基 因 工 程期末复习

1、基 因 工 程第一章：1.基因工程：在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。(工具酶也是必备元件)基本用途：大规模生产生物活性物质，设计、构建生物的新性状甚至新物种。2.基因工程研究的主要内容：目的基因的分离与制备，DNA片段和载体的连接，外源DNA片段引入受体细胞，选择目的基因，目的基因表达。3.基因工程的意义：大规模生产生物分子，设计构建新物种，搜寻、分离和鉴定生物体。

2、发展前景：农林牧渔业中的应用，工业中的应用，在医学中的应用。第二章：（结合课本划线内容）1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵；（发现的现象：寄主细胞的限制和修饰作用。）hsd R：编码限制性核酸内切酶，hsd M：编码限制性甲基化酶，hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达。（限制核酸内切酶类型：I型，II型，III型；）2. 属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 先后分离出3种限制酶：HindI HindII HindIII，EcoRI在抗

3、药性R质粒上发现的第一个酶。同尾酶：识别不同的序列，能产生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸内切酶的切割方式：在识别序列的对称轴上同时切割形成平末端如EcoRV;在识别序列的双侧末端进行切割，若于对称轴5端突出的末端如EcoRI;反之产生3端突出的末端如PstI。限制性核酸内切酶反应的注意事项：限制性核酸内切酶为浓缩酶；浓缩的酶液要用核酸内切酶缓冲液稀释，（不能用水稀释，以免酶变性）；核酸内切酶在含有50%甘油的缓冲液中，于-20度稳定保存；反应中尽可能少加水，使反应体积减到最小；延长反应时间，使所需酶量减少。影响限制性

4、核酸内切酶活性的因素：DNA样品的纯度；DNA样品的甲基化程度；核酸内切酶的缓冲液性质；4.DNA连接酶基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；连接多个平头双链DNA分子。（注意：DNA连接酶所连接的是DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，即Nick链接，不能链接两条单链DNA或环化的单链DNA分子。） DNA连接酶的种类：T4噬菌体DNA连接酶（最常用）、大肠杆菌DNA连接酶（最常见）、T4噬菌体RNA连接酶。5.DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：53的DNA聚合酶活性；53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性。用途：主要

5、用于杂交探针的制备。切口平移法是目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶；Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。T4-DNA酶的基本特性：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在

6、四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端（注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多）；DNA片段的同位素末端标记。反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链；双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链6.核酸酶:单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），大肠杆菌的核酸外切酶VII反应不需要Mg2+。 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII），大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切。单、双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo），l核酸外切酶特异性地从5 端外切。 单链核酸内切

7、酶：S1核酸酶，来自稻谷曲霉菌。基本特性：降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍，是降解单链RNA的核酸内切酶，反应条件：Zn2+必需，最适pH范围为4.0 - 4.3，需要NaCl 10 - 300 mM。S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA。单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶，来自艾氏交替单胞菌。基本用途：诱发DNA突变。 核酸修饰酶：末端脱氧核苷酰转移酶（TdT），来自小牛胸腺。基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。碱性磷酸单酯酶：来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP），来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（

8、BAP）。基本用途：催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5-OH末端，防止载体的自身环化。T4-PNP（T4噬菌体多核苷酸激酶）的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷，用于探针的末端同位素标记。7.如何防止载体自身环化作用？答：使用碱性磷酸酶处理，去除其5末端的磷酸基团，这样载体DNA分子的两个黏性末端发生退火互补，失去了链接能力，不能形成共价环化结构，这种分子是不稳定的，在连接部位容易解链形成开环的线性分子，通过碱性磷酸酶预处理线性载体，提高插入片段的用量，可以有效防止载体自身环化。第三章1.在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载

9、体。基因工程对载体的要求：在宿主细胞内能独立复制，有选择性标记，有一段多克隆位点。，外源DNA插入其中不影响载体的复制，分子量小，拷贝数多，容易从宿主细胞中分离纯化。载体的种类：质粒、单链DNA噬菌体M13、 l噬菌体的衍生物 2.质粒:是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒的一般生物学特性:分子小（1-200kb）、编码基因少、环形状（双链环状DNA）。质粒的空间构型： 共价闭合环状DNA（ccDNA)即SC构型， 开环DNA（ocDNA）即OC构型， 线形DNA （lDNA）。同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：sc

