现代生物学课件

1、现代生物学现代生物学传统技术：传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、技术、酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISA）新技术：新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作技术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术用于功能蛋白质筛选的表面展示技术 现代生物学第一节第一节 蛋白质分析鉴定技术蛋白质分析鉴定技术 一

2、、一、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）技术是为满技术是为满足人们对蛋白质的足人们对蛋白质的高通量、大信息量、高通量、大信息量、平行平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的分析研究而产生的。蛋白质芯片的产生将产生将基因组学平台基因组学平台和和蛋白质组学平台蛋白质组学平台很好地连接起来。很好地连接起来。现代生物学 1 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片的概念 蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）也叫也叫蛋白质蛋白质微阵列（微阵列（protein microarray)，是将大量是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，蛋白质有规则地固定到某种介质载

3、体上，利用利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子质与其他小分子之间的相互作用检测分之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片析蛋白质的一种芯片（如图（如图）。）。 图图 典型的蛋白质微阵列芯片典型的蛋白质微阵列芯片现代生物学2 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类 根据用途的不同蛋白质芯片可分：根据用途的不同蛋白质芯片可分： 蛋白检测芯片蛋白检测芯片蛋白功能芯片蛋白功能芯片现代生物学 蛋白检测芯片蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检段抗体、受

4、体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。目标多肽和蛋白等。现代生物学 蛋白功能芯片蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行蛋白蛋白-蛋白、蛋白蛋白、蛋白-多肽、蛋白多肽、蛋白-小分子、蛋白小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白结合以及蛋白-酶反应的研究。酶反应的研究。现代生物学 3 蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备 固相载体的选择和处理蛋白质靶标

5、的处理将蛋白质靶标点在固相载体上蛋白质芯片的封闭现代生物学现代生物学Cavin M等制作出高密度蛋白质微阵列等制作出高密度蛋白质微阵列 现代生物学 4 蛋白质芯片中探针的标记蛋白质芯片中探针的标记 探针类型：探针类型：蛋白质、酶或其它配基蛋白质、酶或其它配基 标记物类型：标记物类型：荧光染料、酶荧光染料、酶，此外还有，此外还有红色红色荧光蛋白（荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白）和绿色荧光蛋白（GFP） 现代生物学 5 蛋白质蛋白质芯片信号的检测及数据处理芯片信号的检测及数据处理 信号检测：信号检测：激光共聚焦激光共聚焦检测检测 、电荷藕合电荷藕合器件（器件（CCD）检测检测 数据处理：数据处理

6、：应用一定的应用一定的计算机软件计算机软件对检对检测中的测中的扫描图扫描图进行处理，形成数据，得进行处理，形成数据，得出结论。出结论。 现代生物学 6蛋白质芯片的特点蛋白质芯片的特点 快速、定量快速、定量分析大量蛋白质；分析大量蛋白质；使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；本即可进行分析和检测； 采用采用光敏染料光敏染料标记，标记，灵敏度高，准确性好；灵敏度高，准确性好；所需试剂少，所需试剂少，可直接应用血清样本，可直接应用血清样本，便于诊断，便于诊断，实用性强，其实用性强，其不足不足在于在于稳定性及操作复杂稳定性及操作复杂等因等

7、因素限制。素限制。 现代生物学 7蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用 （1）基础研究方面的应用）基础研究方面的应用蛋白质蛋白质DNA相互作用研究相互作用研究:用用生物化学表面生物化学表面芯片（芯片（PS20），），以以 DNA 作诱饵，结合特异蛋作诱饵，结合特异蛋白质，用白质，用质谱法质谱法检测，筛查转录因子。检测，筛查转录因子。蛋白质蛋白质-mRNA 相互作用研究相互作用研究:通过通过mRNA 转录转录与与 RNA 结合蛋白质结合蛋白质的内在联系建立了一种高的内在联系建立了一种高通量的方法，用于鉴定在通量的方法，用于鉴定在结构上和功能上结构上和功能上有关有关的的 mRNA 转录。转录。现代生物

8、学（2）临床方面的应用）临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在其是在疾病的诊断和疗效判定疾病的诊断和疗效判定，即，即生物学标志物生物学标志物的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用于和前景。如应用于自身性免疫疾病自身性免疫疾病的诊断的诊断 ，肿肿瘤瘤的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在分子水平分子水平进行进行诊断和预测诊断和预测的，因而它提供了一种更准确的的，因而它提供了一种更准确的方法。方法。 现代生物学（3）新药研制方面的应用）新药研制方面

