5第五章PCR法获取目的基因

1、2021-11-14pcr法获取目的基因1第五章第五章 pcr法获取目的基因法获取目的基因目目 录录pcr技术的创建pcr技术的原理 pcr的反应体系和条件pcr的类型和应用pcr法获取目的基因2021-11-142pcr法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因3dna， 生命的蓝图生命的蓝图2021-11-14pcr法获取目的基因4pcr技术技术polymerase chain reaction多聚酶链式反应一、pcr技术的创建2021-11-145pcr法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因6kary b. mullis（1944）http:/三篇重要论文三篇

2、重要论文 引物引物2021-11-147pcr法获取目的基因2021-11-148pcr法获取目的基因1983年春夏之交的一个晚上，年春夏之交的一个晚上， mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用开车去乡下别墅的路上萌发了用引物去扩增模板引物去扩增模板dna 的想法。他开车时的想法。他开车时,感觉两排路灯就是感觉两排路灯就是dna的两条链，的两条链，自己的车和对面开来的车象是自己的车和对面开来的车象是dna聚合酶，面对面地合成聚合酶，面对面地合成dna。缺点缺点:dna聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加dna聚合酶。聚合酶。 2021-11-149pc

3、r法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因10二、 pcr技术的原理 1.pcr技术的原理高温变性低温退火温延伸 （1）类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物 （2）pcr过程：由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成 变性：94左右，使双链dna模板解离成为单链； 复性：55左右，引物与模板dna单链互补配对结合； 延伸：72左右，“模板-引物结合物”在dna聚合酶作用下，以dntp为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的dna链 （3）重复“变性-退火-延伸”的循环，可获得大量的新dna链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得

4、大量dna产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。2021-11-1411pcr法获取目的基因复温2.pcr技术依赖于dna的变性和复性 2021-11-1412pcr法获取目的基因3.pcr技术的特点2021-11-1413pcr法获取目的基因三、pcr技术的反应体系和条件1.反应体系2021-11-1414pcr法获取目的基因2.基本程序2021-11-1415pcr法获取目的基因2021-11-1416pcr法获取目的基因2021-11-1417pcr法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因18注意事项注意事项1.eb是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套是强

5、诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,并且并且不要把不要把eb洒到桌面或地面上。凡是沾污了洒到桌面或地面上。凡是沾污了eb的容器或物品必的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了须经专门处理后才能清洗。沾染了eb的实验垃圾需专门回收的实验垃圾需专门回收处理。处理。2.观察观察dna离不开紫外透射仪，离不开紫外透射仪，可是紫外光对可是紫外光对dna分子有切割分子有切割作用作用。从胶上回收。从胶上回收dna时，时，应尽量缩短光照时间并采用长波应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割），以减少紫外光切割dna。3.每加完一个样品要更换每加完一个样品

6、要更换tip头，以防止互相污染头，以防止互相污染，注意上样时，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。线状dna分子、环状dna分子均可；模板的浓度和纯度是影响pcr的重要因素：模板过多可能增加非特异性产物；纯度不高会影响pcr的效率，甚至得不到产物。3.pcr反应条件2021-11-1419pcr法获取目的基因3ntaq dna聚合酶（thermus aquaticus)：0.5-2.5 u/50 l体系，所用的酶量可根据dna、引物及其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反应特异性下降，酶量过少影响反应产量； taq dn

7、a聚合酶活性的：92.5 130 min；95 40 min；97 5 min； taq dna聚合酶的定义：74下，30 min，掺入 10nmol/l dntp到核酸中所需的酶量； taq dna聚合酶的：一般pcr中出错率为110-5/bp，在利用pcr克隆和进行序列分析时应注意。 类型：taq dna聚合酶普通型，pcr产物末端为a； pfu dna聚合酶(pyrococcus furiosus)高保真，出 错率为110-6/bp，pcr产物为平末端。2021-11-1422pcr法获取目的基因n反应缓冲液（pcr buffer）组分：一般含10-50 mmol/l triscl (2