10、DNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。质粒的基本特征：质粒的自主复制性，质粒的不相容性，质粒的可转移性，携带特殊的遗传标记。（拷贝数：细胞内质粒/染色体数）反应质粒复制的强度。质粒独立复制的三个特性：在宿主细胞内，单向，由自主和宿主细胞双重遗传控制。质粒的类型：（1）接合型质粒：如：F质粒。除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。在天然条件下，能从一个细胞自行转移到另一个细胞，大部分属于严紧型质粒。（2）2. 非接合型质粒：如R质粒（抗性质粒）、Col质粒。虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞

11、转移到另一个细胞。在天然条件下不能自己转移到另一个细胞中。大部分属于松弛型质粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型质粒载体缺乏转移所必须的mob基因，所以不能发生自我转移。质粒的复制类型：1. 严紧型质粒：拷贝数少，只有13份拷贝。2. 松弛型质粒：拷贝数多，有1060份拷贝。3理想质粒载体的必备条件：常见可用于基因工程的天然质粒有pSC101、CoLEl。第一个用于基因克隆的天然质粒是pSC101，是一个严紧型质粒，每个宿主细胞仅有1-2个拷贝，具有多个限制性核酸内切酶的单一酶切位点；另一个天然质粒载体是CoLEl，它唯一单酶切位点EcoRI位于大肠杆菌素EI的编码基因内。

12、质粒载体必须具备的基本条件：（1）具有复制起点；（2）具有抗菌素抗性基因；（3）若干限制性内切酶的单一位点；（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。多克隆位点：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶酶切位点的DNA片段。抗菌素抗性:氨苄青霉素抗性(杀死生长的细菌)，卡那霉素抗性（杀死细菌），四环素抗性(杀死生长的细菌)，链霉素抗性（杀死细菌），氯霉素抗性（杀死生长的细菌）。3.重要的大肠杆菌质粒载体：（1）pBR322：松弛型复制、氯霉素可扩增、拷贝数 50 - 100 / cell、用于基因克隆。（2）pUC18 / 19：拷贝数 2000 - 3000 / cell、装有多克隆

13、位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ、用于基因克隆和测序。注：pUC7是最早构建的一种PUC质粒载体。pGEM-3Z：多拷贝、装有多克隆位点（MCS）、正选择颜色标记 lacZ、用于外源基因的高效表达。 克隆载体：指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质体载体。（名词解释）4.容菌周期（裂解周期）：感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。容原性周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化。5.单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：M13、f1、fd 噬菌体。特点：单链DNA；复制型（RF）是双

14、链环状DNA；RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑；不存在包装限制；可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。（1） M13 噬菌体基本特性：寄主；DNA长度：6407bp；DNA提纯：容易提取；没有包装限制。优点：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链。缺点：插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。人工染色体：酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体、哺乳动物人工染色体（MAC）。第四章1.基因组DNA提取方法：

15、碱抽提法（最常用）、煮沸法、去污剂裂解法。碱抽提法提取质粒DNA原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。碱抽提法提取质粒DNA的步骤：溶菌；破膜，蛋白质和DNA变性；中和；离心除去沉淀；纯化DNA；沉淀DNA。所用的试剂作用： 溶菌酶：能水解菌体细胞壁的肽聚糖中的b-1，4糖苷键 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解NaOH-SDS：NaOH使DNA双链变性，SDS溶解细胞

16、膜蛋白和细胞内蛋白，使蛋白质变性沉淀 NaAc-HAc缓冲液：用来中和NaOH变性液，使DNA复性 乙醇:用于沉淀DNA RNase A:降解RNA渣滓 TE缓冲液: DNA保存液 酚-氯仿: 蛋白变性剂,使蛋白质沉淀。2.影响质粒DNA产量的因素：受体菌株；质粒拷贝数；质粒大小。(1).细菌基因组DNA的制备:（1）细胞裂解（2）DNA纯化（3）沉淀DNA(2) 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提:（1）组织粉碎（2）细胞裂解（3）纯化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。（3）.从植物组织中制备 DNA：（1）组织粉碎（2）细胞裂解（3）纯化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。-