9、的应用 研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片高通量、并高通量、并行性行性的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达蛋白质的表达就就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到可以确定被检药物对人体是否有毒副

10、作用，或达到多大剂量才会引起毒副作用。多大剂量才会引起毒副作用。现代生物学（4）环境监测及食品工业中的应用）环境监测及食品工业中的应用蛋白质芯片还能运用于蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业环境监测及食品工业中，用中，用来检测环境或食品中来检测环境或食品中微量的有毒化学物质或病原菌微量的有毒化学物质或病原菌，如大肠杆菌。如大肠杆菌。 现代生物学二、二、蛋白指纹图谱技术蛋白指纹图谱技术 蛋白指纹图谱技术蛋白指纹图谱技术也称为表面增强激光解吸电离飞行也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（时间质谱（surface enhanced laser desorption/Ionization time

11、 of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），是一种包含），是一种包含层析与质谱层析与质谱的特殊蛋的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它结合了白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它结合了芯芯片微阵列片微阵列与与质谱技术质谱技术两者的优点，是继基因芯片之后两者的优点，是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。出现的新一代生物芯片技术。现代生物学1 原理原理待分析物（芯片上）不同m/z的离子高能激光质谱图仪器场中飞行电脑处理与基因库中图谱比对发现捕获新蛋白显示蛋白信息现代生物学2 组成组成SELDI-TOF-MS蛋白质芯片飞行质谱仪分析软件现代生物学

12、3 应用应用 结合结合生物信息学的分析方法生物信息学的分析方法从大量的从大量的蛋白质和蛋白质和多肽多肽中筛选出潜在的中筛选出潜在的生物标记物生物标记物，建立，建立高特异高特异性和敏感性的性和敏感性的蛋白质指纹图谱模型。蛋白质指纹图谱模型。 蛋白指纹图谱技术在医学领域的应用，主要用蛋白指纹图谱技术在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是于多种疾病，特别是肿瘤的早期诊断肿瘤的早期诊断。 现代生物学第二节第二节 研究蛋白相互作用技术研究蛋白相互作用技术 一、一、表面等离子体共振技术表面等离子体共振技术 v表面等离子体共振表面等离子体共振技术是一种简单、直接技术是一种简单、直接的的传感技术传感技术，

13、根据这一原理研制的表面等，根据这一原理研制的表面等离子体传感器在检测、分析生物分子间的离子体传感器在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。相互作用等方面得到广泛的应用。 现代生物学1原理原理v表面等离子体共振表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）是表面等离子体在金属和电介质的交界面上）是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层，在电磁波的作用下，表面等离子形成的一电荷层，在电磁波的作用下，表面等离子体发生共振现象。体发生共振现象。 v表面等离子体表面等离子体(SP) 的概念，即是指金属表面沿着金的概念，即是指金属表面沿着金属和介质

14、界面传播的电子疏密波。属和介质界面传播的电子疏密波。v在金属表面在金属表面, 电子横向电子横向(垂直于表面垂直于表面) 运动，受到表面运动，受到表面的阻挡的阻挡,因此在表面上形成了电子浓度的梯度分布，因此在表面上形成了电子浓度的梯度分布，进而引起电子振荡，这种振荡即是电子进而引起电子振荡，这种振荡即是电子疏密波疏密波。 现代生物学 SPR 生物传感器广泛的用于各类生物体系的生物传感器广泛的用于各类生物体系的测定，包括各类测定，包括各类小分子化合物（分子量可小小分子化合物（分子量可小至至100 Da）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至脂分子、病毒和细胞。脂分子、病毒和细胞

15、。 SPR 生物传感器不需要借助任何标记即可用生物传感器不需要借助任何标记即可用于分析于分析蛋白质蛋白质-蛋白质、蛋白质蛋白质、蛋白质-小分子、蛋小分子、蛋白质白质-核酸和蛋白质核酸和蛋白质-脂的相互作用。脂的相互作用。现代生物学2 SPR 仪结构仪结构 在在 1990 年年 BIAcore 公司首先利用公司首先利用 SPR 原理原理制制作了商品化的生物传感器，是作了商品化的生物传感器，是 SPR 生物传感生物传感器的主要生产厂家。器的主要生产厂家。BIAcore 的的 SPR 生物传生物传感器系统核心部分是感器系统核心部分是传感片、传感片、SPR 光学测定光学测定系统和微射流卡盘系统和微射流

