酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)

1、YUNNAN NORMAL UNIVERSITY本科学生实验报告学号 104120440 姓名 孙永升学院 生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程 < 实验,教师及职称 李俊俊< 讲师,开课学期 2012 至 2013 学年第二学期填报时间 2013 年 4 月 9 日云南师范大学教务处编印实验名称实验方式小组成员实验一、纤维素酶活力测定小组合作XXXXXXXX1、实验目的1.1 学习并了解纤维素酶的基本特性；1.2 学习酶活力的测定方法；1.3 学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；1.4 学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；2、实验仪器、试剂和

2、溶液：A 2仪器：A 2.1滤纸酶活力（FPA）的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有：分光光度计、酸度 计精度士0.01 pH、恒温水浴（50士0.l）0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表 或定时钟、沸7k洛（可用800W中炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成 卜具塞 刻度试管25mL。A 2.2竣甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定中仪器：自动连续多档分配器、 漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1B 2试剂和溶液（除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸储水或去 离子水或相当纯度的水。）B 2.1葡萄糖标准曲线制备： 葡萄糖标准贮备溶液（10mg/

3、mL）:称取于（103士2）C下烘千至恒重的无水葡萄糖1g , 精确至0.1mg,用水溶解并定容至100mL, 葡萄糖标准使用溶液：分别吸取葡萄糖标准贮备溶液 0.00 ,1.00 ,1.50 ,2. 00,2. 50,3.00,3 .50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10 mL,盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应 根据需要自行调整。B 2.2滤纸酶活力（FPA）的测定中用到的试剂 和溶液：DNS试剂：称取3,5 一二硝基水杨酸（10±0.1） g,置于约600mL水中，逐渐加入氢 氧化钠10g,在50c水浴中他力）搅拌溶解，再依次加入洒石酸甲钠200 g、苯 酚（重蒸）2g和无水亚

4、硫酸钠5g,待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定 容至1000mL,过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置 7d后使用。柠檬酸缓冲液，0.05 mol/L pH4 .8（适用于酸性纤维素酶）：称取一水柠檬酸4.83g , 溶于约750m L水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠 7.94g用水定容至 1000 mL0调节溶液的pH到（4.8±0.05）备用。 磷酸缓冲液，0.1m ol/L pH6 .0 （适用于中性纤维素酶）：分别称取一水磷酸二氢钠 121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g,将其?§解在10L去离子水中。调节溶液 的pH到（6.0±0.05济用。溶液

5、在室温可保存一个月。 快速定性滤纸（杭州新华一号滤纸）沪15 cm（每批滤纸，使用前用标准酶加以校正）。B 2.3竣甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定用到的试剂和溶液： 竣甲基纤维素钠（CMC-Na）:化学纯（上海光华化学试剂厂）在25,2 %水溶液，粘度 800m Pa.s-1200m Pa.so他批竣甲基纤维素钠使用前用 标准酶加以校正）。 柠檬酸钠缓冲液，同上。磷酸缓冲液，同上。CMC-Na溶液：称取2g CMC-Na,精确至1mg,缓缓加入相应的缓冲液约200mL并力口 热至800C-900C,边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后 用相应的缓冲液稀释至

6、300 mL,用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH 到（4.8±0.05）（酸性纤21素酶）或（6.0±0.05）（中性纤维素酶），最后定容到 300 mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。DNS试齐1J同上。3、实验原理及实验流程或装置示意图：A 3滤纸酶活力（FPA）的测定原理：纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（滤纸）水解，释放出还原糖。在碱 性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅 与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量， 计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素

7、酶的酶活力。B 3竣甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定原理：纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（狡甲基纤维素钠）水解，释放出还 原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其 颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还 原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。C 3实验流程：葡萄糖标准曲线制作. 而,滤纸酶活力（FPA）的测定 次”竣甲基纤维素（还原 糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定D 3酶活定义D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，

8、能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤 维二糖和葡萄糖的酶。D 3.2 滤纸酶活力 Filterp apera ctivity （FPA）lg固体酶（或1mL液体酶），在（50 士 0.1）C,指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8,中 性纤维素酶pH 6.0）, lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1 个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。D 3.3竣甲基纤维素酶活力（CMCA）D 3.3.1还原糖法lg固体酶（或1mL液体酶），在（50士0.1）C、指定pH条件下（酸性纤维 素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0）, lh水解竣甲基纤维素钠底物，产生出相当于 1

9、mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。简写为 CMCA-DNS 0D 3.3.2粘度法1g固体酶（或1mL液体酶），在（40士0.1）C、指定pH条件下（酸性纤维素 酶pH6 .0,中性纤维素酶pH7.5）,水解竣甲基纤维素钠底物，使底物粘度降低 而得到的相对于标准品的纤维素酶相对酶活力。简写为CMCA-VIS 。4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：A 4葡萄糖标准曲线制备流程：A 4.1绘制标准曲线的方法A 4.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度AoA 4. 1.2浓度c为横坐标，OD为纵坐标，则得到

