生物技术综合试验终稿(共20页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上生物技术综合试验目的：主要是通过本课程的学习，使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验技能的训练，熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围，加深对生物技术系列相关课程基本理论、基本技术原理的理解认识。实验一、质粒DNA的小量提取实验二、双酶切反应实验三、PET28-a质粒载体的胶回收实验四、引物设计实验五、目的片段的PCR扩增实验六、PCR产物的双酶切反应实验七、PCR产物的胶回收实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备实验十、重组质粒转化感受态细胞的实验实验十一、菌落PCR反应实验十二、IPTG诱导O

2、MP31和BLS融合基因的表达实验十三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验一、质粒DNA的小量提取一、 目的要求1、 掌握用试剂盒提取质粒DNA的技术2、 掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、 基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下

3、，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、 仪器、材料和试剂1.仪器：微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计2.材料：含有质粒的大肠杆菌DH5a3.试剂及溶液：LB培养基、葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤 1质粒DNA的提取1）培

4、养细菌：将带有质粒的单菌落，接种到LB液体培养基中，37oC，200r/min,过夜震荡培养；2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）3）取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干；4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（确保已加入RNaseA），用枪头混匀；5）向离心管中加入250l溶液P2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。6）向离心管中加入350l溶液P3，立即温

5、和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸出沉淀。12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇)，12000rmp离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9）重复步骤8。10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rmp离心2分钟，目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部

6、位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，温室放置2分钟，12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。 2用分光光度计测定质粒DNA的浓度五、问题讨论(1)提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，

7、可得到质粒DNA。(2)利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在26

8、0nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260/OD280是固定的，对DNA样品而言其值大约为1.82.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。六、试验结果 计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度和纯度。实验二、双酶切反应一、实验目的1.掌握双酶切反应的基本原理2.掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法二、实验原理 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三

9、类:类、类、类。类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种

10、限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 三、实验材料及试剂实验材料：实验一获得的PET28a质粒载体实验试剂：EcoR I 、Xho I、10x Hbuffer、灭菌水、冰、37水浴四、双酶切反应体系（20L）H buffer（10x）2L1LEcoR I1L

11、0.5LXho I1L0.5LDNA4L5LddH2O12L3LTotal20L10L五、实验步骤1) 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照体积由大到小的顺序加入上述溶液,再加入重蒸水使总体积为18l。2) 将管内溶液混匀后加入2l酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 3) 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 4) 每管加

12、入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。注：将加好的反应体系放入37恒温水浴锅中反应。如果是载体，则反映时间为56h，如果是DNA 则反应时间是12h。附：（A）（B）（C）BamH IHind 1xKEcoR IHind 1xmEcoR IBamH I1xKBamH IXho I1xKHind Xho I1xm实验三、PET28-a质粒载体的胶回收一、实验目的1.掌握琼脂糖凝胶的制备方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法3.掌握DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用二、实验原理 根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

13、DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基当中，在紫外激发下，发出荧光，即可确定DNA条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高，少知110ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量（%）线状DNA分子的有效分离范围（Kb）0.35600.61200.70.8100.90.57.01.20.46.01.

14、50.23.02.00.12.0 琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶试剂盒回收酶切产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填制到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH的条件下DNA可以再次被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。三、主要实验仪器和试剂主要仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。主要实验试剂：1、50×TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0）2、10×上样缓冲液（loading buffer）3、分子量标准 DNA Marker4、琼脂糖5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存）6、DN

15、A回收纯化试剂盒（AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）四、实验步骤 琼脂糖凝胶的制备：1、将洗净的电泳槽洗净，置于平整的台面上，并调节水平；2、用1×TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其溶解；3、待琼脂糖溶液冷却至60°C左右时，缓缓将琼脂糖倒入胶模中，厚度约5至7mm；4、插入梳子，静待琼脂糖凝固；5、将胶模放进电泳槽中，向电泳槽倒入1×TAE电泳缓冲液，没过胶约5mm；6、小心拔掉梳子，用20 ul移液器吸取DNA溶液（20 ul DNA 加 23ul 10×loading buffer），缓缓加入点样孔；并在最右边的点样孔加6