8、0下ph8.3-8.8)、50 mmol/l kcl和适当浓度的mg2+；triscl：在20时ph为8.3-8.8，但在实际pcr反应中, ph为6.8-7.8；50 mmol/l的kcl：有利于引物的退火；buffer中加入5 mmol/l的二硫苏糖醇(ddt)或100 g/ml的牛血清白蛋白(bsa)，可稳定酶活性；加入t4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的dna片段有利；各种taq dna聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。nmg2+浓度：0.5 mmol/l-2 mmol/l，mg2+浓度过低会降低taq酶活性； mg2+浓度过高影响反应特异性。对于一种新的pcr反应，可以用0.1-5

9、 mmol/l的梯度进行mg2+预备实验, 选出最适的浓度；mg2+的作用：dna聚合酶的激活剂，可影响酶的活性和真实性,还影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。在pcr反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团（如磷酸基团、edta等可能影响mg2+离子浓度的物质），以保证最适mg2+浓度；dntp可与mg2+结合：使游离的mg2+浓度下降,影响dna聚合酶的活性。2021-11-1424pcr法获取目的基因ndntp（ 4种三磷酸脱氧核苷酸）浓度：20-200mol/l，dntp浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；

10、理论上4种dntp各20mol/l, 就足以在100l反应中合成2.6g的dna。当dntp终浓度大于50 mmol/l时可抑制taq dna聚合酶的活性；四种dntp浓度应相等，以减少合成中由于某种dntp不足而导致的掺入错误；dntp可与mg2+结合,使游离的mg2+浓度下降,影响dna聚合酶的活性。dntp制备：应用naoh将dntp溶液的ph调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dntp原液可配成5-10mmol/l并分装，-20贮存。2021-11-1425pcr法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因26预变性：94 5 min变性： 94 20 s-45 s（使

11、双链dna解链为单链）退火：温度由引物的解链温度tm决定，时间为45 s左右。 提高温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。延伸：循环次数：延伸补齐： ，5 min10 min2021-11-1427pcr法获取目的基因npcr仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等电泳系统等ntakara taq (5u/ l) 10pcr缓冲器缓冲器 (含含mg 2+) dntp混合混合(各各2.5 mmol/l) 模板模板 (10ng，质粒，质粒) 引物（引物（p1和和p2, 10 mmol/l)实验仪器及材料实验仪器及材料10pc

12、r缓冲液：(100 mmol/l tris-hcl, ph8.3, 500 mmol/l kcl, 15mmol/l mgcl2) insertecor1xho1pcmv-myc-t10p1: 5ttccaagcttcaccatggcatcaatg cagaag c保护性碱基保护性碱基 hind iiitm=4（gc）2（at） 41221170 .p2:5tcgcggatccagtggcagctt gctaatctcattg 保护性碱基保护性碱基 bamh i tm=4（gc）2（at）411213 70 .pcr混合混合(50 l):模板模板: 1 l (10ng) p1: 1 l (10

13、mmol/l) p2: 1 l (10mmol/l) dntps: 4 l (2.5mmol/l) taq polymerase: 0.5 l (5u/l)10缓冲液（缓冲液（mg2+）: 5 lddh2o: 37.5 l pcr条件：条件： 94变性变性5min后开始以下循环后开始以下循环 94变性反应变性反应45 sec； 65退火反应退火反应45 sec； 72延伸反应延伸反应1 min； 进行进行30个循环；个循环； 最后最后72反应反应7min； 4 冷却恒定。冷却恒定。 pcr产物分析产物分析取取3-5l pcr产物，采用产物，采用1.2琼脂糖琼脂糖凝胶电泳分析凝胶电泳分析pcr产