10、一条拟合度较好的直线，称为标准曲 线。A 4.1.3然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上 找出对应的被测溶液浓度或含量。A 4.1.4 0.1%葡萄糖标准曲线的制作流程：如表一：取7支试管，编号，按照下表进行操作：如表一所示试管编号012345葡锢糖溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.0葡锢糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.0缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.0DNS (ml)333333定容总体积（ml）151515151515OD (540nm)（葡萄糖标准贮备溶液的浓度为1mg/ml。）表B 4滤纸酶活力（FPA）

11、的测定步骤：B 4.1待测酶液的制备：称取同体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1mL,精确至0.01 mL）,用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰 好落在0.3-0.4范围内），放置10 min,待测。（本实验中已提前稀释到200音。）B 4.2滤纸条的准备：将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h:将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50士05）mg的滤纸条，折成M型备用。B 4.3操作步骤：取三支25mL刻度具塞试管（一支空白管，二支样品管）。实验中分为两组：pH 4.8与pH 6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍、pH 6.0酶液稀释至U

12、 5000音。将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部沿lcm方向竖直放入）。分别向四支管中，准确加入相应pH的缓冲溶液1 .50 mL0分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），使管内溶 液浸没滤纸，盖塞。将三支试管同时置于（50士0.1）C水浴中，准确计时，反应60min,取出。立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入稀释好的待测 酶液0.5 0 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热 10min,取出，迅速冷却至 室温，加水定容至25mL,摇匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分 别测

13、量二支平行管中样液的吸光度。取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或用 线性回归方程求出还原糖的含量。C 4竣甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定操作步骤：C 4 .1待测酶液的稀释：实验前已将酶液稀释到 10000音。C 4 .2操作步骤：取三支25mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）。实验中介为两组：pH4.8与pH 6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到500时。分别向四支管中，准确加入用相应 pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶2.00mL。分别准确加入稀释好的待测酶液0.50 mL于三支样品管中（空白管不加），用漩涡混 匀器混匀，盖塞。将四支

14、试管同时置于（50+0.1）C水浴中，准确计时，反应30min,取出。迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL,于空白管中准确加入稀释好的待测 酶液0.5 0 mL,摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热 10min,取出, 迅速冷却至室温，用水定容至25mL 0以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯， 分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归 方程求出还原糖的含量。D 4 .3滤纸酶活力（FPA）的测定步操作流程：如表二所示:操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1试管底部放入折好的M型滤纸条步骤1加入相应pH的缓冲

15、液1.5 mL （实验中两个 pH梯度pH 6.0与pH 4.8）步骤2稀释酶液至所需测定彳音数（原酶液为200倍pH 4.8为1000; pH 6.0为5000）步骤3加入待测酶液0.5 mL加入待测酶液0.5 mL步骤450c精确保温60min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀步骤7加入0.5 mL待测酶液，沸水浴煮沸10min沸水浴煮沸10min沸水浴煮沸10min步骤8流水冷却至室温步骤9加蒸储水定容至25mL ,混匀步骤10OD540nm 比色（注意：OD = （A+B） / 2,比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）表二D 4 .4竣甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMC

16、A-DNS ）测定操作流程：如表三所示:操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1加入相应pH的缓冲液配制的2mLCMC-Na (实验中两个pH梯度pH 6.0与pH 4.8)步骤2稀释酶液至所需测定彳音数（原酶液为200倍pH 4.8为1000; pH 6.0为5000）步骤3加入待测酶液0.5 mL（漩涡?！匀）步骤450c精确保温30min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应步骤6加入0.5 mL待测酶液混合均匀步骤7沸水浴煮沸10min步骤8流水冷却至室温步骤9加蒸储水定容至25mL ,混匀步骤10OD540nm 比色（注意：OD = （A+B） / 2,比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）表

17、三E 4 .5酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落;移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5实验处理A 5实验现象、数据及观察结果A 5.1标准曲线的测量结果：如表四：试管编号012345OD (540nm)值一0.05950.21350.3450.4930.622表四A 5.2滤纸酶活力（FPA）的测定测定纤维素嗨活现象及结果：A 5.2.1酸性纤维素H pH4.8:如表五试管号空白管样品管A样品管B颜色浅黄色棕黄色棕黄色OD540nm0.000

18、.0800.070A 5.2.2中性纤维素酶pH 6.0:如表六试管号空白管样品管A样品管B颜色，、一浅黄色棕黄色棕黄色OD540nm0.000.0540.052如表六B 5.3竣甲基2f维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS ）测定现象及结果：B 5.3.1酸性纤维素酶pH4.8:如表七管号空白管样品管A样品管B颜色，.浅黄色棕黄色棕黄色OD540nm0.000.0540.052表七B 5.3.2中性纤维素酶pH 6.0:如表八管号空白管样品管A样品管B颜色浅黄色棕黄色棕黄色OD540nm0.000.0800.070B 5实验结果处理：如表八B 5.1葡萄糖标准曲线如图1：葡萄糖标准曲线如

