固定化酶及固定化技术.PPT

1、l在水溶液中不稳定在水溶液中不稳定l一次性使用一次性使用- -难回收，难连续化生产难回收，难连续化生产l用于医药用于医药/ /化学分析纯度要求高化学分析纯度要求高l产物的分离纯化困难产物的分离纯化困难l。l要求将酶变成不溶性要求将酶变成不溶性l实际上将酶限制在一定空间实际上将酶限制在一定空间 固定化固定化l19161916年，美国科学家发现年，美国科学家发现，酶和载体结合以后酶和载体结合以后，在，在水中呈不溶解状态时，水中呈不溶解状态时，仍仍然具有生物催化活性然具有生物催化活性。 固定化酶可重复使用固定化酶可重复使用操作稳定性操作稳定性 酶在固定化后其活力可以缓慢释放酶在固定化后其活力可以缓慢

2、释放, , 酶的稳定酶的稳定性比天然状态高性比天然状态高, , 可重复多次使用可重复多次使用. .l结果如图所示: 固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15% ,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与10mL 1%壳聚糖溶液在60下连续反应10 次每次反应时间为6h 每次反应后分别测定酶活力水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体固定化技术固定化技术水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）什么是固定化酶？什么是固定化酶？固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发在一定

3、的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋化学偶联）及包埋等多种方法。等多种方法。 与固定化酶技术相配套的与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器是酶生物反应器同一般的化工容器一样，需要对酶反应同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和器温度和pHpH等条件进行严格的控制；不同等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。的是，酶反应器必须进行无菌操作。19161916年，年，Nelson & Griffin “Nelson & Griffin

4、 “酶不溶于水而具有活性酶不溶于水而具有活性”19481948年，年，Sumner Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶19531953年，年，Grubhofer & Schleith Grubhofer & Schleith 第一次实现了酶的固定化第一次实现了酶的固定化19601960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究19691969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AADL-AA的的光学分析上光学分析上19711971年，固定化酶名称提出，年，固定化酶名称提出

5、，Immobilized enzymeImmobilized enzyme19731973年，固定化微生物的应用年，固定化微生物的应用固定化大肠杆菌中的固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-L-天冬氨酸天冬氨酸19761976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精19781978年，日本用固定化细胞生产酶年，日本用固定化细胞生产酶固定化枯草杆菌固定化枯草杆菌生产淀粉酶生产淀粉酶19791979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究19821982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸年

6、，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸19861986年，郭勇等人固定化原生质研究年，郭勇等人固定化原生质研究稳定性高；稳定性高；酶可反复使用；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；分开；固定化酶的反应条件易于控制固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失固定化时，酶

7、活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应助因子的反应l必须注意维持酶的催化活性及专一性。必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保

8、护好酶蛋白的活性基团。基本原则：基本原则：l固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。l固定化酶应有最小的空间位阻。固定化酶应有最小的空间位阻。l酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。复使用。l固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。产物或反应液发生化学反应。l固定化酶成本要低，以利于工业使用。固定化酶成本要低，以利于工业使用。四大类方法：四大类方法：吸附法（包括电吸附法）吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材

9、料）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法） 指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象较少或者不变化；载体廉价易得较少或者不变化；载体廉价易得缺点：结合力弱，易解吸附缺点：结合力弱，易解吸附选择载体的原则选择载体的原则 （1 1）要有巨大的比表面积）要有巨大的比表面积 （2 2） 要有活泼的表面要有活泼的表面 （3 3） 便于装柱进行连续反应便于

10、装柱进行连续反应。SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土、无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化钛等硅藻土、二氧化钛等离子键结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。体上的方法。l阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE-DEAE-纤维素，纤维素，DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶，Amberlite Amberlite IRA-93IRA-93，410410，900900；阳离子交换剂：阳离子

11、交换剂：CM-CM-纤维素，纤维素，Amberlite CG-50Amberlite CG-50，IRC-50IRC-50，IR-IR-120120，Dowex-50Dowex-50等。等。l使用注意使用注意：pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度l离子结合法的离子结合法的操作简单，处理条件温和操作简单，处理条件温和，酶的高，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。得到酶活回收率较高的固定化酶。l但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或类或pHpH的影响，在的影响，

12、在离子强度高的条件下进行反应离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。时，酶往往会从载体上脱落。l这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。载体结合法中报道最多的方法。l归纳起来有二类：归纳起来有二类：l将载体有关基团活化，然后与酶有关基团将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。发生偶联反应。l在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。偶联上去。( (与交联法合用）与交联法合用）酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形