16、 ul DNA Maker；7、接通电源，（注意电源的正负极！）电泳至条带前缘到达胶的2/3左右，约2030分钟；8、电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，放入EB染色液中，染色6-8min，然后置于紫外灯下观察。酶切产物凝胶回收：1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量。（100mg凝胶，计100ul体积）（尽量缩短暴露UV灯下的时间！）2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A（600 ul），混合均匀后，于65°C 加热，直至凝胶完全熔化。3、加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B（300 ul）,混合均匀，当分离的DNA片段小

17、于400 bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。4、吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml 离心管中），12000r/min离心1 min，弃滤液。5、将制备管置回2 ml离心管中，加500 ul Buffer W1， 12000r/min离心30 sec，弃滤液。6、将制备管置回2 ml离心管中，加700 ul Buffer W2, 12000r/min离心30 sec，弃滤液。重复一次。7、将制备管置回2 ml离心管中，12000r/min离心1 min。彻底去除残余的液体。8、将制备管置于1.5 ml离心管中，在制备膜中央，加2530 ul 65°C Eluent或去离

18、子水，室温静置1 min。12000r/min离心1 min洗脱DNA。五、思考题：1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？实验四、引物设计一、实验目的掌握引物设计的方法和原理二、实验步骤1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用Primer Premier5搜索引物打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内

19、，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300500bp.点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引

20、物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在5570度之间，GC应该在4555间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有

21、时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该

22、序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物

23、的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3端的Delta G.3端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免

24、设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC需要控制在4060，而且上下游引物之间的G

25、C 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、GC method和2(AT)4(GC)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在5070度之间。第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。Analyze中，

26、有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。引物评价完毕后，可以选择FilePrint，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游

27、和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。三、注意事项：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置

28、导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中

29、使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。9.引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异

30、最好控制在2度之内。 10.密码子的简并，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。实验五、聚合酶链式反应（PCR）一 实验目的1 学习并掌握PCR基因扩增的操作方法2 理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性二 实验原理 设计出一对寡聚核苷酸引物可与目的DNA分子互补，以至于能被DNA聚合酶相向延伸，那么被该引物结合的摸板区就可通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增，这一过程被称为聚合酶链式反应。该技术1985年由Mullis及同事们设计并研究成功，其原理类似于DNA的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的寡聚核苷酸

31、引物经过变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍，该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必须工具。 PCR的工作程序如下：在第一个循环中，目的DNA在加热至95，60s左右的条件下分成两条单链；当降温至55（约30s）左右时，引物首先与模板杂交复性；退火后温度再升至72（60s-90s）以进行聚合反应，聚合反应要消耗反应混合物中的dNTPs，并需要Mg2+。第一次聚合反应中不同的目标分子从引物3末端开始扩增，不断对目标分子进行拷贝，新合成分子的长度可以各不相同。当温度再次升高到95，变性所有新合成分子的第二次循环开始。 每一对PCR引物长度约为18-30个核苷酸

32、，并且成对引物间的G+C含量应相似，以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。短的寡核苷酸的退火温度可用下列公式计算：Tm=2（A+T）+4（G+C），引物与目的序列的相应链退火，结果可通过向3端加核苷酸相向延伸，较短的片段较易扩增。三、实验材料及试剂1. 模板DNA（含有OMP31和BLS基因的PET28a质粒载体）2对应目的基因的特异引物310×PCR Buffer 42mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5Taq酶四、操作步骤 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     

33、;   10×PCR buffer               2.5 l        dNTP mix （2mM）             2 l      引物1（10pM）

34、                1 l      引物2（10pM）                1 l        Taq酶 （2U/l） &#

35、160;           0.5 l        DNA模板（50ng-1g/l）   0.5 l        加ddH2O至               

36、60;   25 l2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。程序：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，循环30次，最后在72 保温7min。3结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。五、PCR反应体系的组成与反应条件的优化  PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR

37、结果的好坏。 1反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200M时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。 2dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中

38、常用终浓度为50-400M的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。 3Taq DNA聚合酶酶：在100l反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降

39、低反应体积时（如20l或50l），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。 4引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则： 引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。 引物的3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基

40、数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。 人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/l较好。 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100M），保存于-20。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10M或20M的工作液。 5 模板：PCR对模板的要求不高，单

41、、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用g水平的DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。 6PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项 1PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。 2纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可

