分子生态学（课堂PPT）

1、1u 分子生态学分子生态学产生与发展、理论基础、研究方法、研究实例。产生与发展、理论基础、研究方法、研究实例。u 遗传多样性遗传多样性含义，影响因素、检测方法，研究意义。含义，影响因素、检测方法，研究意义。u 研究实例研究实例 景观破碎化对千岛湖黄连木复合种群遗传多样性及空间遗传结景观破碎化对千岛湖黄连木复合种群遗传多样性及空间遗传结构的影响。构的影响。（微卫星引物开发及筛选、分子标记（微卫星引物开发及筛选、分子标记RAPD 鉴定植物性别）鉴定植物性别）2分子生态学概述分子生态学概述（Molecular Ecology）3 一、分子生态学的产生与发展 二、分子生态学的理论基础 三、分子生态学的

2、研究方法 四、分子生态学的研究实例及展望目目 录录4 生态系统生态系统以核酸分子和其他生物活性分子为基础的分子生态系统以细胞为基础的微生态学统以个体为基础的宏观生态系统一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展5 分子生态学是用DNA和蛋白质的特征, 研究物种的进化、演化及种群生物学。分子生态学是生态学和种群生态学的交叉, 它主要利用分子生物学的方法研究自然, 人工种群与其环境的关系以及转基因生物(或其产物释放) 所带来的一系列潜在的生态学问题。uHoelzel 和Dover (1991) Molecular genetic ecologyu1992 年创刊的“ Molecular

3、ecology ”的定义:分子生态学的概念一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展6分子生态学是用线粒体DNA (mtDNA ) 的变化来帮助和指导种群动态的研究。uMoritz (1994) Applications of mitochondrial DNA analysis in conservation: A critical review ：分子生态学是用分子生物学手段研究生态和种群生物学的新兴交叉学科。uBachmann(1994) Molecular markers in plant ecology ：一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展u 向近敏等(1

4、996) 分子生态学M：分子生态学是研究细胞内的生物活性分子特别是核酸分子与其分子环境关系的学科。分子生态学的概念7生态学的微观研究层次与领域，它利用分子生物学原理、方法和技术，来研究生命系统与环境系统相互作用的机理及其分子机制的科学，从分子水平探讨生物与环境的关系。分子生态学的概念一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展目前较为一致的看法目前较为一致的看法:协调适应的分子机理 生物形态 遗传 生理生殖 进化8 10-9 10-6 10-3 1 103 106 109 Scale (m) 生理学细胞学分子生物学 生态学 分 子 生 态 学 尺 度 与 学 科 的 关 系 示 意 图

5、一、一、 分子生态学的产生与发展分子生态学的产生与发展分子生态学与其他学科的交叉9l 系统分类学：物种的鉴定；蛋白质和核酸的序列变化可以在任何生物类群之间进行比较。l 进化生物学：自然选择、中性学说、遗传漂变l 生态遗传学：基因型、表型、表型可塑性l 行为生态学：个体之间亲缘关系、合作关系一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展分子生态学与其他学科的交叉10分子生物学群体遗传学行为生物学进化生物学古地学/古气候学保护生物学分子进化系统发生学数学生物地理学生态学古生物学分子生态学分子生态学与其他学科的交叉一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生与发展11uHarris首次首次把

6、同工酶分析把同工酶分析用于人类。用于人类。Richardson等等出版了出版了“等位等位酶电泳酶电泳-动物系动物系统学和种群研统学和种群研究手册究手册”，形，形成分子生态学成分子生态学的雏形。的雏形。1966年u Higuchi等利等利用博物馆所存的用博物馆所存的现已灭绝的斑驴现已灭绝的斑驴皮提取皮提取mt DNA片断的序列，并片断的序列，并把这一序列与现把这一序列与现有种比较发现，有种比较发现，斑驴和平原斑马斑驴和平原斑马具有较近的亲缘具有较近的亲缘关系。这标志着关系。这标志着一个新研究领域一个新研究领域的开始。的开始。1963年u M. Nass和和S. Nass发现了发现了mt DNA，