13、成共价键而固定的方法。价键而固定的方法。l可以形成共价键的基团：可以形成共价键的基团： 游离氨基，游离氨基， 游离羧基，游离羧基， 巯巯基，基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羟基，羟基， 甲硫基，甲硫基， 吲哚基，二吲哚基，二硫键硫键l常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体体首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键关键关键载体活化载体活化活化基团酶分子基团活化基团酶分子基团酶分子和载体连接的功能基团：酶分

14、子和载体连接的功能基团：酶蛋白酶蛋白N-N-端的端的-氨基或赖氨酸残基的氨基氨基或赖氨酸残基的氨基酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp残基的残基的- -和和- -羧基羧基CysCys残基的巯基残基的巯基SerSer、TyrTyr、ThrThr残基的羟基残基的羟基PhePhe、TyrTyr残基的苯环残基的苯环HisHis残基的咪唑基残基的咪唑基TrpTrp残基的吲哚基残基的吲哚基lA A重氮法重氮法lB B叠氮法叠氮法lC C烷基化反应法烷基化反应法lD D硅烷化法硅烷化法lE E溴化氰法溴化氰法载体活化的方法载体活化的方法l优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高优点：

15、酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。或存在盐类等原因而轻易脱落。l缺点：缺点：l该方法反应条件苛刻，操作复杂；该方法反应条件苛刻，操作复杂；l由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为化酶，酶活回收率一般为3030左右，甚至底物的左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。专一性等酶的性质也会发生变化。l只能用于酶，不能用于微生物的固定化只能用于酶，不能用于微生物的固定化是指通过双功能试剂，将酶是指通过双功能试剂，将

16、酶和酶联结成网状结构的方法和酶联结成网状结构的方法OH(CH2)3CHO+E-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-NCH(CH2)3CHN-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-交联法使用的交联剂是戊二醛、交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。物。戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。l例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.

17、0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。l交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。应时间将有利于固定化酶比活的提高。l单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性能差，酶活低，故常与其他方法联用性能差，酶活低，故常与其他方法联用酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子酶分子: :（a a）酶分子之间用双功能基团

18、的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。网格型网格型；微囊型微囊型。 网格法网格法将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。网

19、格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。半透膜包埋法（微囊化法）：半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。制成固定化酶。 半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等l微囊型固定化酶通常直微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制是反应条件要求高，制备成本也高。备成本也高。 微囊发

20、生器微囊发生器比较项目比较项目吸附法吸附法结合法结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶l没有一个方法是十全十美的没有一个方法是十全十美的l包埋、共价结合

21、、共价交联三种虽结合力强、但不包埋、共价结合、共价交联三种虽结合力强、但不能再生、回收；能再生、回收；l吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差，在受到离子强度、，在受到离子强度、pHpH变化影响后，酶会从载体上变化影响后，酶会从载体上游离下来。游离下来。l包埋法各方面较好，但不适于大分子底物和产物。包埋法各方面较好，但不适于大分子底物和产物。l结晶法：结晶法：l分散法：分散法：l热处理法热处理法l等等等等判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有: : (1) (1)相对酶活力相对酶活力l具

22、有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值l通常高于通常高于75%75% (2) (2)酶的活力回收率酶的活力回收率l固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。回收率。l一般情况下一般情况下, ,活力回收率应小于活力回收率应小于1,1,若大于若大于1,1,可能由于固定化活细胞增可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果殖或某些抑制因素排除的结果. . (3)(3)固定化酶的半衰期固定化酶的半衰期 衡量操作稳定性的关键衡量操作稳定性的关键. .l酶的活性中心发生物理

23、化学变化导致酶活力降低酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低l酶固定化后多了空间屏障酶固定化后多了空间屏障, ,增加了传质阻增加了传质阻力力l酶和载体结合不牢固酶和载体结合不牢固, ,容易脱落容易脱落, ,酶活力损失大酶活力损失大l固定化颗粒成型困难固定化颗粒成型困难 l定点固定化技术定点固定化技术 l抗体偶联、生物素亲和素亲和、氨基酸置换（抗体偶联、生物素亲和素亲和、氨基酸置换（CysCys）l多酶系统的共固定化多酶系统的共固定化l多种酶同时固定在膜材料上多种酶同时固定在膜材料上, ,利用各自的功能协同催化复杂利用各自的功能协同催化复杂的生物转化过程的生物转化过程l新型的固定化技术新型的