16、卡盘（图（图 为常用为常用 SPR 仪实物仪实物图）。图）。现代生物学 传感片传感片是是实时信号实时信号传导的载体，也是该测定系传导的载体，也是该测定系统的心脏。芯片是在统的心脏。芯片是在玻璃片玻璃片上覆盖了一层上覆盖了一层金膜金膜（厚约（厚约 50 nm），），金膜的表面在连接金膜的表面在连接不同的多不同的多聚物聚物以形成不同的表面基质用于固定不同性质以形成不同的表面基质用于固定不同性质的生物分子。的生物分子。 微射流卡盘微射流卡盘是一个液体传送系统，通过软件的是一个液体传送系统，通过软件的控制自动的传送一定体积的样品至传感片表面。控制自动的传送一定体积的样品至传感片表面。必要的话，也可以自

17、动的进行样品的回收。必要的话，也可以自动的进行样品的回收。现代生物学3 SPR 仪的应用仪的应用 抗体抗体/抗原抗原结合动力学结合动力学 抗原表位抗原表位/抗体对位抗体对位的鉴定的鉴定 临床免疫学中应用临床免疫学中应用 SPR 技术进行技术进行免疫诊免疫诊断断 现代生物学二、酵母双杂交技术二、酵母双杂交技术 酵母双杂交技术酵母双杂交技术是一种有效的是一种有效的真核活细真核活细胞胞内研究方法，在内研究方法，在蛋白质相互作用蛋白质相互作用研究研究方面得到了广泛应用并取得了许多有价方面得到了广泛应用并取得了许多有价值的重要发现。值的重要发现。现代生物学1 原理原理 1989 年建立年建立了第一个基于

18、了第一个基于酵母的细胞内酵母的细胞内检测蛋白间相检测蛋白间相互作用的遗传互作用的遗传系统，右图显系统，右图显示了酵母双杂示了酵母双杂交系统原理。交系统原理。 v DNA结合结构域v转录转录激活结构域v活性转录因子ABC现代生物学2 酵母双杂交的组成酵母双杂交的组成 酵母双杂交系统由三个部分组成：酵母双杂交系统由三个部分组成：BD 融合的蛋白表达载体，被其表达的融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称蛋白称诱饵蛋白（诱饵蛋白（bait）；）； AD 融合的蛋白表达载体，被其表达的融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为蛋白称为靶蛋白（靶蛋白（prey）；）；有一个或多个有一个或多个报告基因报告基因的宿

19、主菌株。的宿主菌株。 现代生物学3 应用应用 酵母双杂交技术主要应用在以下几方面：酵母双杂交技术主要应用在以下几方面： 检验检验一对功能已知蛋白一对功能已知蛋白间的相互作用；间的相互作用；研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域；研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域； 用用已知功能的蛋白基因已知功能的蛋白基因筛选双杂交筛选双杂交cDNA 文库，以文库，以研究蛋白质之间研究蛋白质之间相互作用的传递途径；相互作用的传递途径；分析新基因的生物学功能。分析新基因的生物学功能。 现代生物学第三节第三节 表面展示技术表面展示技术 运用运用 DNA 重组技术在重组技术在噬菌体、细菌、真菌、噬菌体、细菌、

20、真菌、病毒病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术术等方面得到了广泛应用。等方面得到了广泛应用。现代生物学概念概念 表面展示技术是利用表面展示技术是利用基因工程基因工程手段将手段将外外源基因源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以以融合蛋白融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。体表面。 现代生物学一、一

21、、噬菌体展示技术噬菌体展示技术 噬菌体展示技术噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。（如右图所示）。1985 年年 Smith 等首次应用了该等首次应用了该技术。技术。 现代生物学 1 原理原理 具体来讲噬菌体展示技术就是将具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选待筛选基因基因插入噬菌体插入噬菌体信号肽序列信号肽序列与与主要衣壳主要衣壳蛋白基因（主要是基因蛋白基因（主要是基因或基因或基因）之之间，构成融合蛋白噬菌体库。

22、表达的间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融融合蛋白合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的响噬菌体的完整性和活性。完整性和活性。 噬菌体展示载体噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图示意图pCANTAB 5E-scFv5243 bpg3 signalsfiIscFvNotIE-tagAmber stopfd gene3M13 oriAp现代生物学利用噬菌体展示技术筛选利用噬菌体展示技术筛选 利用展示的多肽与目标蛋白或肽的亲和结合的性质，可高效率的筛选所需基因。过程如图所示，这样一个吸附-洗涤-洗脱-繁殖的富集过程称为淘洗（panning）。 结合洗涤洗脱扩增 噬菌