7、使探讨，使探讨生物进化和生态生物进化和生态学等领域的一些学等领域的一些问题成为可能。问题成为可能。1984年uAvise, Lansman 等人等人第一次把第一次把mt DNA的分析方法的分析方法应用到自然种群应用到自然种群的研究，被看作的研究，被看作是分子生态学的是分子生态学的首次工作首次工作。1976年u“Molecular ecology”杂志杂志在英国创刊，在英国创刊，标志着分子生标志着分子生态学已成为生态学已成为生态学的一个新态学的一个新的分支学科。的分支学科。从此，分子生从此，分子生态学进入了快态学进入了快速发展期。速发展期。1992年一、分子生态学的产生与发展一、分子生态学的产生

8、与发展分子生态学的发展12 一、分子生态学的产生与发展 二、分子生态学的理论基础 三、分子生态学的研究方法 四、分子生态学的研究实例及展望目目 录录13二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础u理论核心：分子水平上的绝大多数突变是选择上中性的，因而他们在进化中的命运是随机漂变的，而不是由自然选择决定的。u中性理论对种内遗传变异的解释：分子水平上的绝大部分种内遗传变异（即遗传多态现象）是选择上中型的，突变速率和遗传漂变速率决定遗传多态性的变化速率。u中性突变与自然选择的辨证统一：少量突变的非中性。u中性理论在分子生态中的应用：排除假设的基础。种群遗传进化：选择、突变、随机遗传漂变、迁移

9、、自然灾害、社会结构等。1 1、分子进化的中性理论（、分子进化的中性理论（Neutral TheoryNeutral Theory）14中性理论下的中性标记并非真的中性中性理论下的中性标记并非真的中性u 搭乘效应（hitch-hiking）中性标记位点在物理距离上与一个受选择的基因相邻（在同一染色体上），以至于它们之间很少重组，中性标记位点等位基因就与那些基因共分离而表现出受选择的作用。u 等位酶有些酶会在外界诱导下选择性的表达，有些并非中性，生活在不同环境下的野生种群中显示出明显的选择性。u 核DNA标记选择作用会对包括RAPD、AFLP和微卫星位点或与他们连锁的基因在内的一些分子标记产生影

10、响。1 1、分子进化的中性理论（、分子进化的中性理论（Neutral TheoryNeutral Theory）二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础15二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础2 2、哈迪、哈迪- -温伯格法则温伯格法则 （Hardy-Weinberg principle ）u 内涵：在满足下列假设的条件下，生物种群的等位基因频率和基因型频率世代间保持不变。（1）有性繁殖并随机交配；（2）等位基因在雌雄两性中随机交配；（3）种群足够大；（4）世代不重叠；（5）没有自然选择、突变和迁移。u 分子生态意义：作为基本判别假设和理论基础（遗传标记方法）16二、二

11、、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础3 3、种群分化是生物进化的必要途径、种群分化是生物进化的必要途径(1).种群分化的结果： 新种形成；种群的杂合度降低。(2).Wrights F统计方法， F近似地代表等位基因被固定的可能性，又称固定系数。 近交系数 FIS是指在某个基因位点上，一个个体从上代得到两个等同的等位基因的概率，其变化范围在-1和+1之间变动。FIS0或FIS0，说明该位点存在纯合子或杂合子过多的情况；FIS=0表明等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡，该种群在该位点上是随机交配的。17二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础4 4、 随机遗传漂变是

12、种群进化的重要动力随机遗传漂变是种群进化的重要动力随机遗传漂变是指在一个有限群体内等位基因等位基因或单倍型频率单倍型频率从一代到下一代的随机改变。这种变动变化导致某些等位基因的消失，另外一些等位基因的固定，进而改变群体的遗传结构。u 小种群中发生遗传漂变的频率比大种群中要大。u 一个等位基因被固定的概率等于其此时在种群中的频率， 所以稀有基因更易被淘汰。从而降低种群的遗传多样性。u 在metapopulation中，局部种群越小其遗传多样性丧失的 越快，局部种群间的遗传分化就越大。u 对所有中性等位基因的作用一致，因此，在没有其它进化动力的条件下，不同的中性位点揭示的进化（演化）规律应相同。1