24、固定化技术l高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用 l加入表面活性剂加入表面活性剂 l可使酶活性大幅度提高，最高的达可使酶活性大幅度提高，最高的达100100 倍，并增加了酶使倍，并增加了酶使用次数用次数l等等等等l不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同l假定：假定：l酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布完全均质完全均质l整个系统各相同性整个系统各相同性l固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质及相互作用。载体材料的性质及相互作用

25、。成分成分参数参数酶酶生物化学性质：生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数：动力学参数：专一性，专一性，pHpH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pHpH，温度，溶剂，去污剂及杂，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性质的稳定性。载体载体化学特征：化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性 机械性质：机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，

26、流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。拌罐的磨损。固定固定化酶化酶固定化方法：固定化方法： 所结合的蛋白所结合的蛋白, ,活性酶的产量活性酶的产量, ,内在的动力学参数内在的动力学参数质量转移效应质量转移效应: :分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性稳定性: :操作稳定性操作稳定性( (表示为工作条件下的活性

27、降低表示为工作条件下的活性降低) )，贮藏稳定性，贮藏稳定性效能效能: :生产力（产品量生产力（产品量/ /单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/ /公斤产品）公斤产品）l酶本身的变化酶本身的变化: :主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化态等发生变化; ;l载体的影响载体的影响：在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。l载体与酶的相互作用：载体与酶的相互作用：载体与

28、酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。构、封闭酶活性部位等。l构象改变：构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致酶分子构象发生某种扭曲，导致酶与底物结合能力或催化能力下降酶与底物结合能力或催化能力下降l立体屏蔽：立体屏蔽： 固定化后，使得酶的活性中心或固定化后，使得酶的活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使得效调节部位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物与酶的临近或者接触受应物或者底物与酶的临近或者接触受到干扰到干扰l微环境：微环境：微环境微环境是指在固定化酶附近是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液的局部环境，而把主体

29、溶液称为称为宏观环境宏观环境。l分配效应：分配效应：由于载体性质，造成底物和由于载体性质，造成底物和效应物等在微观体系和宏观效应物等在微观体系和宏观体系之间的不等性分配，从体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度而影响酶促反应速度l扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环境中的迁移运转速度收到限制境中的迁移运转速度收到限制DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶: :以以DEAE DEAE 纤维素为载体戊二醛为交联剂纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶固定壳聚糖酶l由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等由于载体的亲水、疏水作用和介质的介

30、电常数等性质性质, , 直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力反应的能力l固定化酶的活力在固定化酶的活力在多数情况多数情况下比天然酶小，其专一性也能发下比天然酶小，其专一性也能发生改变。生改变。l例如：例如：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物： 酪蛋白（酪蛋白（高分子）原酶活力的高分子）原酶活力的3030% % 苯酞精氨酸苯酞精氨酸- -对硝基酰替苯胺对硝基酰替苯胺( (低分子低分子) )原酶活力的原酶活力的8080% %。一般认为高分子底物受到一般认为高分子底物受到空间位阻的影响空间位阻的影响

31、比低比低分子底物大。分子底物大。l原因：原因：酶结构的变化酶结构的变化 空间位阻空间位阻l不过，也有个别情况，酶在固定化后反不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。高了酶的稳定性。l在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：活力的原因可能是：v酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；响了活性中心的氨

32、基酸；v固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；会直接影响到活性中心对底物的定位作用；v内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；v包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。膜与酶接近。lMerloseMerlose曾选择曾选择5050种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现：进行比较，发现：l3030种酶稳定性提高，种酶稳定性提高，l1212种酶无

33、变化，种酶无变化，l8 8种酶稳定性降低。种酶稳定性降低。l然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了况下酶经过固定化后稳定性提高了。l可能有以下几点：可能有以下几点：v固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。分子伸展变形。v酶活力的缓慢释放。酶活力的缓慢释放。v抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分

34、子间相互作用的机会，从而抑由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解制了降解v 固定化青霉素酰化酶固定化青霉素酰化酶v 将酶于将酶于0.05 mol0.05 molL L的的PBSPBS（pH 7.5pH 7.5）中分别在）中分别在不同温度下保温不同温度下保温6 6小时，小时，冷却后测定酶活力。冷却后测定酶活力。v 固定化酶的热稳定性优固定化酶的热稳定性优于自然酶于自然酶。固定化酶的稳定性变化固定化酶的稳定性变化1.1.固定化酶；固定化酶；2. 2. 自然酶自然酶l测试结果测试结果:5:5天后其活性仍可保留天后其活性仍可保留96% .96% .例例:将将DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维

35、素固定化壳聚糖酶浸泡在浸泡在95%的的乙醇乙醇中，中，连续连续5天测其催化活性天测其催化活性 l提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。l提高酶对某些抑制剂的稳定性提高酶对某些抑制剂的稳定性l可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。一步发展。l青霉素酰化酶在不同青霉素酰化酶在不同pHpH值的缓冲液中，于值的缓冲液中，于37 37 保温保温16 h16 h测定酶活力。测定酶活力。l固定化酶在固定化酶在pH 5.5-pH 5.