23、体展示技术筛选原理现代生物学噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则：通量筛选的方法。其建立基于三个原则：I.在在衣壳蛋白基因衣壳蛋白基因（主要是（主要是基因基因或基因或基因）的的 N 端端插入外源基因，形成的融合蛋白表插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白外源蛋白的天然构象的天然构象，并能被，并能被相应的抗体或受体相应的抗体或受体所所识别识别 。现代生物学v利用固定于利用固定于固相支持物固相支持物的的

24、靶分子靶分子，采用适，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；筛选出目的噬菌体； v外源多肽或蛋白质外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过可通过分泌型噬菌体分泌型噬菌体的的单链单链DNA测序测序推导推导出来。出来。现代生物学 目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有：统有：丝状噬菌体丝状噬菌体展示系统展示系统 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T4 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T7 噬菌体噬菌体展示系统

25、展示系统 其中，其中，T7 噬菌体噬菌体系统可以系统可以高、中、低高、中、低拷贝展拷贝展示示不同分子量的蛋白不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展，是目前最为理想的展示系统。示系统。 现代生物学2 应用应用（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程）噬菌体展示技术与蛋白质工程 将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文库噬菌体多肽文库时，该文库可用于时，该文库可用于特异特异性功能多肽性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体的筛选。同样，利用噬菌体展示展示 cDNA 文库文库，可筛选出特定的，可筛选出特定的蛋白蛋白质

26、或基因质或基因。 现代生物学（2）噬菌体展示技术与抗体工程）噬菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使噬菌体展示技术的出现使抗体工程抗体工程进入进入第三次革命第三次革命。噬菌体展示技术的成功应。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。的抗体。现代生物学 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗表达于噬菌体颗粒的表面，就

27、形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。）。现代生物学3 噬菌体展示技术的局限性噬菌体展示技术的局限性 (1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的过程，这就大大限制了所建库的容量容量和分子和分子的多样性。的

28、多样性。 (2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。外加选择压力。 现代生物学(3) 噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。遗传的多样性。(4) 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物达

29、，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。毒素分子，很难得到有效表达和展示。现代生物学二、二、核糖体展示技术与核糖体展示技术与 mRNA mRNA 展示技术展示技术 核糖体展示（核糖体展示（Ribosome display）技术与）技术与 mRNA 展示技术由于在展示技术由于在体外无细胞翻译体系体外无细胞翻译体系中进行，用中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量的限制。它大大提高了文库容量和筛选通量（10121014），而且能够增加

30、表达的蛋白质），而且能够增加表达的蛋白质溶解度。溶解度。现代生物学核糖体展示技术的基本原理核糖体展示技术的基本原理 核糖体展示技术的基本原理是通过核糖体展示技术的基本原理是通过PCR扩增扩增目的基因目的基因的的 DNA 文库文库，同时加入，同时加入启动子、核糖体结合位点及启动子、核糖体结合位点及茎环茎环，并置于具有偶联转录，并置于具有偶联转录-翻译的无细胞翻译系统中翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，并孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，并形成形成“mRNA-蛋白质蛋白质-核糖体核糖体”三元复合体，最后利三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化

31、的靶分子直接用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用用 RT-PCR 扩增扩增，进行下一循环的，进行下一循环的富集和选择富集和选择，最终，最终筛选出筛选出高亲和力的目标分子高亲和力的目标分子（如图所示）。（如图所示）。 核糖体展示原理示意图 现代生物学核糖体展示的过程核糖体展示的过程 解离 5随机DNA文库体外转录 5体外翻译复合体形成 5筛选 5现代生物学mRNA 展示技术的原理展示技术的原理 mRNA 展示技术展示技术也是以也是以 mRNA 和多肽复合体和多肽复合体作为筛选的基本单元。其与核

32、糖体展示的区别作为筛选的基本单元。其与核糖体展示的区别在于，复合体中在于，复合体中 mRNA 与与蛋白质蛋白质通过一个小通过一个小分子共价连接，如分子共价连接，如嘌呤霉素嘌呤霉素（如图所示），且（如图所示），且该复合体的产生完全在体外，因此很容易构建该复合体的产生完全在体外，因此很容易构建大型突变文库大型突变文库（含（含10121013 个独立序列）。个独立序列）。 mRNA 展示技术原理示意图展示技术原理示意图 现代生物学三、细菌表面展示技术三、细菌表面展示技术 细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪（筛选仪（Fluorescence Activated

