人类基因组DNA的提取与鉴定

1、实验一人类基因组dna的提取与鉴定实验目的1、学习人类基因纟rdna的提取原理和方法。2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。实验原理哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备dna,除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是 最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足 够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如川口腔上皮脱落细胞、 发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的dna提取方法大体类似, 但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制dnase对dna的降解；（2）尽最减少对溶液屮dna 的机械剪切破坏，保持dna分子的完整；（3）将蛋白

2、质、脂类、糖类等物质分离干净。制备基因组dna是进行呈因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度 不小于100-200kbo在dna捉取过程中应尽量避免使dna断裂和降解的各种因素，以保证 dna的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组dna有10“bp,可以从新 鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞屮提取，常是采用在edta以及sds等试剂存在 下用蛋白酶k消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的dna不仅经酚切后可用 于southem分析，述可用于pcr的模板、文库构建等实验。一、材料一份提取总dna的细胞或组织1.5ml eppendorf管、微量移液器打吸头、

3、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml ）<>二、设备离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微 波炉或沸水浴、透射紫外灯。三、试剂1细胞核裂解液（ste）： 0mol/lnacl, 10mmol/ltris-hcl, 1 mmoi/ledta2. 0.8% （w/v）标准琼脂糖；3. 0.5xtbe缓冲液4. 其他试剂：te缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1, v/v）、异丙醇或无水乙醇、电泳 加样缓冲液、漠化乙锭（eb）四、操作步骤（酚法抽提染色体dna）(一) dna的提取1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上濒、用牙刮颊部，

4、囁咀，用分泌出的唾液反 复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清；重复1次。2. 沉淀中加lml ix细胞核裂解液(ste),混匀，再加350j.il ste和150gl 10% sds,摇匀， 至出现粘稠透明状。加lopil 20mg/m 1蛋白酶k,摇匀。37°c温箱过夜或50°c 34小时。3. 加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和sds的沉 淀。4. 小心移上清至另一离心管，加等体枳氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。6

5、. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向dna溶液中加入2.5倍体积的无水乙醉，轻轻 摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状dnao用移液器吸头挑出dna沉淀，在新 配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将dna溶于20-1001 te中，测od值。7. te溶解的dna,在4°c下可保存一年，如耍求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置70 °c保存。(二) dna的鉴定及定量1. 比色法：dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋口质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小 分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定dna浓度，od值为1和 当于大约50

6、pg/ml双链dnao如用lcm光径，用 出0稀释dna样品n倍并以h2o为空白 对照，根据此时读出的od?"值即可计算出样品稀释前的浓度：dna (mg/ml) =50xod260 读数x稀释倍数/1000odna纯品的od260/od280为1.8,故根据od260/od280的值可以估计dna的纯度。若比值 较高说明含有rna,比值较低说明有残余蛋白质存在ood23o/od260的比值应在0.40.5 z间， 若比值较高说明冇残余的盐存在。用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或te把提取的样吊稀释100倍。将紫外分光光 度计的波长设为260nm,以重蒸水或te做为对照，测定od值

7、。od?60 二；dna的浓度二50 odm稀释倍数二o将波长换成280nm & 230nm,用同一样品再次测定od值：od280=； od230=；od260/od28o =； od260/od230=；结论：所提取的dna-2. 电泳鉴定取样品1川、电泳缓冲液5卩1、6x加样缓冲液山1 （含漠酚蓝和二甲苯青ff指示剂及甘 汕），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体xdna作为标准。dna 区带应比较集中，泳动速度与xdna相同或稍慢，证明分子量均50kb。一般见不到泳动 速度比浣酚蓝快的rna区带。如果dna不成区带，而是散开分布在入dna为漠酚蓝z间, 则说明

8、dna已经被降解成小分子，不能再用來进行限制性内切酹图谱分析。五、注意事项1. 酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋口质分开时，可加入适量ste稀释，然后再用酚 抽提。2. 保温可在4555°c范围内进行。3. 真核生物的dna分子很人，机械张力极易引起dna分子的断裂，因此抽提dna时动 作不可过猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管，以防机械力（震 动）将dna分子打得太碎。4. 沉淀dna时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。5. dna溶于te溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些te溶液。这样能保证dna样品 不至于太稀而无法使用，一般来讲，dna浓度为0.40.6m

9、g/ml最为理想。6. 溶于te溶液中的dna样品比较稳定，可在4°c冰箱中存放1年而不会降解。思考题：1、我们知道，一条染色体含有一-条dna,基因组中不同的染色体dna的大小是不 同的。按理来说，所提取的基因组dna中含冇多条大小不一的dnao但为什么用琼 脂糖电泳后仅能见到一条主带呢？2、基因组dna制备过程中提取缓冲液有哪些成分，作用是什么？3、基因组dna制备过程中需注意的事项有哪些？扩展内容植物基因组dna的提取利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有sds裂解细胞，使 蛋白质变性沉淀，用酚氯仿抽提除去蛋白，得到的dna溶液经乙醇沉淀。一、材料鲜嫩的水稻