14、物的量，检测产物的量，检测引物扩增的特异性，并可根据标准引物扩增的特异性，并可根据标准脱氧核糖核酸的量粗略计算脱氧核糖核酸的量粗略计算pcr产产物的总量。物的总量。pcrpcr结果：结果：脱氧核糖核酸标记脱氧核糖核酸标记pcr产品产品1.0kb学生实验结果学生实验结果(4 l)1.不对称pcr目的：扩增产生特异长度的单链dna。 方法：采用两种不同浓度的引物，分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01mol/l：0.5mol/l，关键是限制性引物的绝对量。 用途： 制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 四、pcr的类型2021-11-1442pcr法获取目的基因 2021-11

15、-1443pcr法获取目的基因4.嵌套pcr(nested primer pcr)采用两对引物进行采用两对引物进行pcr，其中第二对引物位于第一对引物内，其中第二对引物位于第一对引物内p1上p1下p2上p2下用途：用途：验证第一次验证第一次pcr产物的特异性；产物的特异性； 进行特殊进行特殊pcr，如合成探针模板。，如合成探针模板。5.反向pcr (reverse pcr) 目的：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的dna片段，对某个已知dna片段两侧的未知序列进行扩增。 用途：探索邻接已知dna片段的序列；用于仅知部分序列的全长cdna的克隆；建立基因组步移文库。2021-11-1447pc

16、r法获取目的基因pcr法获取目的基因6.多重pcr（复合pcr）目的：用于检测特定基因序列的存在或缺失。123412342021-11-14487.lp-pcr（labelled primers)目的：利用同位素、荧光素等对pcr引物进行标记，用以直观检测目的基因。用途：特别适合大量临床标本的基因诊断； 可同时检测多种基因成分。2021-11-1449pcr法获取目的基因2021-11-1450pcr法获取目的基因8.锚定pcr（anchored pcr, a-pcr）pcr技术需了解靶基因片段两个末端的序列对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？2021-11-1451pcr法获取目的基因锚定

17、pcr首先合成第一链cdna，然后再添加一同聚物尾巴（polydg)，与同聚物尾巴配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydc)一起作pcr扩增2021-11-1452pcr法获取目的基因9.pcr固相分析法可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作2021-11-1453pcr法获取目的基因10.原位pcr原位聚合酶链式反应（in still pcr，ispcr）是由haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行pcr扩增，可进

18、行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。2021-11-1454pcr法获取目的基因 （2）鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ish），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的pcr则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ispcr则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排以及分析细胞内rna的表达产物。2021-11-1455pcr法获取目的基因细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后使得一般pcr试剂（包括引物和taq酶）能够进入细胞p

19、cr扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物a.阳性对照b.阴性对照c.原位检测mrna表达2021-11-1456pcr法获取目的基因11.反转录pcr（rt-pcr)逆转录酶dna聚合酶mrnacdna杂合双链杂合双链pcr扩增2021-11-1457pcr法获取目的基因2021-11-14pcr法获取目的基因5812.荧光定量 pcr（real-time pcr)通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。2021-11-14pcr法获取目的基因59内掺式染料sybr green i序列特异

20、性探针taqman molecular beacons（分子信标分子信标） dual probes(fret)荧光共振能量转移引物特异性探针 amplifluor (intergen)2021-11-14pcr法获取目的基因60实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了pcr反应的特异性增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量结果分析更加快捷结果分析更加快捷方便方便，无需，无需电泳检测电泳检测2021-11-14pcr法获

21、取目的基因61全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量pcr仪仪 普通梯度普通梯度pcr仪仪2021-11-14pcr法获取目的基因62o t-vectoro hotstart taqo rt-pcro rapd-pcro ddrt-pcro lm-pcro inverse pcro nested pcro real-time pcro raceo flow chip pcro taso multiplex pcro immuno pcro asymmetric pcro lp-pcro nasba o recombinant pcr o aflpo sscpo in situ pcro taqman/sybr green五、pcr技术的应用1.基因克隆2021-11-1463pcr法获取目的基因+2021-11-1464pcr法获取目的基因2.遗传病的诊断2021-11-1