33、Cell Sorting，FACS）或流式细胞筛选仪）或流式细胞筛选仪（flow cytometry）是非常有效的高通量）是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。每个克隆的功能特性。 现代生物学原理原理 细菌表面细菌表面有许多能显示有许多能显示保留单一性状保留单一性状在细胞表在细胞表面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个

34、非常有价值的特性，同时也是定量质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。酶催化活性的方法。 现代生物学 流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下几个明显的优点：几个明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。且对每个观察到的克隆进行记录。 与噬菌体相比，细菌展示系统在疫苗应用上与噬菌体相比，细菌展示系统在疫苗应用

35、上有许多独特的优势。有许多独特的优势。 与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧光激活细胞分选技术（光激活细胞分选技术（FACS）进行更快速更）进行更快速更高效筛选高效筛选 。现代生物学微生物表面展示文库微生物表面展示文库FACSFACS筛选原理示意图筛选原理示意图 现代生物学FACS 具有以下特色具有以下特色： 高富集比。高富集比。通常认为通常认为FACS筛选每轮的富集比筛选每轮的富集比为为 103105，而常规的生物淘选每轮的富集比，而常规的生物淘选每轮的富集比仅为仅为 200500； 高阳性率。高阳性率。Franscisco 等在等在 1993 年的研

36、究表年的研究表示，经过两轮筛选阳性率示，经过两轮筛选阳性率高达高达 95% 以上以上，这，这是常规生物淘选所无法想像的。是常规生物淘选所无法想像的。 由于反应在由于反应在溶液状态溶液状态下进行，可克服常规生物下进行，可克服常规生物淘选过程中由于筛选配基固定化而导致的淘选过程中由于筛选配基固定化而导致的“亲亲和效应和效应”。现代生物学目前已有的多种细菌表面展示系统目前已有的多种细菌表面展示系统 细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛鞭毛、菌毛 晶核蛋白（晶核蛋白（Icenucleation protein，INP）、自体转）、自体转运蛋

37、白（运蛋白（Autotrans-porter）、）、S2 层蛋白层蛋白 枯草杆菌的芽胞外膜，枯草杆菌的芽胞外膜，L2 型大肠杆菌和变形型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜杆菌的细胞膜 现代生物学四、酵母表面展示技术四、酵母表面展示技术 酵母表面展示系统酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起是继噬菌体展示技术创立后发展起来的来的真核展示系统真核展示系统。酵母的。酵母的蛋白质折叠和分泌机制蛋白质折叠和分泌机制与与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。酵母细胞具优越性。酵母细胞颗粒大颗粒大，可用流式细胞仪进行，可用流式细胞仪进行筛筛选和

38、分离选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以。目前报道的两种酵母展示系统分别以 或或 a 凝集素凝集素作为融合骨架。作为融合骨架。现代生物学1 目的蛋白目的蛋白-凝集素表面展示系统凝集素表面展示系统 此系统将此系统将目的蛋白作为目的蛋白作为 N 端端，与，与凝集素凝集素 C 端端部分融合，部分融合，目的蛋白经目的蛋白经凝集素展示于酵母细胞表面。凝集素展示于酵母细胞表面。凝集素凝集素共价共价连接连接到到细胞壁的葡聚糖细胞壁的葡聚糖上，其锚定能力由蛋白质上，其锚定能力由蛋白质 C 端端 320 个氨基酸个氨基酸决定，富含决定，富含 Ser/Thr 残基残基。Ser/Thr 富集富集区区因广泛存在

39、的因广泛存在的O2糖基化糖基化而拥有一个杆状构象，可作为空而拥有一个杆状构象，可作为空间支撑物发挥作用。间支撑物发挥作用。现代生物学 迄今，已经有多个应用迄今，已经有多个应用凝集素的凝集素的 C 端作为端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是异源蛋白是-半乳糖苷酶（如图半乳糖苷酶（如图 ）。）。现代生物学2 a凝集素凝集素-目的蛋白表面展示系统目的蛋白表面展示系统 这是一种将这是一种将目的蛋白作为目的蛋白作为 C 端端与与a 凝集凝集素素 Aga2p 亚基的亚基的 N 端端融合的表面展示系融合的表面展示系统。统。a 凝集素通过与凝集素通过与