10、幼苗或其它禾木科植物。液氮，陶瓷研钵,50ml离心管或1.5ml离心管,枪头,药勺。二、设备冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，移液器，电泳设备等。三、试剂1 提取缓冲液：100mmol/l tris ci, ph8.0； 5mmol/l edta, 500mmol/l nacl, 1.5% sds, lmol/lq-筑基乙醇。2. rnase a 母液。3. 5mol/lkac4. 其它试剂：酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),氯仿，异丙醇，te缓冲液，70%乙醇，灭菌双 蒸水ddh20o四、操作步骤：(一) 植物组织裂解液抽提1. 取3-5克嫩叶，剪碎，研钵中加液氮磨成粉状厉立即倒入5

11、0ml (1.5ml)离心管屮，加入20ml (lml)提取缓冲液，剧烈摇动混匀，60匸水浴保温3060分钟(时间长，dna产量 高)，不时摇动。2. 加入5ml(150ul)5mol/l kac,颠倒混匀冰浴静置20分钟。3. 室温下5000rpm离心20分钟。(二) 植物基因组dna纯化1. 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(衣通风情况卜操作)。待分层后，12000rpm离心5分钟。2. 取上淸液至干净离心管，加等休积氯仿抽提(在通风情况下操作)，12000rpm离心5分钟。3. 仔细移取上淸液至另一 50ml (1.5ml)离心管，加入1倍体积预冷的界内

12、醇，混匀，室温卜放置片刻即岀现絮状dna沉淀。4. 12000ipm离心5分钟，获得沉淀后，用70%酒精洗涤23次，风千沉淀。(三) 植物基因组dna的溶解、检测和保存1. 在 1.5ml eppendorf 中加入 lml(looul) te。dna 很快溶解于 te。2. 加入5|il rnasea(10|ig/gl), 37°c 10分钟，除去rna (rna对dna的操作、分析一燉无影响，可省略该步骤)。3. 取2卩1 dna样品在0.8% agarose胶上电泳,检测dna的分子大小。同时取15gl稀释20倍，测定od260/od280,检测dna含量及质量。五、注意事项1

13、. 所有用甜均需要高温高压，以灭活残余的dna酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用人口滴管或吸头操作，以尽量减少打断dna的可能性。4. 用上述方法提取的dna纯度可以满足一般实验(如southern杂交、pcr等)h的。如 要求更高，可参考冇关资料进行dna纯化。附录1 dna提取史中的重要事件friedrich miescher仃844-1894),瑞士生理学家，有机化学家。1868年医学院毕业后， 在著名的有机化学家iloppe-seyle的实验室以浓细胞为材料，研究淋巴细胞的组成。1869 年，他从浓细胞的细胞核中分离出含有大量磷的“核素”，核素即是dnao这是人类第一次

14、 提取的dna。marmur于1961年建立了用酚和氯仿从生物细胞中分离制备dna的经典方法。但是此法 的条件比较剧烈，还只能得到分子量为5 x 10-5 x 10'道尔顿的dna制品，从六十年代后半 期开始，尤其是蛋白酶k的发现，大大促进了真核生物细胞中分离提取高分子量dna的研究。 在sds和edta的存在下，蛋白酶k仍具有很高的活力，因而可在抑制dna降解酶活力的条 件下用蛋白酶k消化去除蛋白质，为制备高纯度、高分子量的dna制品创造条件。附录2试剂准备1. ste 裂解液：2.5mnacl 4ml, 2m tris-hcl (ph 8.0) 0.5ml, 500mm edta

15、(ph 8.0) 0.2ml,加水定容至loomlo2. 酶解液：200mm nacl, 20mm tris-hcl (ph 7.4)； 50mm edta (ph 8.0), 1.5%sds°3. 蛋白酶k： lomg/ml配好后用一次性滤膜过滤，20°c保存。4 氯仿：异戊醇=24 : 15. tris饱和酚(ph 8.0)酚/氯仿/异戊醇(25： 24： 1)。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与冇机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均冇很强的腐蚀性， 操作时应戴手套。6. 无水乙醇、75%乙醇，灭菌双蒸水ddh2o7. rna 酶 a 母液：将 rn

16、a 酶 溶于 te 配制：10mmol/l tris cl(ph7.5), 15mmol/l nacl 中,配成10mg/ml的溶液，于100°c加热15分钟，使混冇的dna酶失活，贮存于20°c。冷却 后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于20°c。8. te： 10mm tris-hcl(ph 8.0), imm edta(ph 8.0)o9. tae 电泳缓冲液，50x 储存液，ph8.5： 242gtris 碱，57.1ml 冰醋酸，37.2 g na2edta.2h2o,加水至 il； ix 工作液：40mmol/ltriac, 2mmol/l edta10. 混化乙锭(eb)： lomg/ml11. 上样缓冲液(6xloading buffer)： 0.25%漠酚蓝，0.25%二甲苯青 ff, 40% (w/v)蔗糖水溶液，贮存于4°c。12. dna mak