蛋白质核酸沉淀分离技术

1、会计学1蛋白质核酸沉淀分离技术蛋白质核酸沉淀分离技术1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理、中性盐沉淀蛋白质的基本原理亲水胶体在水中的稳定因素亲水胶体在水中的稳定因素 等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸带正电荷蛋白质（带正电荷蛋白质（亲水胶体）亲水胶体）碱碱水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）由于中性盐的亲水性大于蛋白质由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性

2、，所以加入大和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，量中性盐后，夺走了水分子夺走了水分子，破，破坏了水化膜，暴露出疏水区域。坏了水化膜，暴露出疏水区域。同时又同时又中和了电荷中和了电荷，破坏了亲水，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。胶体，蛋白质分子即形成沉淀。2、中性盐的选择、中性盐的选择 Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称进行排序，称Hofmeister序列序列，或感胶离子序。，或感胶离子序。02080100 （NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.81

3、01最常用的盐：最常用的盐：硫酸铵硫酸铵缓冲能力弱，具腐蚀性，含缓冲能力弱，具腐蚀性，含N（1）加入固体盐法）加入固体盐法3、 盐析的操作方法盐析的操作方法适用：饱和度高，不增大溶液体积适用：饱和度高，不增大溶液体积加入硫酸铵固体的量：查表、计算加入硫酸铵固体的量：查表、计算饱和度饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。浓度。（1）加入固体盐法）加入固体盐法2123 . 0100)(533SSSg2123 . 0100)(541SSSg2025g ：加入固体硫酸铵的质量：加入固体硫酸铵的质量S2：所需达到的硫酸铵饱和度：所

4、需达到的硫酸铵饱和度S1：原溶液的硫酸铵饱和度：原溶液的硫酸铵饱和度适用：蛋白质溶液体适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。硫酸铵浓度不高。 V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0：原溶液体积；：原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；S1：原溶液的硫酸铵饱和度。：原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法饱和硫酸铵的配制方法 在一定量的水中加入在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至过量的硫酸铵，加热至50506060，趁热滤去沉淀，趁热滤去沉淀，再在再在00或室温平衡或室温平衡1 12 2天，有

5、固体析出时达天，有固体析出时达100100饱和度。饱和度。 （3）透析平衡法）透析平衡法 方法一方法一：取料液分成等体积几份，冷却至：取料液分成等体积几份，冷却至004、盐析曲线的制作、盐析曲线的制作 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度（或测定离心上清液）浓度（或测定离心上清液）以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 蛋白质量蛋白质量(mg

6、)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度方法二方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度浓度以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线白质溶解度曲线 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度5、盐析的影响因素、盐析的影响因素 （1）离离子子强强

7、度度与与离离子子类类型型S：离子强度为：离子强度为I时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；S0：离子强度为：离子强度为0时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；KS：盐析常数。：盐析常数。 盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系： 当溶剂的温度一定时，对当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，于某一溶质，S0是一常数是一常数（溶解度常数）（溶解度常数） IKSSlgKS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很

8、高的多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低，但高价阳离子的存在反而降低KS ；大而不规则的蛋白分子大而不规则的蛋白分子KS越大。越大。KS主要取决于盐的性质：主要取决于盐的性质：离子价数离子价数离子半径离子半径介电常数介电常数KS几种盐的盐析能力的排列次序：几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾磷酸钾硫酸钠硫酸钠磷酸铵磷酸铵柠檬酸钠柠檬酸钠硫酸镁硫酸镁1纤维蛋白纤维蛋白2血红蛋白血红蛋白3拟球蛋白拟球蛋白4血清蛋白血清蛋白5肌红蛋白肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图 KS分段盐析法分段盐析法分段盐析法分段盐析法 在一定在一定pH、温

9、度条件下，改变离子强度。、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。适用于早期粗提阶段的分步分离。 在一定离子强度下，改变在一定离子强度下，改变pH、温度。适、温度。适于后期分离纯化和精制。于后期分离纯化和精制。（2）蛋蛋白白质质浓浓度度硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓度蛋白质浓度g/L硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度%结果结果3058开始沉淀开始沉淀366开始沉淀开始沉淀306590%沉淀析出沉淀析出当蛋白浓度增加当蛋白浓度增加10倍时，盐析时倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小所需硫酸铵的饱和度约减小7%。 适宜蛋白质浓度是适宜蛋白质浓度是2.53

10、.0（25 mg/mL30mg/mL） （3）pH的的影影响响 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近值常选在该蛋白质的等电点附近。 在水或稀盐溶液中测得的等电点在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样能不一样

11、 （4）温温度度的的影影响响 温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。和小分子有机物，温度升高溶解度加大。 但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。是随温度升高而增加的。 在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进

12、行。但对于某些对温度敏感的酶，要，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在求在04下操作，以避免活力丧失。下操作，以避免活力丧失。 6、注意事项、注意事项 二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法 未沉淀蛋白质的分率未沉淀蛋白质的分率pH对大豆蛋白质溶解度的影响对大豆蛋白质溶解度的影响利用等电点除杂蛋白时必须利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意溶液中含有金属离子时，必须注意调整调整PH值值

13、。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想单独使用此法分辨率较低，效果不理想。主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白例如：工业上生产胰岛素例如：工业上生产胰岛素粗提液粗提液调调PH8.0调调PH3.0去除碱性蛋白质去除碱性蛋白质去除酸性蛋白质去除酸性蛋白质胰岛素胰岛素三、有机溶剂沉淀法三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮许多能与水互溶的有机溶

