的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型dna（48.5kb）的75%105%左右的，要求载体dna和外源dna长度之和在3953kb之间。 插入式载体可携带的外源片段较替换式为小。 噬菌体载体可接受噬菌

13、体载体可接受15 kb-23 kb的外源的外源dna片段，它既可作为克隆载体，也可作片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。筛选标记：筛选标记： 蓝白斑蓝白斑(lacz)、噬菌斑噬菌斑等等。重组噬菌体重组噬菌体的分子量必须在的分子量必须在野生型噬野生型噬 菌体菌体 分子量大小的分子量大小的75%至至105%之间。之间。用途：用途：b.用于构建基因组或用于构建基因组或cdna文库。文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。用于抗体库或随机肽库的构建。a.用作一般的克隆载体。用作一般的克隆载体。（四）（四） -dna的抽提的抽提 1)

14、大肠杆菌培养至对数生长期大肠杆菌培养至对数生长期2) 加入加入-噬菌体或重组噬菌体或重组-噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液，37培养培养1hr3) 用新鲜培养稀释，继续培养用新鲜培养稀释，继续培养4-12hr4) 高速离心，沉淀噬菌体高速离心，沉淀噬菌体5) 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放-dna6) 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀dna（五）（五）-dna作为载体的优点作为载体的优点 1) 体外包装病毒颗粒，高效感染体外包装病毒颗粒，高效感染e.coli2) 装载外源能力为装载外源能力为25kb，大于质粒，大于质粒3) 筛选方便筛选方便4) 重组重组-dna分子提取容易分子提取容易 二、二、单链噬

15、菌体载体单链噬菌体载体（一）（一）单链噬菌体载体单链噬菌体载体单链环状单链环状dna的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：单链dna噬菌体载体m13、f1、fd。优越性：1. 单链dna噬菌体的复制，是以双链环形的dna为媒介的，这种复制形式 的 dna简称rfdna；2. 不论是rfdna还是ssdna都能感染大肠杆菌；3. 单链dna噬菌体颗粒的大小，是受其dna的多制约的，不存在包装限制 问题；4. 容易测定外源dna片断的插入取向；5. 可产生含外源片断的单链dna分子。 3. m13噬菌体噬菌体 噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型dna经经pii蛋白蛋白造缺口造缺口35经

16、经pii蛋白蛋白剪切剪切释出单链释出单链dna(正链正链)进入下进入下一循环一循环5335滚环复制滚环复制在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图 m13噬菌体几个重要特点噬菌体几个重要特点：1. m13噬菌体噬菌体不溶解不溶解宿主细胞，只是宿主细胞，只是降降 低低宿主细胞的生长速度。宿主细胞的生长速度。2. m13噬菌体能以噬菌体能以单链单链和和双链双链两种方式两种方式存在，因此可以用存在，因此可以用感染感染(经包装的单经包装的单链链dna)和和转化转化(双链双链dna)。3. 克隆的外源基因片段不宜大于克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。m13m13噬菌体载体噬菌体载体 m13m13是

17、一种含单键（是一种含单键（+ +）dnadna（ssdnassdna）的）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（测定序列（sangersanger双脱氧法）、基双脱氧法）、基因的因的定点突变研究、异源双链定点突变研究、异源双链dnadna的分析等。的分析等。 m13m13噬菌体的特点噬菌体的特点感染ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（ replication form dna, rf

18、 dna）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染e.coli的f+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是rf dna或ss dna都能转染e.coli的f+或f-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以m13噬菌体并不存在包装限制的问题。 m13m13单链单链dnadna噬菌噬菌体的生命体的生命周期周期rf dnaphage m13 replication in the host cell:+rna poldna poliiirfnicked by gene 2 protein+ss-rolling circle re

19、plication, then cut and ligatecoated with gene 5 protein gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. linear m13 phagereleased from the cell.（二）（二） m13m13载体的构建载体的构建（1 1）克隆）克隆区域的选定区域的选定 基因间隔区（基因间隔区（i internterg genic region, igenic region, ig区）区）j. messingj. messing证明，证明，igig区存在区存在m13m13的的复制起点复制

20、起点，但可以插入，但可以插入外源外源dnadna而不影响而不影响m13m13噬菌体的噬菌体的活力。活力。在在igig区内插入一个大肠杆菌的区内插入一个大肠杆菌的laczlacz（ - -肽序列肽序列) )。 利用利用 - -肽序列中的三个单一酶切位肽序列中的三个单一酶切位点（点（bgl iibgl ii、ava ii ava ii 和和 pvu ipvu i）。）。(2)(2)加入加入酶切位点酶切位点 在在igig区内加入单一内切酶位点区内加入单一内切酶位点第一个第一个m13m13载体：载体：m13mp1m13mp1：m13 rfbsui不完全消化不完全消化各种长度的线性片断各种长度的线性片断

21、（其中应有只在（其中应有只在igig上切开的线性上切开的线性全长全长m13m13）e.coli lac基因的基因的hindii片断片断(laci、lacp、laco、lacz）连接连接m13mp1jm101宿主宿主只有在只有在ig区插入区插入lacz才能存活并才能存活并在在xgal上出现互补的蓝噬菌斑上出现互补的蓝噬菌斑（三）（三）1 1）有有mcsmcs，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段2 2）xgalxgal显色反应，可供直接选择显色反应，可供直接选择3 3）无包装限制，克隆能力大）无包装限制，克隆能力大4 4）可以克隆双链）可以克隆双链dnadna分子中的每一条链分子中的每