17、（了解看看）3.DNA的定量和纯度测定：核酸在波长260nm处有最大的吸收峰，蛋白质的最大吸收峰在280nm。（注:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢）4.琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）,空隙大小决定其分辨分子大小的能力,空隙小，分辨率高，空隙大，分辨率低。聚丙烯酰胺凝胶电泳：优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。琼脂糖凝胶电泳：100050000bp。聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp基因扩增技术-PCR技术；通过加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA称

18、为DNA变性；解除变性条件后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链，称DNA复性。（退火） 应用：核酸的基础研究 、序列分析、转基因检测。 第五章1.目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。基因组DNA片断化：限制性内切酶法、随机片断化、机械切割法。化学合成目的基因：（常用的方法）磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法。2.基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。构建基因文库的载体选用：（常用的载体）l载体系列：容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC：容量为1 Mb。基因

19、文库构建的一般步骤：染色体DNA大片段的制备；载体与基因组DNA大片段的连接；3.基因组文库的大小：N=ln(1-p)/ln(1-f) N为重组子数量；p为所需要的概率；f为分离基因片段与该生物基因组大小的比值。 （了解）4. 构建cDNA文库的一般步骤：总RNA（total RNA）提取；mRNA的分离纯化；cDNA的合成。 cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增。cDNA文库的特点：不含内含子序列。可以在细菌中直接表达。包含了所有编码蛋白质的基因。比DNA文库小的多，容易构建。cDNA文库的大小:N=ln(1-p)/(1

20、-1/n) N为克隆数；P为要求的概率；1/n为低丰度mRNA在总RNA中所占的比例。 （了解）第六章1.DNA片段的体外连接：粘性末端的连接、齐平末端（blunt end）的连接、（DNA接头连接法：DNA连接子法、DNA接头法）2.DNA体外连接应注意的事项：插入片断与载体的酶切位点互补（注：相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。用相同的酶切。用同尾酶切。）；DNA插入的方向正确；插入基因的开放阅读框（ORF）正确；防止载体自身环化连接。（方法：提高插入片断的用量；用碱性磷酸酶处理载体。）3.感受态细胞：受体细胞处于外源DNA的状态。 制备原理：一般用0

21、.01-0.05mol/l氯化钙处理受体细胞，增大细胞的通透性。感受态大肠杆菌的制备:培养大肠杆菌、OD600至0.3-0.4、On ice 5-10 min、4离心收集菌、On ice 30 min、用冰冷的60mMCaCl2重悬、4离心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重悬、4离心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重悬、分装、-70 冻存。外源DNA导入细菌的几种方法:转化、转染、转导。 转化方法：热休克法、电转化法。4. 影响转化率的因素：重组质粒、感受态细胞、外源基因导入真核细胞：一、导入酵母细胞：1. 菌株选择；2. 酵母的转化方法：（1）利用原生质球进行转化、（2）利用Li+盐进行

22、转化；3.导入植物细胞方法：叶盘法、电击法；4.导入哺乳动物细胞方法：磷酸钙沉淀法、脂质体载体法、显微注射法。（了解）5.如果在转化实验中，对照组不该长出菌落的平板长出了菌落，这种现象说明实验可能存在哪些问题？ 答：倒平板时培养基温度过高，加入的氨苄青霉素会失效；抗生素添加的量太少，浓度不够；培养平板灭菌不彻底，存在杂菌污染；培养平板上的部分菌株未转化成功；感受态细胞受到污染；培养时间过长，可能出现卫星菌落等等。6.基因工程上游工程操作技术：细菌的培养、染色体DNA的提取、凝胶电泳确认、PCR扩增反应（提纯、再次电泳确认）、PCR产物酶切过夜、PCR/ER产物电泳过程纯化。PBBSK/DH5转

23、化子培养、PBBSK质粒提取、质粒的电泳、PBBSK/ER产物、PBBSK/ER产物电泳。 两个步骤结合连接、转化、平板培养、筛选，鉴定重组子1 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV + V 2 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【 】 I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率 I + II + III I + II + IV I + III + IV II + III +

24、 IV I + II + III + IV 3 基因工程的三大理论基石是【 】 经典遗传学、细胞生物学、微生物学 分子遗传学、分子生物学、生化工程学 动物学、植物学、微生物学 生物化学、生化工程学、化学工程学 生理学、仿生学、免疫学 4 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【 】 基因诱变 分子克隆 DNA重组 遗传工程 基因无性繁殖 5 基因工程的单元操作顺序是【 】 增，转，检，切，接 切，接，转，增，检 接，转，增，检，切 检，切，接，增，转 切，接，增，转，检 6 生物工程的上游技术是【 】 基因工程及分离工程 基因工程及发酵工程 基因工程及酶工程 基因工程及细胞工程

