crane基因工程的基本操作程序学习教案

1、会计学1crane基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序( (四个步骤四个步骤) )第1页/共21页 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第2页/共21页一、目的基因的获取一、目的基因的获取n通过通过DNADNA合成仪用化学方法直合成仪用化学方法直接人工合成接人工合成编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因第3页/共21页基因文库基因文库基因组文库（全部基因组文库（全部）部分部分基因文库（如基因文库（如:cDNA:cDNA文库）文库）1. 1.基因文库基因文库 将含有某种生物将含有某种生物不不同基因的许多同基因的许多DNADNA片断，导

2、入片断，导入到到受体菌的群体受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库的不同基因，称为基因文库（一）从基因文库中获得目的基因（一）从基因文库中获得目的基因第4页/共21页 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片片段段DNADNA复制复制一

3、段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶( (热稳定热稳定DNADNA聚合酶即聚合酶即TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第5页/共21页第6页/共21页（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第7页/共21页基因基因_，核苷酸，核苷酸序列序列_ _ 。较较小小已知已知第8页/共21页1. 1.用一定的用一定的_切割质粒切割质粒，使其出现一个切

4、口，露出，使其出现一个切口，露出_。2.2.用用_切断目的切断目的基因，使其产生基因，使其产生_。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再处，再加入适量加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分分子（重组质粒）子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶切口切口DNADNA连接酶连接酶相同的黏性末端相同的黏性末端二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第9页/共21页质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA基因表达载体的构建基因表达载体的构建第10页/共21页质粒质粒DNADNA分子分子限制

5、酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第11页/共21页5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第12页/共21页基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子启动子：一

6、段有特殊结构的：一段有特殊结构的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的首端，是是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位。终止子终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNADNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。从而将含有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第13页/共21页转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植

7、物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法（双基因枪法（双）花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞第14页/共21页1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法（双、裸）农杆菌转化法（双、裸）第15页

8、/共21页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1 1）常用大肠杆菌：）常用大肠杆菌： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少（2 2）大肠杆菌的转化方法）大肠杆菌的转化方法 首先用首先用CaCa2+2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分子的生理状态，这种细胞称为分子的生理状态，这种细胞称为感受态感受态细胞。第细胞。第二步是将重组表达载体二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于分子溶于缓冲液缓冲液中与感受态中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收细胞混合，在一定的温度

9、下促进感受态细胞吸收DNADNA分分子，完成转化过程。子，完成转化过程。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞显微注射法显微注射法第16页/共21页检测检测鉴定：鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定第17页/共21页DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单链分子的单链放放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互