22、一条链子代子代m13m13噬菌体中包含的是单链噬菌体中包含的是单链+dna+dna。 （四）（四）m13噬菌体用途噬菌体用途：1） dna序列测定；序列测定；2） 制备单链制备单链dna探针；探针；3） 用于定点突变的研究。用于定点突变的研究。m13m13载体载体 具有多克隆位点(mcs)，方便克隆。许多m13载体的多克隆位点与质粒载体puc序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆dna片段，克隆在m13 rf dna分子上的双链dna片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据m13的生物学特性知道，m13子代噬

23、菌体中总是只含有（）链，所以m13载体克隆的外源dna片段在子代噬菌体中究竟是含有dna分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。 m13m13克克隆载体隆载体分子结分子结构图构图三、噬菌粒载体三、噬菌粒载体噬菌粒载体噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便多克隆位点等，方便dnadna的操作，可在细胞的操作，可在细胞内稳定存在

24、；又具有单链噬菌体的复制起点，内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。殖，产生单链的子代噬菌体。由由质粒载体质粒载体与与单链噬菌体载体单链噬菌体载体的复制的复制起点结合而成的新型载体系列。起点结合而成的新型载体系列。mcs噬菌体噬菌体ori质粒质粒oriamprlacz laci约约3000bp3000bp（比（比m13m13小）小）克隆能力大克隆能力大能插入能插入10kb10kb的外源的外源dnadna。两种复制形式两种复制形式分子量小分子量小1 1、噬、噬菌粒载体的特点菌粒载体的特点既具有

25、质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。又能在噬菌体内进行单链复制。常用的噬菌粒载体常用的噬菌粒载体puc118puc118和和puc119puc119 1. 1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组dnadna，可克隆可克隆10kb10kb的外源的外源dnadna片段，并易于进行分离与操作；片段，并易于进行分离与操作； 2. 2. 编码一个编码一个ampampr r基因作为选择记号，因此只有携带基因作

26、为选择记号，因此只有携带puc118puc118或或puc119puc119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；的选择； 3. 3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达拷贝数含量高，每个寄主可高达500500个，所以只要用个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体dnadna； 4. 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源源dnadna片段，不经

27、修饰便可直接插入到载体分子上；片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5. 5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌laczlacz基因的基因的5-5-端编码区，可按照端编码区，可按照iptgiptg组织化学显色反应组织化学显色反应试验，筛选重组子；试验，筛选重组子；6. lacz6. lacz基因是置于基因是置于laclac启动子的控制之下，这样插启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7. 7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像

28、质粒一样按常规况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链的方式，复制形成大量的双链dnadna分子分子8. 8. 带有一个带有一个m13m13噬菌体的复制起点，在有辅助噬噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单dnadna拷拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9. 在puc118和puc119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链dna，另一个则可转录出负链dna；10. 可以直接对克隆的dna片断进行核苷酸的序列测定，免

29、去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。pbluescript噬菌粒载体基本结构： 1. 在多克隆位点的两侧，有一对t3和t7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动； 2. 同时具有一个单链噬菌体m13或f1的复制起点和一个来自cole1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的dna； 3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacz基因，可用xgal-iptg组织显色反应法筛选噬菌粒载体。t7t3用于体外转录3 pcr3 pcr产物克隆载体产物克隆载体 t t 载体载体pcrpcr系列载体系列载体invitrogenin

30、vitrogen公司开发的公司开发的线性线性噬菌粒载体。噬菌粒载体。 结构结构pucpuc的质粒部分、的质粒部分、fifi噬菌体噬菌体oriori、kankanr r和和ampampr r抗性。抗性。mcsmcs的中部已经切开，各有一个的中部已经切开，各有一个33端突出的端突出的t t。 特点特点pcrpcr产物往往在产物往往在33端突出一个端突出一个a a，所以能，所以能与这个载体直接连接。与这个载体直接连接。aattt vectorpcr productt4 dna ligaseaa四、柯斯质粒载体四、柯斯质粒载体柯斯质粒柯斯质粒( (cosmidcosmid) ) 一种人工构建的一种人工

31、构建的克隆载体，包含了克隆载体，包含了噬菌体的噬菌体的coscos基因。柯基因。柯斯质粒能被包装到斯质粒能被包装到噬菌体粒子中，感染噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入大肠杆菌；它携带入宿主细菌的宿主细菌的dnadna片段片段（超过（超过45kb45kb）要比质）要比质粒载体携带的要大粒载体携带的要大（一）粘粒（一）粘粒(cosmid) 组成：组成：2. 抗性基因；抗性基因；1. 质粒复制的起始位点质粒复制的起始位点(ori)；3. 用于插入目的基因的单个酶切位点；用于插入目的基因的单个酶切位点；4. 噬菌体的噬菌体的cos位点位点。 可见，可见，cosmid是由质粒和是由质粒和 噬菌体的噬菌

32、体的cos位点位点构建而成。构建而成。与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：（1）具有）具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；（2）有像质粒一样的选择标记；）有像质粒一样的选择标记；（3）cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在段，可克隆外源片段的长度在1545 kb之间。之间。由于由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库

33、的构建，而因组文库的构建，而噬菌体载体多用于噬菌体载体多用于cdna文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，隆，pjb8是最常用的粘粒载体之一是最常用的粘粒载体之一（4) 多种单一酶切位点，便于克隆多种单一酶切位点，便于克隆 1、粘粒载体的优点、粘粒载体的优点柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点1. 具有噬菌体的特性；2. 具有质粒载体的特性；3. 具有较高容量的克隆能力；4. 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力 特点：特点：1. 可插入长达可插入长达2741kb的外源基因，的外源基因，方便地用于方便地用于克隆大片段克隆大片段dna。2. 加入加入 噬菌体噬菌体头部和尾部蛋白，可将头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于粘粒包装成类似于 噬菌体噬菌体的具感染的具感