异叶败酱中三萜化合物常春藤皂苷元对人早幼粒白血病

1、异叶败酱中三萜化合物常春藤皂苷元对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、周期阻滞及凋亡诱导的作用丁 兰，侯 茜，徐福春，张 琼，王 瀚，刘国安（西北师范大学 生命科学学院，甘肃，兰州，730070）摘要：利用倒置显微镜观察法、台盼蓝排染法、hoechst33258荧光染色法、DNA ladder电泳以及流式细胞分析技术，检测了从甘肃产异叶败酱中分离得到的三萜化合物常春藤皂苷元（HG）对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、周期阻滞及凋亡诱导作用结果表明，常春藤皂苷元在较低浓度（1040molL-1）条件下，对HL-60细胞增殖具有良好的抑制作用；在较高浓度（4050molL-1）条件下，对

2、HL-60细胞具有致死作用；同时，常春藤皂苷元对HL-60细胞的G1期阻滞和凋亡诱导作用极可能是其实现增殖抑制和致死作用的主要途径关键词：常春藤皂苷元；人早幼粒白血病细胞；生长抑制；周期阻滞；凋亡中图分类号：Q946；Q255 文献标示码：A 文章编号：The effect of Hederagenin，a triterpnoid from Patrinia heterophylla Bunge.on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosisof Human promyelocytic leukemia HL-60

3、 cellsDING Lan，HOU Qian，XU Fu-chun，ZHANG Qiong，WANG Han，LIU Guo-an（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China）Abstract：The effects of Hederagenin（HG），a triterpnoid from Patrinia heterophylla，on the proliferation inhibition，cell cycle arrest and apoptosis of Human

4、promyelocytic leukemia HL-60 cells were measured by morphological observation，typanblue exclusion method， Hoechst 33258 stain assay，DNA ladder and flow cytometry respectively The results showed that Hederagenin could inhibit the proliferation of HL-60 at low concentrations（1040molL-1）while make the

5、cells death at the high concentrations（4050molL-1）It suggested that HG could make proliferation inhibition and cell death on HL-60 cells through G1 phase arrest and apoptosis Key words：Hederagenin；Human promyelocytic leukemia cells；cell cycle arrest；proliferation inhibition；apoptosis 基金项目：甘肃省教育厅科研资助

6、项目（0601-27）作者简介：丁兰（1964），女，四川德阳人，教授，博士，硕士研究生导师. 主要研究方向为天然药物化学与细胞工程。E-mail：dinglan异叶败酱（Patrinia heterophylla Bunge）是败酱科（Valerianaceae）败酱属（Patrinia Juss）植物多年生草本植物1，也是传统中药材墓头回的药源植物之一，墓头回的另一药源植物为糙叶败酱，临床上将其用于治疗白血病2，3、具有很好的疗效，同时墓头回还用于治疗子宫癌，子宫颈癌，胃癌病等1目前，对于上述2种植物的化学成分的研究已有了较为系统的报道4，5，6，其主要的化学成分为三萜类化合物，包括熊果酸

7、、齐墩果酸，败酱皂苷和常春藤皂苷等7有关这2种植物抗肿瘤的研究主要还集中在植物粗提物的体内外抗肿瘤测试8，9，10，如：有研究表明两种植物的水提物对小鼠S180肉瘤抑制率达62.5%，并观察到是直接杀伤作用8而其单体化合物的抗肿瘤研究非常有限，因而，目前尚不能知道哪种（哪些）化合物在对白血病治疗过程中起着主导作用本课题组从甘肃陇南地区的异叶败酱中分离得到了10余种化合物，鉴定出7个三萜化合物、2 个甾体化合物和1个三萜皂甙，并用SRB法对其中分离到的得率较高的化合物进行体外毒性测试，部分化合物表现出较高的抗癌活性，但对其抗癌机理没有进一步研究6常春藤皂苷元(hederagenin，缩写为HG)

8、（化学结构如图一所示）是所分离的7个三萜化合物中，得率高，且细胞毒性较强的1种有关常春藤皂苷元抗肿瘤研究很少，李祖强11等用小鼠白血病细胞（L1210），人结肠癌细胞 (LS174T)等癌细胞株对山苦瓜中常春藤皂苷元成分进行了体外细胞毒性测试，结果表明，常春藤皂苷元较好的细胞毒活性因此，进一步研究该化合物的抗肿瘤作用及其机理，对于明晰异叶败酱抗癌化学成分以及发现其中的抗癌先导化合物非常必要该文研究了常春藤皂苷元在不同浓度及时间条件下对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖、细胞周期及凋亡的影响，为进一步阐明抗癌中药墓头回的抗癌成分及作用机理提供科学依据图1 Hederagenin化学结构式Fig