36、5-10.310.3活力稳定；活力稳定；l游离酶则仅在游离酶则仅在 pH pH 7.0-9.07.0-9.0稳定。稳定。l固定化酶的固定化酶的pHpH稳定性明稳定性明显优于游离酶。显优于游离酶。 固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用, , 并在空间上阻碍酶与大分子物质接近并在空间上阻碍酶与大分子物质接近, , 从而降低了酶与从而降低了酶与大分子物质结合的几率大分子物质结合的几率, ,防止酶被其他蛋白酶水解防止酶被其他蛋白酶水解. .l有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。 大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳

37、定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120天酶活力无变化。对操作稳定性都有影响对操作稳定性都有影响 如图：固定化酶的最适如图：固定化酶的最适温度为温度为6060C C ，而游离酶，而游离酶的最适温度为的最适温度为5050C C 而固而固定化酶在定化酶在50- 6550- 65C C 范围范围内都保持了较高的酶活力内都保持了较高的酶活力, ,这说明壳聚酶经固定化这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度下的适应后其在较高温度下的适应范围有了明显提高范围有了明显提高固定化后，酶的热稳定性提高，固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提高所以固定化酶的最适温度提高当然，也有报道最适温度不变或下

38、降的。当然，也有报道最适温度不变或下降的。l酶的催化能力对外部环境特别是酶的催化能力对外部环境特别是pHpH非常敏感。非常敏感。l酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pHpH和和pH-pH-活性活性曲线常常发生偏移。曲线常常发生偏移。l1 1） 载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。 载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。（2 2）产物性质对体系）产物性质对体系pHpH的影响的影响l催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pHpH比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH值；反之则低值

39、；反之则低l例例: :取取0.2g DEAE 0.2g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与纤维素固定化壳聚糖酶与5mL5mL壳壳聚糖酶液各聚糖酶液各8 8份分别于不同份分别于不同pHpH下测定固定化酶和游下测定固定化酶和游离酶的活力离酶的活力可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向酸性偏移向酸性偏移l例：取例：取0.15g0.15g固定化黄曲固定化黄曲霉毒素解毒酶霉毒素解毒酶 和和4ML4ML黄曲黄曲霉毒素解毒酶霉毒素解毒酶 液各液各8 8份，份，分别于不同分别于不同pHpH下测定固定下测定固定化酶和游离酶的活力化酶和游离酶的活力 可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH

40、 向碱性偏移向碱性偏移l影响固定化酶影响固定化酶K Km m的因素：的因素： 1.1.酶的空间立体障碍酶的空间立体障碍l载体为电中性时，由于载体为电中性时，由于扩散限制扩散限制造成表观造成表观KmKm上升。上升。 2. 2. 电荷效应电荷效应l（1 1） 载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，KmKmKmKml（2 2） 载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反，静电作用，KmKmKmKm 3. 3.溶液的离子强度溶液的离子强度l例：取例：取DEAE DEAE 纤维素固定化纤维素固定化壳聚糖酶壳聚糖酶0.2g 0.2g 与与1%1%壳聚糖壳聚糖酶液酶液5mL 5mL 各各6 6

41、份分别加入份分别加入2mL 2mL 不同浓度的不同浓度的壳聚糖溶壳聚糖溶液液(0.4% 1.5%)(0.4% 1.5%)于于5050C C 水水浴中保温浴中保温60min 60min 测定还原测定还原糖浓度，用双倒数作图求糖浓度，用双倒数作图求得米氏常数得米氏常数如图如图 ：经线性拟合可求得：经线性拟合可求得K Km(m(固固)=18.87g/L)=18.87g/LK Km(m(游游) =2.49g/L ) =2.49g/L l本实验中选用的载体本实验中选用的载体DEAE DEAE 纤维素纤维素和底物和底物壳聚糖壳聚糖所所带电荷相反使得带电荷相反使得K Km m 值降低；酶固定化后产生的空值降