25、基因工程及蛋白质工程 7 基因工程作为一种技术诞生于【 】 上世纪 50 年代初 上世纪 60 年代初 上世纪 70 年代初 上世纪 80 年代初 上世纪 90 年代初 8 利用基因工程扩增基因是依据【 】 基因定向重排 强化启动基因 增强子重组 SD 顺序的存在 载体自主复制 9 第一个由重组大肠杆菌生产的人类蛋白（多肽）药物是【 】 生长激素（Growth hormone） 胰岛素（Insulin） 干扰素（Interferon） 白细胞间溶菌素（Interleukin） 生长激素释放抑制素（Somatostatin） 10 下列有关基因的叙述，错误的是【 】 蛋白质是基因表达的唯一产物

26、基因是 DNA 链上具有编码功能的片段 基因也可以是 RNA 基因突变不一定导致其表达产物改变结构 基因具有方向性。AEBAB A第九章1.重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。 转化子：指导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞。 重组子的筛选方法：直接筛选（DNA鉴定、载体筛选）、间接筛选（翻译产物、转录产物）。具体方法：抗药性标记插入失活、B-半乳糖苷酶显色反应筛选法。B-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理：载体上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的b-半乳糖苷酶基因（ a片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和

27、受体菌基因组可以互补形成完整有功能的b-半乳糖苷酶。(了解看看)乳糖 半乳糖+ 葡萄糖Xgal 半乳糖 + 5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） 注：反应条件为B-半乳糖苷酶。注：由互补产生的lac+细菌较易识别，它在X-gal的存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落。假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码。2. 一个携带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因的质粒，被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoR I消化。消化物与酵母DNA片段连接后转化对氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素都敏感的E coli菌株。 （1) 利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞? （2) 怎样区分接受了插入酵母DNA的

28、质粒的克隆? 答：（1）氨苄青霉素。 （2）转化后涂在只加氨苄青霉素的平板上，将这个平板上的菌落转到加卡那霉素的平板上，将两个平板对照，选择只在氨苄青霉素的平板上生长的菌落，即为插入酵母DNA的质粒的克隆。3.  以pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。答：原理：由于四环素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成，而不是杀死细菌；而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺人蛋白质，则是致命的。因此在有四环素的条件下，环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌。经过环丝氨酸处理后，存活的细胞中tets型得到很大富集，

29、而经过若干次连续处理，即能获得在tetr基因内含有插人物的质粒的细胞。基本操作：(1)转化后有三种表型的细菌，其中只有一种是重组体：AprTcs；(2)用重组DNA转化受体菌后，将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养；此时只有非重组的双抗性菌可以生长，其他都被抑制；(3)由于有环丝氨酸的存在，AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡；(4)由于四环素只有抑菌而无杀菌作用，此时若解除四环素(离心洗涤)，加入氨基苄青霉素继续培养，则可使重组体大量生长。课件讲解：（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因：产生b-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素

30、指示液（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。4.根据插入基因的表型选择原理：1.弥补缺陷：转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷；2. 增加新性状：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。（了解看看）DNA电泳检测法:直接电泳检测法(从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量)、酶切电泳筛选法(比较DNA代数和长度)。5. PCR扩增检测法：1. 原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2. 过程：（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）（2）用外源DNA插入片断引物作PCR（3）电泳PCR产物（4）检查是否有PCR产物（5）PCR产物的

31、长度是否与外源基因一致。6.核酸杂交检测法原理：1.核酸杂交：重组克隆与探针杂交2. 检测用的探针：与外源DNA插入片断互补的序列。3. 识别标记：放射性同位素如32P，非放射性同位素如荧光素。7.Southern blotting（Southern印迹杂交法）：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。定义：将重组子DNA提取出来，用合适的限制性核酸内切酶将DNA切割，并进行凝胶电泳分离，然后经碱变性，最后同标记的核酸探针进行分子杂交的方法。（1）原位杂交筛选特点：应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。（了解）（2）R-环检测法：DNA和RNA杂交，外源基因的mRNA与重组载体杂交。