9、1 Chemical structure of Hederagenin1 材料与方法1.1 材料单体化合物常春藤皂苷元(HG)，由本课题组从甘肃陇南地区的异叶败酱中分离得到6，将药物溶于DMSO，在4冰箱中保存备用人早幼粒白血病细胞HL-60引自兰州大学生命科学学院RMPI-1640培养基为Gibco原装；胰蛋白酶购自Sigma公司；新生小牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；Heochst33258荧光染料，溴化乙啶（EB）购自美国Sigma公司细胞培养板为美国Costar；超净工作台为苏净集团安泰公司生产；二氧化碳饱和湿度恒温箱（美国Forma Scientific）；Leitz-diav

10、ert倒置显微镜；Olympus荧光显微镜1.2 方法1.2.1 细胞培养 人早幼粒白血病细胞HL-60培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加青霉素100gmL-1，链霉素100gmL-1，置于5% CO2，37饱和湿度恒温箱中培养1.2.2 HG对HL-60细胞生长影响的形态学观察 将处于对数生长期的HL-60细胞，以5104个mL-1浓度接种于培养瓶中，同时加入不同浓度的HG母液，使培养液中HG的终浓度分别为：0，10，20，30，40，50molL-1，然后将培养瓶置于培养箱中培养分别在培养24h，48h，72h后取出细胞培养瓶，在倒置显微镜下观察拍照1.2.3 生长曲线

11、法测定HG对HL-60细胞增殖的影响 将浓度为5104个mL-1细胞接种与24孔板中，每孔接种1mL，每浓度设立3个平行组，接种的同时加入药物，培养液药物的终浓度分别为0，10，20，30，40，50molL-1将培养板置于培养箱中培养，每隔12h，取005mL台盼蓝染液与045mL细胞悬液充分混匀，染色5min后吸取适量细胞悬液，注入血细胞计数板小室，对活细胞计数，重复3次，取平均值以时间为横坐标（h），细胞数为纵坐标（104），绘制生长曲线1.2.4 Hoechst33258荧光染色法检测HG诱导HL-60细胞凋亡 取1105个mL-1浓度的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2mL，同时加入药

12、物，6个孔中药物的终浓度为0，10，20，30，40，50molL-1，分别于培养24h，48h，72h后取出，离心收集（500 rmin1），用预冷的PBS洗两次，甲醇固定10min，再用预冷的PBS洗三次，涂片晾干用10gmL-1的Heochst33258在室温避光下染色10min，蒸馏水冲洗3次，晾干后，荧光显微镜下观察并拍照（激发波长为340nm）1.2.5 DNA ladder电泳法检测HG诱导HL-60细胞凋亡 分别离心（800 rmin1）收集0，10，20，30，40，50molL-1浓度HG处理的HL-60细胞，用预冷的PBS洗两次，加入细胞裂解液（10 mmolL-1 Tr

13、is-Hcl，pH=8.0，10 mmolL-1EDTA，05%的TritonX-100），于50恒温水浴锅中消化2h后，取出离心（12 000 rmin1），取上清液在上清液中加入50 uL的RNaseA（20mgmL-1），在37下孵育1h后，加入5L的蛋白酶K（20mgmL-1），又在37下孵育1h后，取出离心10min（12 000 rmin1）上清液用 2.5 倍体积的异丙醇和 1/10 体积 0.5 molL-1 的 NaCl 溶液沉淀DNA，于20 下24h后取出，离心10min（12 000 rmin1），弃去上清液，沉淀用TE溶液溶解（10 mmolL-1Tris-Hcl，p

14、H=8.0，1mmolL-1EDTA），用15%琼脂糖凝胶在90V恒压下电泳25h，EB染色，UVI凝胶图像分析仪下检测，并用自动成像系统拍照1.2.6 流式细胞仪检测HG影响HL-60细胞周期及诱导细胞凋亡 将处于对数生长期的HL-60细胞，以5104个mL-1接种与培养瓶中，培养24h后，加入药物，终浓度为40molL-1于24，36，48，60，72h分别收集细胞，于4下75%乙醇中固定24h以上，取出后PBS洗两遍加入PI( 5105 gmL-1)在黑暗条件下染色30min，用流式细胞仪对其进行细胞周期和凋亡分析2 结果与讨论2.1 HG对HL-60细胞生长的影响如图2所示，当浓度为1

15、0，20，30，40molL-1的HG作用于HL-60细胞24h时，10，20，30molL-1的HG对细胞形态影响很小，与对照组相比细胞形态正常，有小细胞团的形成，但细胞增殖有逐渐降低的趋势；当40molL-1药物作用于细胞时，细胞形态改变，体积缩小，细胞表面皱缩，并可见明显的颗粒沉淀当同样药物浓度作用于细胞48h后，10molL-1细胞形态正常，细胞克隆形成细胞团，与对照相比没有明显区别；但当20和30molL-1HG处理时，细胞团明显变小，细胞数变少，说明细胞生长受到明显抑制；40molL-1使细胞形态完全改变，细胞数参考文献:1 南京中医药大学中药大辞典(下册) M 上海: 上海科学技

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