40、凝集素相似的连接凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与锚定在细胞壁上。与凝集素不同，凝集素不同，a 凝凝集素由集素由两个亚单位的糖蛋白两个亚单位的糖蛋白组成。组成。现代生物学a-凝集素的组成凝集素的组成 a-凝集素由凝集素由核心亚单位（核心亚单位（Aga1p）和和结结合亚单位（合亚单位（Aga2p）两个亚单位组成，两个亚单位组成，Aga1p共共 725 个氨基酸，合成后被个氨基酸，合成后被分泌分泌到胞外到胞外，与酵母细胞壁的，与酵母细胞壁的 葡聚糖葡聚糖共共价连接。价连接。Aga2p 共共 69 个氨基酸，合成后个氨基酸，合成后也被也被分泌到胞外分泌到胞外，但其通过，但其通过 2 个二硫键个二硫键

41、与与 Aga1p 结合，仍与酵母细胞相连。结合，仍与酵母细胞相连。现代生物学 Aga2p 的的 N 端端部分参与部分参与二硫键的形成，二硫键的形成，外源蛋外源蛋白白通过与通过与 Aga2p 的的 C 末端末端融合可展示于酵母融合可展示于酵母细胞表面（如图细胞表面（如图 ）。）。现代生物学酵母表面展示技术的应用酵母表面展示技术的应用v蛋白质的定向进化：蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用酵母表面展示系统用于蛋白质于蛋白质亲和力亲和力和和稳定性稳定性的定向进化已有的定向进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。v活的口服疫苗：活的口服疫苗：在细胞表面表达的

42、蛋白质在细胞表面表达的蛋白质易于接近易于接近抗体抗体，因此，可被，因此，可被免疫系统免疫系统识别，识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有具有免疫原性免疫原性。因而可通过在酵母表面表。因而可通过在酵母表面表达达异质性的抗原蛋白异质性的抗原蛋白来发展疫苗。来发展疫苗。现代生物学第四节第四节 其他新蛋白质工程技术其他新蛋白质工程技术 目前新兴的蛋白质工程技术原子力显微镜技术蛋白质打靶技术蛋白质分子印迹技术蛋白质截短技术蛋白质错误折叠循环扩增技术现代生物学一、原子力显微镜技术一、原子力显微镜技术 原子力显微镜（原子力显微镜（atomic force micr

43、oscope，AFM）由由 G. Binnig 等于等于 1986 年发明，是扫年发明，是扫描探针显微镜家族的主要成员，其描探针显微镜家族的主要成员，其横向分辨率横向分辨率为为 23 nm，纵向分辨率为纵向分辨率为 0.5 nm。它可以在。它可以在接近生理环境的接近生理环境的大气或液体大气或液体条件下成像，获得条件下成像，获得直观的三维表面信息，还可以对原子和分子进直观的三维表面信息，还可以对原子和分子进行纳米级操纵，因此在生物结构的研究中具有行纳米级操纵，因此在生物结构的研究中具有独特的优势。独特的优势。 现代生物学原子力显微镜系统结构原子力显微镜系统结构现代生物学1 原理原理 AFM 的基

44、本原理是通的基本原理是通过控制并检测样品过控制并检测样品针针尖间的相互作用力尖间的相互作用力来分来分析研究样品的析研究样品的表面性质表面性质的。其工作原理如图所的。其工作原理如图所示。示。 现代生物学 2 应用应用 采用采用AFM 研究了白蛋白、血红蛋白、胰岛素及分研究了白蛋白、血红蛋白、胰岛素及分子马达和噬菌调理素等吸附在不同固体界面上的行子马达和噬菌调理素等吸附在不同固体界面上的行为。为。 用于蛋白单分子结构与功能研究。用于蛋白单分子结构与功能研究。 AFM 可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生理活动等。如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、理活动等。

45、如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、抗原抗体识别等。抗原抗体识别等。 对一些生理过程，从形态学角度进行了证实对一些生理过程，从形态学角度进行了证实。现代生物学 3目前存在的问题目前存在的问题v目前，利用目前，利用 AFM 研究的蛋白种类还研究的蛋白种类还很少，能检测到的蛋白性质的参数数很少，能检测到的蛋白性质的参数数量也是十分有限，亟需进一步扩展量也是十分有限，亟需进一步扩展 AFM 在蛋白研究中的应用范围，增在蛋白研究中的应用范围，增强仪器应用的功能性。强仪器应用的功能性。 现代生物学v由于由于 AFM 在机械设计上的限制，单在机械设计上的限制，单分子高分辨拓扑结构的记录时间比大分子高分辨拓