14、剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。机理分析进展机理分析进展 对某些具有生物活性的大分子容易引起变对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。性失活，操作需在低温下进行。成本高。 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。可用透析袋脱有机溶剂）。2、有机溶剂的选择和浓度的计算、有机溶剂的

15、选择和浓度的计算 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。 前提：能与水互溶前提：能与水互溶)100()(2120SSSVV离子强度离子强度 3、有机溶剂沉淀的影响因素、有机溶剂沉淀的影响因素 温度温度 样品浓度样品浓度 pHpH值值 四、非离子多聚物沉淀法四、非离子多聚物沉淀法 20世纪世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分

16、子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：如：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖）、葡聚糖等。等。 u沉淀作用是聚合物与生物大分子发生沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀共沉淀作用。作用。u由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水脱水而发而发生沉淀。生沉淀。u聚合物与生物大分子之间聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。，在重力作用下形成沉淀析出。u通过通过空间位置排斥空间位置排斥，使液体中生物大分

17、子被迫挤聚在，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。一起而发生沉淀。非离子多聚物沉淀蛋白的原理非离子多聚物沉淀蛋白的原理 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀即可以沉淀相当多的生物大分子。相当多的生物大分子。 沉淀后有机聚合物较难去除。沉淀后有机聚合物较难去除。 特特 点点： 1）选用）选用两种水溶性非离子多聚物两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。系，不等量分配，而造成分离。2）选用）选用一种水溶性非离子多聚物一种水溶性非离子多聚物，使生物大

18、分子，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方方 法法 沉淀机理沉淀机理五、聚电解质沉淀法五、聚电解质沉淀法 蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。就发生沉淀。六、生成盐复合物沉淀法六、生成盐复合物沉淀法 金属复合盐法金属复合盐法有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法金属离子沉淀蛋白质可分为三类：金属离子沉淀蛋白质可分为三类：实际使用时，金属离子的浓度常为实际使用时

19、，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。ZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉碱性功能团形成复合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去淀析出，沉淀后用乙醚除去有机酸。有机酸。 如细胞色素如细胞色素C用用45%硫酸铵除杂后硫酸铵除杂后，用，用20% TCA即可即可将其沉淀。将其沉淀。 如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。 七、其他沉淀法七、其他沉淀法 1、选择性变

20、性法、选择性变性法 p 选择一定的条件使溶液中存在的某些选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白杂蛋白等杂质变性等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择选择性变性沉淀法。性变性沉淀法。2、亲和沉淀、亲和沉淀 利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原理是理是依据依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。引导产生沉淀的方法有：引导产生沉淀的方

21、法有：u离子交联离子交联u加入带相反电荷的聚合物加入带相反电荷的聚合物u加入带相反电荷的疏水基团加入带相反电荷的疏水基团u改变改变pH值，诱导产生疏水沉淀值，诱导产生疏水沉淀u温度诱导产生沉淀温度诱导产生沉淀配基配基-载体复合物与目的蛋白质的分离载体复合物与目的蛋白质的分离基本过程：基本过程：亲和结合亲和结合 洗洗 涤涤 初始阶段：将一个目标蛋白质初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；配体络合成沉淀；所得沉淀物用一种适当的所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质可能存在的杂质用一种适当的用一种适当的

22、试剂将目标蛋试剂将目标蛋白质从配体中白质从配体中离解出来离解出来3.4 核酸的沉淀方法核酸的沉淀方法 核酸分离纯化应维持在核酸分离纯化应维持在0-4的低温的低温条件下，条件下，以防止核酸的变性和降解。以防止核酸的变性和降解。 为防止核酸酶引起的水解作用，可加入为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十十二烷基硫酸钠二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。等以抑制核酸酶的活性。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法钙盐沉淀法钙盐沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法常用的沉淀分离法有：常用的沉淀分离法有：1 1、有

23、机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或入乙醇、异丙醇或2-2-乙氧基乙醇，使乙氧基乙醇，使DNADNA或或RNARNA沉淀下来沉淀下来。核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关： 相对分子质量相对分子质量106Da106Da的双链的双链DNADNA可以可以丝状纤维丝状纤维缠绕在玻棒缠绕在玻棒上；上； 相对分子质量稍小的双链相对分子质量稍小的双链DNADNA或单链或单链DNADNA、RNARNA则以则以凝胶形凝胶形式式存在。存在。 这些核酸经离心后存在于沉

24、淀中，用这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%70%乙醇乙醇洗涤，除去洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。 2 2、等电点沉淀法、等电点沉淀法脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白的等电点为的等电点为pH 4.2；核糖核蛋白核糖核蛋白的等电点力的等电点力pH 2.0-2.5；tRNA的等电点为的等电点为pH 5。 3、钙盐沉淀法、钙盐沉淀法4、选择性溶剂沉淀法、选择性溶剂沉淀法 在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿异戊醇或氯仿/辛醇，振荡辛醇，振荡一段时间，使一段时间，使蛋白质在氯仿蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀水界面上形成凝胶状沉淀而离心而离心除去，除去，核酸仍留在水溶液中核酸仍留在水溶液中。 在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，水溶液提取液中，DNA和和RNA都进入水层都进入水层，而，而蛋白质沉淀于蛋白质沉淀于苯酚层中苯酚层中被分离除去。被分离除去。 在在DNA与与RNA的混