19、上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747, k=0.7023,R2=0.9992>0.99,该标准曲线相关性很好。式中 Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度，0.0747表示补偿参数。B 5.2纤维素酶活计算结果：纤维素酶活国际单位：在特定条件（25C,具最适底物浓度、最适温度、最适 pH 和离子强度系统）下，每分钟内转化1 umol底物或催化1 umol 产物形成所需要的酶量为1个酶活单位。单位u/mLB 5.3 滤纸酶活力 Filterp apera ctivity （FPA）指：lg 固体酶（或 1mL液体酶），在（50士0.1）C, 指定pH条件下（酸性纤

20、维素酶pH4.8,中性纤维素酶pH 6.0）, lh水解滤纸底物，产 生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。计算公式：滤纸酶活力Xi= （OD平均值+b）/0.5 x n （b为截距，N酶液稀释倍数）国际单位酶活 X= Xi X 100/ (180.2X60) X 1000 U/mgB 5.3.1:酸性纤维素酶pH4.8 滤纸酶活力 ：Xi= （0.075+0.0747） /0.5X 1000=299.4 u/mL 国际单位酶活：X=2769 U/mgB 5.3.2:中性纤维素酶pH 6.0 滤纸酶活力 ：Xi= （0.053+0.0747） /0.

21、5X 1000=255.4 u/mL 国际单位酶活：X= 2362 U/mgB 5.4竣甲基纤维素酶活力（CMCA）:（还原糖法）lg固体酶（或1mL液体酶），在（50士0.1）C、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0）, lh水解竣甲 基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位， 以u/g（或u/mL）表示。简写为CMCA-DNS。计算公式：CMCA-DNS 酶活力计算=Ax1/0.5xnx2竣甲基纤维素酶活力X1= （OD平均值+b） /0.5 x n X 2 （b为截距，N酶液稀释倍数） 国际单位酶活X= X1 X 100/ （1

22、80.2X 30） X 1000 U/mgB 5.4.1:酸性纤维素酶pH4.8 CMCA-DNS 酶活：X1=（0.481+O.0747）/0.5 X 2 X 10000=22248 u/mL 国际单位酶活：X= 41154 U/mgB 5.4.2:中性纤维素酶pH 6.0CMCA-DNS 酶活：X1=（0.279+O.0747）/0.5 X 2X 10000=3537 u/mL 国际单位酶活：X= 65430 U/mg14C 5分析与讨论：C 5.1葡萄糖标准曲线：葡萄糖标准曲线制作得回归直线方程 y=kx-0.0747, k=0.7023, R2=0.9992>0.99,该标准曲线

23、相关性很好。从而确定该标准曲线可用于酶的活力测 定。可做滤纸酶活力(FPA)与CMCA-DNS酶活力测定。式中Y表示表示测定的 吸光度(OD)值，X表示还原糖的浓度，0.0747表示补偿参数。C 5.2滤纸酶活力(FPA)、竣甲基纤维素酶活力：由结果可以看出纤维素滤纸酶活、竣甲基纤维素酶在两个反应环境一酸性与中性中， 纤维素滤纸酶活于pH4.8高于pH 6.0,说明纤维素滤纸酶活使用中酶活环境应该是 在酸性中发挥作用好，需要进一步试验验证。底物不同，活力的测定值也不同，以竣甲基纤维素为底物测得的酶活值CMCA比以滤纸为底物测得的酶活值FPA高；这说明酶对水溶性底物有较高的活力；也表明了 吸附对

24、酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。从本次试验可以看出纤维素酶活反应中对pH要求一般为酸性环境、温度(50 士0.1)co这样能发挥出该酶的最大效率。因此再生产实践中使用纤维素酶应保证最适 pH、温度(50 ± 0.1) CO当然没反应受各种因素共同作用，其活性受温度、pH反应体系溶液的离子强度、酶浓度、底物、反应时间等各种因素综合作用都会影响酶 活力的反应、测定结果，本次试验只是简单地验证性实验测定。要更加准确测定糖 化酶活需要我们减少或控制其他变量，只针对单一变量操作，这些有待进一步实验。6、实验小结本次实验成败之处及其原因分析：(1)、了解了纤维酶活的两种测定

25、方法，加强实验动手能力，小组合作意识。(2)、熟悉了酶活力的测定方法与酶活单位的定义、意义。(3)、由于酶的反应特殊性与复杂综合因素影响因此在酶活力测定过程中，为了减少误 差，应该熟悉掌握操作过程，对影响到的诸多因素严格控制，如：对温度严格控 制，反应时间、温度严格控制，尽量减少误差，使结果可靠、准确。另外为了减 少视觉误差造成的影响，还可进行实验预滴定。改进措施：(1)、测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、 pH等。量取液体时精确，如缓冲液、酶液、 DNS试剂等。(2)、对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。养成科学分析问题的习惯。7实验思考题：A.7酶活力测定原则是什么？答：

26、酶活力测定时，应做到快速、简便、准确的原则。(1)提供最适底物(专一性)，当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。(2)测定时，酶量要适量。(3)确定的反应时间要适宜，时间越长，酶活越低；时间越短，酶活越高。(4)反应条件是最适条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离子环境。B.7酶活力测定应注意哪些问题？答：测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最 pH值、 满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。(1)底物浓度，由于S与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求S达 到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。(2)酶浓度，在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说， 只有SE时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才