13、85 5、联种群（集合种群）的遗传学、联种群（集合种群）的遗传学 复合种群复合种群(Metapopulation )占据不同生境板块的亚种群，并且经受间歇性局部地区的消亡及从其他同类群再度移入重建时就会产生联种群。二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础(a) 经典的联种群模型(b) 大陆岛屿模型图2.5.1 联种群模型196 6、基因流与迁移率、基因流与迁移率u实质：基因流（Nm） 指亚种群间每个时代迁移并在迁移后成功繁殖的个体数量。亚种群间基因通过生物个体或它们的配子体进行的迁移，其趋向于阻止亚种群之间产生遗传上的差异 。u遗传估算：基于F统计 ：Nm=1/4 (1/Fst1)遗

14、传分化系数Fst ：表示随机选取的每个种群中两个配子间相互关系程度，该指标被广泛用于定量亚种群间的遗传分化程度。二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础20u 距离隔离先估亚种群对之间的Fst值和基因流，再寻找距离造成的隔离作用。区别现时基因流和近期历史上可能的分隔。美国和墨西哥西南部耧斗菜属（Aquilegia）种群间是否有任何基因流的存在。u 迁移率的估算最大似然法应用时应注意从更多位点获取信息样（本量足够大），尽可能与直接进行测量的生态学方法（标记重补或放射示踪法）进行对比。二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础6 6、基因流与迁移率、基因流与迁移率21u定义定义一

15、个种群中能将其基因连续传递到下一代的个体平均数。实际上相当于理想状态下（种群大小的稳定，世代之间没有重叠，所有个人以相同的概率给下一代贡献配子）种群的大小。 u影响因素：参与生殖个体性别的比例相差很大；参与生殖个体贡献个下一代的配子数有差异；种群中个体数在短期内呈周期性变化；不同世代之间有重叠；一个物种有多个遗传相对隔离的亚种群构成 。7 7、有效种群大小（、有效种群大小（NeNe）二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础22u估算方法: 计算种群世代间等位基因频率的即时变化（不同世代，样品数量，多态位点数量） 有效成体繁殖数目（Nb）可用于估算Ne （非离散世代） 基于重复取样的最

16、大似然法（被广泛应用） 从杂合性的预期关系上估算Ne （适合对整个物种的全部进化时间上的探讨）7 7、有效种群大小（、有效种群大小（NeNe）二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础23u 定义：有效种群大小明显下降，这种减少有可能是暂时的，也可能是长久的。u 危害：增加有害等位基因的随机固定。瓶颈作用的持续时间越长，造成的等位基因丢失则会越多。u 遗传检测：基于瓶颈效应期间的相对于等位基因多样性的杂合度瓦解。（具体分子标记的数量、种类、平均杂合度以及瓶颈效应前后Ne的比值）。8 8、种群瓶颈（效应）、种群瓶颈（效应）二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础24溯祖过程演化

17、分支过程假定种群在个世代保持数目恒定，即每个等位基因有N个拷贝，则种群中任一对基因a在t时代以前的概率为： p=(1-1/N)t-1/N 单倍体朔祖时间N ，二倍体为 2N二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础9 9、溯祖理论、溯祖理论定义：追溯共同祖先的后代系谱进化特征、动态变化过程和样本特性的群体遗传学理论。25二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础1010、分子系统发生分析、分子系统发生分析定义：从生物大分子的信息确定不同生物在进化过程中的地位、分歧时间以及亲缘关系，建立分子系统树，从而推断生物的进化历史。 分子系统发生（异中求同）分析的基本原则：（1）分子标记的