42、靠的结果，纯化的方法越简单越好。 3所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m滤膜过滤除菌或高压灭菌。 5试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 6试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 7PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。实验六、PCR产物的双酶切反应（同实验二）实验七、PCR产物的胶回收（同实验三）实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应一、实验目的 掌握酶连反应的条

43、件、原理二、实验材料及试剂实验材料：实验三得到的PET28a质粒载体、实验七得到的目的片段（Omp31和Bls）实验试剂：T4DNA ligase 、10xT4Buffer、ATP、灭菌水三、酶连体系：10xT4 Buffer1.0L目的DNA片段1.0L载体1.0LT4DNA ligase0.5LddH2O6.5LTotal10L 将加好的反应体系混匀后，放入16金属浴中连接3h。实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备一 、实验目的学习氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞二 、实验原理 人们发现用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。转化过程所用的

44、受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R、M表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。三 仪器、材料和试剂 1.仪器和材料: 恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、分光光度计、台式离心机、离心管、大肠杆菌BL21(DE)3 2试剂:（1）基本培养基 在三角瓶中，将

45、15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷却至55在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）。（4倍盐溶液：6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5gNaCl,1g NH4Cl,加水至250mL并调pH至7.4）。 （2）LB培养基（1L）:将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含卡那霉素的LB培养基，则将15克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55,向

46、其中加入1.5mL100mg/ml的卡那霉素。 （3）0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并高压灭菌备用。四操作步骤 氯化钙法a) 用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上，于37倒置培养1d-2d.b) 将单个菌落接种于10mL LB培养液的试管中，37振荡（200r/min）培养过夜。c) 向两个装有200mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入4mL过夜培养细胞，37振荡培养至光密度（OD600）值在0.5-0.6之间。（约需1h-2h）.d) 将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250mL离心瓶并置于冰上保持20min.

47、于4下离心10min,（8000r/min）,弃去上清夜。e) 将每份沉淀轻缓的悬于100mL冰冷的0.1mol/L MgCl2(Ph7.2)溶液中，按上述方法再次离心。f) 去上清夜，并将每一份沉淀轻缓的悬浮于20mL冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(Ph7.2)溶液中。g) 分装于微量离心管中，(每支1mL)，80储存备用。 注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。 2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在80几小时后感受性达到最高值，几个月内均能维持高水平的感受态。五.讨论 1.试剂的质量

48、与污染.所用的试剂如CaCl2等应是高质量的,且最好保存于干燥的暗凉处.整个过程需要注意防止杂菌和其他DNA的污染;所用器皿如离心管.分装用的微量离心管等一定要洗干净,最好用新的;并在整个过程中要无菌操作.少量其他试剂在器皿中残留或DNA的污染均会影响转化率.实验中凡涉及溶液的移取,分装等敞开实验器皿的操作,最好在无菌超净台中进行以防污染. 六.结果分析实验十、目的基因转化感受态细胞的实验一.实验目的:1.了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义. 2.外源质粒DNA转入受体菌感受态细胞并筛选转化体的方法.二.实验原理:连接反应中形成的重组子及其他质粒分子的混合体必须通过转入宿主细胞将它

49、们相互分离进而复制(克隆),人们发现用含Ca2=的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA,这一过程被称为转化(transformation).将转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体(transformation),即可能带有异源DNA分子的重组细胞.大肠杆菌的转化过程是将质粒分子溶液或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置,将混合溶液于42热处理1min-2min（一般90s）,会诱导质粒DNA分子进入细胞,提高转化效率.然后加适量生长培养基液于转化细胞,并在室温下培养,最终涂布于琼脂平板表面,培养至形成细菌单菌落.同一克隆中的所有细胞均起源于某一单独个体的分裂繁殖,因

50、此所有细胞具相同的基因型,这里不包括自发突变,只包括转化步骤中引入的质粒(换言之,即是克隆或克隆群).在单一亚克隆实验中,要求实验设计应充分体现重组子克隆的产率,例如可采用碱性磷酸酶处理载体.通常的筛选方法是分别从若干克隆中制备质粒DNA,然后用琼脂糖电泳进行分析.本实验以E.coli BL21（DE）3菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌使其处于感受态,然后PET28a质粒共保温实现转化. PET28a质粒带有卡那霉素抗性基因的特性.将经过转化的全部受体细胞进行适当修饰,在含卡那霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗卡那霉素的能力而死亡,转化体经扩增后,