32、（了解）8. Northern blotting（Northern印迹杂交法）：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。定义：指从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交的方法。9.免疫化学检测法：对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交。放射性抗体检测法：抗体与产物的结合方式；免疫沉淀检测法：抗原抗体凝集反应。10.酶联免疫吸附测定（ELISA）步骤：（1）固定样品（2）一抗结合（3）二抗结合（4）显色反应（5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。局限性：准确性稍差11.免疫印迹（western blotting）法：指在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带的方法。

33、第十章1.表达载体：要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种载体称为表达载体。2.大肠杆菌表达外源基因的优势：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定。劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；细胞周质内含有种类繁多的内毒素。3.真核基因在大肠杆菌中表达存在的困难有哪些？在大肠杆菌mRNA 核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及与16S核糖体RNA3末端碱基互补的序列，即为SD序列；绝大多数真核生物的mRN

34、A分子，在5末端有帽子结构，3端有A尾巴，而原核生物没有；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做异己分子降解掉。原核生物基因表达的特点：只有一种RNA多聚酶；以操纵子为单位；转录和翻译偶联、连续进行；不含内含子，缺乏转录后的加工系统；调控主要在转录水平上；mRNA的核糖体结合位点。原核表达系统的注意事项：外源基因不能带有内含子；必须用cDNA；不能直接用真核基因组DNA；防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。（了解）4.常用的大肠杆菌表达载体：（1）表达载体的一般组成：一般载体+启动子+核糖体结合位点+翻译起始点AUG。

35、（2）大肠杆菌表达载体的组成部分：启动子：是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 启动子必须具备的条件：必须是一种强启动子；应是可诱导型的；这种启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。 注：Lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子。 （了解看下） 翻译的起始位点：核糖体结合位点（ RBS）、起始密码。转录终止子翻译终止密码翻译增强子 （了解看看）5.几种类型的原核表达载体：（1）非融合型表达载体：载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。如，pKK223-3 载体组成结构： 强启动子: tac（trp-lac）操纵基因调节基因终止子S-D序列和插入位点区表达

36、诱导物。（2）分泌型表达载体（3）融合蛋白表达载体系统-pGEX系列：表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 优点：便于融合蛋白的分离和纯化，可诱导高效表达。（了解）6.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位：（1）细胞质中表达： 优点：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞； 缺点：回收的蛋白生物活性差。(2)周质中表达优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。（3）胞外表达。7.如何有效地提高外源基因的表达效率？选择强启动子序列，如tac 等；调整S-D序列与AUG碱的距离；改变起始密码下面的几组密码子；增加mRNA的拷贝数和稳定性；减轻宿主细胞的代

37、谢负荷。影响外源基因表达效率的因素（或提高外源基因表达效率的方法）：（1）启动子的结构对表达效率的影响；如，一致顺序 即-35区与-10区之间的距离和-35区和-10区的碱基顺序。（2）转译起始序列对表达效率的影响；如SD序列；（3）启动子与外源基因之间的距离；（4）转录终止区对表达效率的影响；（5）载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响；（6）外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响。 （了解看看）8.提高表达产物的稳定性，防止其降解：（1）设计成融合蛋白（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解（3）表达分泌蛋白。 9.外源基因在真核细胞中的表达：（外源基因：启动子+MCS+polyA信号+终

38、止子）（一）酵母表达体系：（1） 酵母克隆载体分为：整合型载体(YIp)。特点：转化率低；不能在酵母细胞中自主复制；整合到酵母的染色体上；不能从酵母细胞中提取载体。复制型载体(YRp) 。特点：转化率高；可从大肠杆菌和酵母中提取质粒；着丝粒质粒(YCp)。特点：能稳定遗传，不易从细胞中提取；附加体型载体(YEp)。特点：很高的转化活性，拷贝数多，比YRP稳定。10.酵母转化和表达的一般过程：Lau- 酵母，（酶去壁）原生质体，（氯化钙处理）感受态，（转化）插入外源基因，酵母载体，（提取）大肠杆菌。酵母表达系统的优点：已经分离出很强的启动子，有翻译后的加工，安全性高。缺点：表达量普遍低，常常发生质粒丢失。第十一章1.Ti质粒：是一种环状双链DNA分子，根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱种类不同分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型。根癌