18、中性原则；（2）进化速率恒定原则，符合“分子钟”假设；（3）分子标记在研究类群中直向同源：（4）分子标记具有适当的遗传变异度。26二、二、 分子生态学的理论基础分子生态学的理论基础1010、分子系统发生分析、分子系统发生分析分子系统发生（异中求同）分析的基本方法：（1）距离法：依据每对单元间的进化距离建立进化树。（2）最大简约法：对于分子数据，该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。（3）最大似然法： 对观察数据符合每种拓扑结构的可能性进行最大化计算，可能性最大的拓扑结构被选为终解进化树。（4）贝斯法：检验观测数据与理论假设的偏离是否大到否定假设的程度，或

19、者现有数据是否足以支持作出有关结论。27 一、分子生态学的产生与发展 二、分子生态学的理论基础 三、分子生态学的研究方法 四、分子生态学的研究实例及展望目目 录录28三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法1 1、基于蛋白质的方法、基于蛋白质的方法u 同工酶技术同工酶技术催化同一种反应而结构不同的一簇酶称为同工酶，如果是等位基因决定的同工酶,又称等位酶。图3.1.1 蛋白质的提取及电泳分析29三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法1 1、基于蛋白质的方法、基于蛋白质的方法由于同工酶的分子量和电荷有差异，可以利用凝胶电泳技术将其分开,通过染色和扫描，利用计算机分析软件进行差

20、异分析。可以根据酶带的变化判断种群内不同个体间基因位点及等位基因的变异性，也可以比较不同种群间遗传变异的差别。u 同工酶技术的原理同工酶技术的原理图3.1.3 酯酶同工酶扫描图谱图3.1.2 同工酶电泳结果图30三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法1 1、基于蛋白质的方法、基于蛋白质的方法（1）因为同工酶是基因表达的产物，受到生物在发育过程中基因表达的时序控制，所以同一生物在不同发育期可能表现出不同的同工酶酶谱，同种酶在同一动物不同组织内的表达也可能不同，因此在研究中要特别强调所取样本的一致性。（2）只能反映一小部分功能基因(外显子)的情况，而对大部分功能基因和大量非功能基因无法

21、表现，在比较种群内或种群间遗传变异时往往多态性较低。u 同工酶技术的局限性同工酶技术的局限性31三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法2 2、基于、基于DNADNA的方法的方法限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)(RFLP)总核DNA内切酶解酶解DNA片段硝酸纤维素或尼龙膜电泳分离后转移专一序列的标记DNA探针自显影显色或发光显示群内和种群间的差异缺点：（1）需要大量的实验材料来提取DNA，方能满足酶切后得到明显谱带的要求。（2）探针用放射性同位素标记有危害，操作烦琐，DNA多态性检出的灵敏度不高。32内切酶解酶解DNA片段总核DNA双链人工接头连接

22、 特异标记引物PCR限制性片段差异优点：需DNA量少；多态性丰富；重复性好；缺点：（1）探针用放射性同位素标记有危害；（2）对样品DNA质量要求高；多态片段中有共显性表达现象。扩增限制性片段长度多态性分析技术扩增限制性片段长度多态性分析技术(AFLP)(AFLP)2 2、基于、基于DNADNA的方法的方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法3310bp寡核苷酸随机单引物核DNAPCR电泳分离优点：（1）技术通用，一套引物可用于不同物种；（2）简单高效快速；（3）需样量少；缺点：重复性差，对实验条件极敏感；有假阳性和假阴性结果；显性标记，不能提供完整的遗传信息。随机扩增多态性随机扩

23、增多态性DNADNA技术（技术（RAPDRAPD）2 2、 基于基于DNADNA的方法的方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法34微卫星重复序列区非重复特异序列区根据特异序列设计引物PCRDNA电泳位点特异性微卫星分析法微卫星标记（微卫星标记（SSRSSR）2 2、基于、基于DNADNA的方法的方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法优点：简单易行； PCR重复稳定；可用于多种遗传性分析。352 2、基于、基于DNADNA的方法的方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法内嵌微卫星标记内嵌微卫星标记ISSR ISSR (inter-simple seq