46、扑结构的记录时间比大多数生物过程发生的时间相比长得多，多数生物过程发生的时间相比长得多，提高扫描速度是对扫描器的设计工艺提高扫描速度是对扫描器的设计工艺乃至材料科学的发展提出了巨大的挑乃至材料科学的发展提出了巨大的挑战战 现代生物学v现有现有 AFM 探针的设计具有明显的物探针的设计具有明显的物理局限性，由于理局限性，由于 AFM 分辨率和功能分辨率和功能与探针性能的密切相关性，因而探针与探针性能的密切相关性，因而探针的改造工艺的提高也是亟待解决的关的改造工艺的提高也是亟待解决的关键问题键问题 现代生物学 4解决的途径解决的途径 受材料和制造工艺的水平的限制，将突破点更受材料和制造工艺的水平的

47、限制，将突破点更多地寄托于引入新的设计思想和测量理念，多多地寄托于引入新的设计思想和测量理念，多种高新仪器与技术的联用可能是解决该问题最种高新仪器与技术的联用可能是解决该问题最有希望的方案之一。这些技术包括单分子荧光有希望的方案之一。这些技术包括单分子荧光共振能量转移技术共振能量转移技术 、激光光镊技术等。、激光光镊技术等。 现代生物学二、二、 蛋白质打靶技术蛋白质打靶技术 蛋白质打靶蛋白质打靶是最近几年发展起来的一种是最近几年发展起来的一种研究蛋白质功能的新方法。由于其高度研究蛋白质功能的新方法。由于其高度的的特异性特异性和和可控性可控性，正越来越广泛地应，正越来越广泛地应用于用于神经功能神

48、经功能的研究中。的研究中。 现代生物学原理原理 它采用了一种被称为它采用了一种被称为免疫外源凝集素免疫外源凝集素的的新工具：这是一种通过新工具：这是一种通过 DNA 重组技术重组技术而获得的而获得的 IgG的的Fc 片段片段和和目标受体胞外目标受体胞外域域的的融合蛋白融合蛋白。这使其保持了。这使其保持了天然的与天然的与配体结合的特异性配体结合的特异性和和亲和力亲和力，正是通过，正是通过这种结合而发挥影响受体功能的作用。这种结合而发挥影响受体功能的作用。 现代生物学免疫外源凝集素具有以下特点：免疫外源凝集素具有以下特点： vFc 区大大增加了其稳定性，并易于用区大大增加了其稳定性，并易于用免疫组

49、化的方法予以定位；免疫组化的方法予以定位；v不能通过血脑屏障，但可注入特定脑不能通过血脑屏障，但可注入特定脑区，在局部发挥作用；区，在局部发挥作用；现代生物学v它的释放是可调控的；它的释放是可调控的；v不仅能削弱也能增强受体的功能是其不仅能削弱也能增强受体的功能是其突出特点，其增强受体功能的原理为突出特点，其增强受体功能的原理为通过处理，配体通过处理，配体-免疫凝集素能与配体免疫凝集素能与配体一样甚至更强地激活受体。一样甚至更强地激活受体。 现代生物学免疫外源凝集素也有其限制：免疫外源凝集素也有其限制： 它不能与细胞内的蛋白相作用，所以它它不能与细胞内的蛋白相作用，所以它的应用仅限为受体。的应

50、用仅限为受体。现代生物学与其他体内分子控制方法相比，蛋与其他体内分子控制方法相比，蛋白打靶的优点有：白打靶的优点有： 与基因打靶仅限于在鼠体应用不同，蛋与基因打靶仅限于在鼠体应用不同，蛋白打靶原则上可用于任何物种；白打靶原则上可用于任何物种； 与单克隆抗体相比，其在改变靶目标功与单克隆抗体相比，其在改变靶目标功能方面是高效的；能方面是高效的； 免疫外源凝集素是高度稳定的蛋白，不免疫外源凝集素是高度稳定的蛋白，不像反义核苷酸易被降解，经典的药理学像反义核苷酸易被降解，经典的药理学研究缺少蛋白打靶高度的特异性。研究缺少蛋白打靶高度的特异性。 现代生物学三、蛋白质分子印迹技术三、蛋白质分子印迹技术

51、分子印迹技术（分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）是模拟自然界所存是模拟自然界所存在的在的分子识别作用分子识别作用，如，如酶与底物、抗体酶与底物、抗体与抗原与抗原等，以目标分子为模板合成具有等，以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的特殊分子识别功能的分子印迹聚合物分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）的一种技术。的一种技术。 现代生物学分子印迹技术的发展历程分子印迹技术的发展历程 1949 年年 Dickey 首次实现了染料在硅胶首次实现了染料在硅胶上的印迹，提出了上的印迹，提出了“专一性吸附专