42、低；酶固定化后产生的空间立体障碍或间立体障碍或扩散阻力扩散阻力使得使得K Km m 值升高值升高, , 从实验从实验结果可以得出固定化过程中载体所带的电荷的极结果可以得出固定化过程中载体所带的电荷的极性对本实验室所提取的性对本实验室所提取的壳聚糖酶壳聚糖酶的米氏常数的影的米氏常数的影响较酶经固定化后所产生的响较酶经固定化后所产生的空间扩散阻力空间扩散阻力对酶的对酶的米氏常数的影响小米氏常数的影响小 ，所以最后酶，所以最后酶KmKm提高。提高。l一般评价：一般评价：l1 1 酶活定义（酶活定义（IU)IU)：在特定条件下，每一分钟：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为催

43、化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1 1个酶活单位。个酶活单位。l2. 2. 酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶活力单位活力单位l1. 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。的酶活力单位。l或：单位面积（或：单位面积（cmcm2 2）的酶活力单位表示（酶膜、）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。酶管、酶板）。l2. 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。操作半衰期：衡量稳定性的指标。l 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（力一半所需

44、要的时间（t t1/21/2）3.3.偶联效率以载体结合酶量偶联效率以载体结合酶量( (或酶活力或酶活力) )的百分数表示：的百分数表示：由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。所以，仍以测定蛋白量较为难确。l4. 活力回收 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然利用胞内酶制作

45、固定化酶时，需要破碎细胞，然后提取酶，这就增加了工序和成本。后提取酶，这就增加了工序和成本。科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞固定化细胞与固定化酶比较，其固定化细胞与固定化酶比较，其优越性优越性在于：在于：保持了胞内酶系的原始状态与天然环境保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。，因而更稳定。保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生。 2020世纪世纪7070年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于生产。生产。例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或例如，将酵母菌细胞

46、吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于酒类的发酵生产用于酒类的发酵生产固定化增殖细胞固定化增殖细胞发酵发酵更具有显著优越性更具有显著优越性 分类方式分类方式固定化细胞类型固定化细胞类型细胞类型细胞类型微生物、植微生物、植 物、动物、动 物物生理状态生理状态死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞l固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状

47、（与吸附物形状相状、块状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相同）等，同）等，l目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：l不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是柱反应器内易受压变形，流速不好，是柱反应器内易受压变形，流速不好，l圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所以生产效率相对较高。所以生产效率相对较高。l细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现。但是，扫

48、描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包埋，都有类似情况。形成埋，都有类似情况。形成“凹池凹池”的原因尚待进一步的原因尚待进一步研究。研究。l固定化死细胞：固定化死细胞：一般在固定化之前或之后细胞经一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。酶催化的反应。l固定

49、化静止细胞固定化静止细胞和和饥饿细胞饥饿细胞在固定化之后细胞是在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。l固定化增殖细胞固定化增殖细胞又称固定化生长细胞，是将活细又称固定化生长细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。l固定化增殖细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以固定化增殖细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反

50、应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不解体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有解体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以说，固定化增殖细胞在发酵工业中最有发展前途。说，固定化增殖细胞在发酵工业中最有发展前途。1 1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小

51、的生产菌集合体生产菌集合体 2 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用3 3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。( (膜的膜的选择通透性）选择通透性）4 4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应5 5、抗污染能力强、抗污染能力强(1)(1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时

52、，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。他酶的活性止副产物的形成。(3)(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用, ,载体形成的孔隙载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性大小影响高分子底物的通透性. .(4)(4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；的副产物；但这些缺点并不影响它的实用价值。但这些缺点并不影响它的实用价值。 l对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂。要分离后的酶作催化剂。要根

53、据过程本身来决定。根据过程本身来决定。l一般说一般说: :对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适。对多步转换，采用整细胞显然有利。对多步转换，采用整细胞显然有利。缺点：缺点：固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降l固定化微生物细胞：用于生产酒类、氨基酸、有固定化微生物细胞：用于生产酒类、氨基酸、有机酸、抗生素以及酶和辅酶，也可以用于有机溶机酸、抗生素以及酶和辅酶，也可以用于有机溶剂生产，废水处理等剂生产，废水处理等l固定化植物细胞：主要用于生产人工种子、香精固定化植物细胞：主要用于生产人

54、工种子、香精、色素、药物、酶等、色素、药物、酶等l固定化动物细胞主要用于生产疫苗固定化动物细胞主要用于生产疫苗 1 1、在工业上的应用、在工业上的应用用固定化酶可以生产用固定化酶可以生产L-L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、半合成的抗生素母核等半合成的抗生素母核等L L氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DLDL氨氨基酸可连续生产基酸可连续生产L L氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）生产生产L LAspAsp：以以120L120L柱式反应器柱式反应器6060天可生产天可生产5 5