24、uence repeat)(inter-simple sequence repeat)优点优点：所需DNA模板的量少、多态性丰富、结果记录方便、实验成本低、稳定性较高。缺点缺点：PCR 扩增最适反应条件需要摸索。362 2、基于、基于DNADNA的方法的方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法单核苷酸多态性单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP) (Single nucleotide polymorphism, SNP) 指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包单个碱基的缺失或插入，更常见的是单个核苷酸的替换，且常发

25、生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。特点：SNP数量多，分布广泛且高度稳定。SNP适于快速、规模化筛查，易于基因分型等。37 SNPs 检测分析技术 在已知 DNA 序列数据库中筛选 以 DNA 构象为基础的方法 直接进行 DNA 测序的方法 以杂交为基础的方法 基于酶切或 PCR的方法 毛细管电泳方法 Polybayes 计算法 SNP pipeline 温度梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳 单链构象多态性 变性高效液相色谱检测 限制性片段长度多态性 随机扩增多态性 突变错配扩增检验 测序 SNaPshot

26、等位基因特异寡核苷酸片段分析 基因芯片技术 毛细管电泳技术 SNP的检测方法三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法2 2、基于、基于DNADNA的方法的方法38标记应用RFLPRAPDISSRSSRAFPLSNPDNA质量高低低中高高高基因组分布低拷贝序列基因组基因组基因组基因组基因组遗传特点共显性多数共显性共显性/显性共显性共显性/显性共显性多态性中等较高较高高较高高技术难度高低低低中等高同位素使用常用不用不用可不用常用不用可靠性高低/中等高高高高所用时间多少少少中等多实验成本高较低较低中等较高高表表3-1 常用分子标记技术特征的比较常用分子标记技术特征的比较三、三、 分子生态学

27、的研究方法分子生态学的研究方法39三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法2 2、基于、基于DNADNA的方法的方法u 线粒体DNA标记优点：（1）母性遗传，无重组；（2）容易设计保守性通用引物；（3）有效单倍性，即细胞中各线粒体的DNA拷贝的遗传组成等同；（4）哺乳动物线粒体DNA的进化速率约为核DNA的10倍（植物的进化速率很低且基因重组频繁）。缺点：不少物种的核基因组存在与线粒体DNA同源的线粒体假基因，干扰线粒体DNA标记的使用。u 叶绿体DNA标记优点：（1）大部分为母性遗传；（2）进化速率小，适合种以上水平的系统发生研究。缺点：（1）不太适合种内遗传变异的研究；（2）由于

28、存在一些父性遗传和双亲遗传的情况，其有效单倍性需要具体分析。40三、三、 分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法3、种群遗传学中选择分子标记的、种群遗传学中选择分子标记的基本原则基本原则： 共显性标记（能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记）； 适合于当前研究要求的多态性水平； 对于比较复杂的研究问题或是研究对象最好选择一个以上的标记系统。4、种群遗传学中选择分子标记时的、种群遗传学中选择分子标记时的基本检验基本检验 ： 是否每个所研究的种群都在Hardy-Weinberg 平衡中，即确定纯合子和杂合子的预期值与试验检测的等位基因频率是否相一致； 是否符合连锁平衡，即不同位点上的等位基因共分离。41 一、分子生态学的产生与发展 二、分子生态学的理论基础 三、分子生态学的研究方法 四、分子生态学的研究实例及展望目目 录录421. 1. 保护遗传学保护遗传学u遗传恢复遗传恢复引进“新鲜血液”能恢复近交小种群的生存力，并且这种遗传恢复很可能是越来越重要的保护管理手段。u 遗传管理的典范：极北蝰（Vipern berus）1992年 引进20条成年成年蝰放入小种群中1992-1995年 引进的雄性与近交产生的雌性蝰蛇