52、一性吸附”的概的概念，这一概念可视为念，这一概念可视为“分子印迹分子印迹”的萌的萌芽芽。 1973 年年 Wulff G 研究小组对分子印迹聚研究小组对分子印迹聚合物的成功制备使该研究取得了突破性合物的成功制备使该研究取得了突破性进展，并广泛应用于进展，并广泛应用于色谱分离、抗体或色谱分离、抗体或受体模拟、生物传感器以及酶的模拟和受体模拟、生物传感器以及酶的模拟和催化催化等诸多领域。等诸多领域。现代生物学 随着随着 Mosbach 和和 Whitcombe 等在等在共价、非共价、非共价和共价共价和共价-非共价非共价混合型分子印迹聚合物制混合型分子印迹聚合物制备技术方面的创新性工作，分子印迹技术

53、得备技术方面的创新性工作，分子印迹技术得到了广泛研究和迅猛发展。到了广泛研究和迅猛发展。 1997 年还成立了年还成立了国际分子印迹协会（国际分子印迹协会（Society for Molecular Imprinting，SMI）。）。现代生物学分子印迹机理主要有共价法和非共价法两分子印迹机理主要有共价法和非共价法两种，下图为非共价法种，下图为非共价法过程示意。过程示意。现代生物学分子印迹技术的核心是制备分子印迹分子印迹技术的核心是制备分子印迹聚合物，其制备原理为：聚合物，其制备原理为： v在合成高分子前，将待分离在合成高分子前，将待分离物质（即印迹分子、模板分物质（即印迹分子、模板分子）加入

54、能与之发生分子间子）加入能与之发生分子间作用的功能单体中，形成复作用的功能单体中，形成复合物；合物；v然后通过加入交联剂、引发然后通过加入交联剂、引发聚合反应，形成高度交联的聚合反应，形成高度交联的固态高分子，把这种作用固固态高分子，把这种作用固定下来；定下来；v接着利用化学或物理方法将接着利用化学或物理方法将印迹分子从高分子中移去。印迹分子从高分子中移去。 现代生物学1蛋白质印迹聚合物的聚合方法蛋白质印迹聚合物的聚合方法 蛋白质印迹聚合物的聚合方法主要有蛋白质印迹聚合物的聚合方法主要有包包埋法、表面印迹法埋法、表面印迹法和和抗原决定基法抗原决定基法。 现代生物学包埋法包埋法 将蛋白质分子、功

55、能单体、交联剂和引发剂通将蛋白质分子、功能单体、交联剂和引发剂通过光引发或热引发制成块状聚合物，经粉碎、过光引发或热引发制成块状聚合物，经粉碎、过筛得到细小颗粒，该法操作条件易于控制，过筛得到细小颗粒，该法操作条件易于控制，而且对蛋白质分子有良好的识别能力。而且对蛋白质分子有良好的识别能力。 现代生物学表面印迹法表面印迹法 该法的识别位点处于颗粒的表面，通常在微球该法的识别位点处于颗粒的表面，通常在微球表面进行键合作用，颗粒均匀，易洗脱并可提表面进行键合作用，颗粒均匀，易洗脱并可提高吸附性能在色谱操作或制备生物芯片方面有高吸附性能在色谱操作或制备生物芯片方面有良好的应用前景。良好的应用前景。

56、现代生物学抗原决定基法抗原决定基法 近年来新研究的抗原决定基法是基于多肽或蛋白序列近年来新研究的抗原决定基法是基于多肽或蛋白序列中裸露的特异性短肽片段为模板分子，所合成的中裸露的特异性短肽片段为模板分子，所合成的 MIP 能有效识别多肽和整个蛋白质分子。该方法将印迹大能有效识别多肽和整个蛋白质分子。该方法将印迹大分子蛋白简化为印迹小分子，降低了实验难度分子蛋白简化为印迹小分子，降低了实验难度.抗原抗原决定基法的关键在于对蛋白质三级结构的掌握和特异决定基法的关键在于对蛋白质三级结构的掌握和特异性短肽片段的选取。性短肽片段的选取。 现代生物学目前蛋白质印迹技术仍存在的目前蛋白质印迹技术仍存在的问题问题 首先，蛋白质分子印迹过程和识别过程的机理首先，蛋白质分子印迹过程和识别过程的机理是亟待解决的问题。是亟待解决的问题。 其次，目前使用的功能单体、交联剂和聚合方其次，目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性，尤其是没有令人满意的法都有较大的局限性，尤其是没有令