55、吨的吨的L LAspAsp。乙酰乙酰 -DL -Ala L -Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala （A-D-Ala）Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Alal牛奶中含有牛奶中含有4 43 3-4-45 5的乳糖，乳的乳糖，乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连

56、续糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解处理牛奶，将乳糖分解l乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋类产品中结晶改善口感。类产品中结晶改善口感。l严重肾脏疾病，需血液透析。过滤尿素和尿酸等代谢废物严重肾脏疾病，需血液透析。过滤尿素和尿酸等代谢废物l利用固定化脲酶透析液和活性碳构成的体外循环装置利用固定化脲酶透析液和活性碳构成的体外循环装置l固定化脲酶：脲酶与离子交换树脂通过微囊法制备而成的固定化脲酶：脲酶与离子交换树脂通过微囊法制备而成的脲酶水解尿素为氨和脲酶水解尿素为氨和COCO2 2，氨

57、被树脂吸附，氨被树脂吸附，COCO2 2由肺呼出，由肺呼出，其他代谢物由活性碳吸附其他代谢物由活性碳吸附人工肾：人工肾：治疗癌症治疗癌症l正常细胞：正常细胞：L-AsnL-Asn合成酶，合成酶，AsnAsn被消耗的同时不断被消耗的同时不断合成维持细胞蛋白质合成需要合成维持细胞蛋白质合成需要l癌细胞：缺少活无癌细胞：缺少活无L-AsnL-Asn合成酶，合成酶， AsnAsn被消耗，被消耗，影响蛋白质合成，细胞影响蛋白质合成，细胞“饿死饿死”用固定化的用固定化的天冬酰胺酶天冬酰胺酶治疗治疗白血病白血病l利用尼龙或尿素聚合物半透膜制备成微囊型利用尼龙或尿素聚合物半透膜制备成微囊型L-L-天冬酰胺酶天

58、冬酰胺酶, ,用于白血病治疗。用于白血病治疗。l改变了酶的最适改变了酶的最适pHpH；l微囊型酶对蛋白酶稳定；微囊型酶对蛋白酶稳定；l注射到大白鼠腹腔内，急性毒性很低、也不会产生抗体；注射到大白鼠腹腔内，急性毒性很低、也不会产生抗体；l除制成微囊型外，还有人采用酶管或酶板形式进行体外循除制成微囊型外，还有人采用酶管或酶板形式进行体外循环治疗，也达到了预期的疗效。环治疗，也达到了预期的疗效。 将酶包埋在半透膜性质的聚合物内，制成所谓的将酶包埋在半透膜性质的聚合物内，制成所谓的微囊型固定化酶微囊型固定化酶。小分子底物或产物可自由地透过。小分子底物或产物可自由地透过胶囊的半透膜，而酶作为大分子则不能

59、透过胶囊；胶囊的半透膜，而酶作为大分子则不能透过胶囊；此外，胶囊外的一些蛋白质、酶、抗体等高分子物此外，胶囊外的一些蛋白质、酶、抗体等高分子物质也不能进入胶囊内部，这就避免了发生过敏性反质也不能进入胶囊内部，这就避免了发生过敏性反应。应。 胶囊型固定化胶囊型固定化 酶的另一大酶的另一大优点优点是，是，胶囊内的酶仍以胶囊内的酶仍以溶解状态作用于底物溶解状态作用于底物。因此突破了狭义的固定化酶的。因此突破了狭义的固定化酶的定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。 与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸纤维

60、等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、稳定和体内易代谢等特点。稳定和体内易代谢等特点。 是一种与是一种与x x染色体连锁染色体连锁的遗传代谢病的遗传代谢病 患者由于先天性缺患者由于先天性缺乏乏HGPRTHGPRT，导致体内次，导致体内次黄嘌呤和鸟嘌呤补救途黄嘌呤和鸟嘌呤补救途径的障碍，并进而引起径的障碍，并进而引起肾结石、痛风。肾结石、痛风。 Lesch-NyhanLesch-Nyhan综合症综合症 ChangChang等人利用等人利用微囊型微囊型嘌呤氧化酶治疗嘌呤氧化酶治疗Lesch-NyhanLesch-Nyhan综合症，使次黄嘌呤的水平显综合症，使次黄嘌呤的水平显