51、可将转入的质粒DNA分离提取出来,用于电泳分析,限制型内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验.三.仪器、材料和试剂1.仪器和材料: 恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、分光光度计、台式离心机、离心管、大肠杆菌BL21（DE）3、PET28a质粒DNA 、Eppendorf管、移液器、液氮 2.试剂:（1）基本培养基 在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷却至55在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过

52、滤除菌）。 4倍盐溶液：6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5gNaCl,1g NH4Cl,加水至250mL并调pH至7.4）。 （2）LB培养基（1L）将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含氨卞青霉素的LB培养基，则将15克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55,向其中加入1.5mL100mg/ml的氨卞青霉素。 （3）0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)两者均调pH值至7.2并高压灭菌备用。 （4）TSS溶液:10%PEG 8000,5%DMSO,20mmol/L MgSO4,以上各成分溶于100

53、mLLB培养液中,过滤除菌(由于高压灭菌会使TSS液转化效果下降,PEG可以单独进行高压灭菌).四.操作步骤1)氯化钙法制备的感受态细胞的转化 1.将1ng-10ng质粒DNA加于1.5mL无菌离心管中,再用缓冲液(Tris10mmol/L,pH7.7,0.1mmol/L EDTA)将体积调至100mL置于冰上. 2.待感受态细胞在冰上融化后,向含有质粒DNA的离心管中加入200L,混匀并在冰上静置30min. 3.将离心管放入42水浴中90s对细胞进行热处理. 4.向上述试管中加入1mL预热(37)的LB培养液,于37下振荡培养(200r/min)1h. 5.将50L-100L上述培养液平铺

54、于含有合适抗生素的LB固体培养基上, 37培养过夜.五.讨论 (一)为提高转化率需考虑以下几个重要因素:1.细胞生长状态和密度.细胞生长密度不足或过高均会使转化率下降,一般以每毫升培养液中的细胞数在5x107个范围为好.要使用新鲜的培养液,否则效果不佳.受体菌生长状况可用分光光度计来测定,不同菌株的合适OD值是不一样的,因为OD值与细胞数值之间的关系随菌株的不同而异. 2.转化的质粒DNA的浓度和质量.转化率与所加DNA浓度在一定范围内成正比,但当加入的DNA量过多或体积过大时,则会使转化率下降.用于转化的质粒DNA应主要是cccDNA. 3.若在不该长出菌落的平板长出菌落,首先要考虑是否已失

55、效,若排除了这一因素,则说明实验有污染;如果长出的菌落相当于平板上长出的菌落而言,数量极少(一般在5个以下),则此次转化还算成功,可继续以后的实验;如果长出的菌落很多,则需设计对照实验,找出原因后,再重新进行转化. 4.本实验方法使用于E.coli各菌株,但同一菌株与不同质粒DNA的转化率是不一样的,有的重组质粒转化率会很低.(二) 转化是DNA扩增和在体内进行基因研究的关键步骤.转化有多种方法,常用的有氯化钙法,氯化铷法,一步法.与其他两种方法相比一步法很容易,它无需离心,漂洗,热处理以及特殊仪器(如电穿孔法).另外在PEG,DMSO和Mg2+存在的情况下可获得较高的转化率.感受态细胞在不做

56、任何处理的情况下在所在容液中可保存长达3个月以上. (三)一般认为冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入”感受态”,而热休克则使细菌的细胞膜张开,这样DNA得以进入细胞.迄今人们为提高转化率为这一技术进行了很多改进.本实验所介绍氯化钙是一种简便,快速的方法.使用本法进行转化,每微克超螺旋质粒(pGEM系列)可产生107个转化菌落. (四) 感受态细胞的质量可以通过测定某一特定样品的转化率来衡量,转化率定义为每微克用于转化的DNA在选择平板所形成的菌落数.这里DNA为纯质粒,通常是在克隆实验中的载体.转化率的变动幅度很大,可以从粗放转化程序的105个菌落/ug到精细转化程序高于108个菌落/ug.粗放转

57、化程序只适合将完整质粒转入新的宿主菌,而精细转化程序所精心制备的感受态细胞可用于文库的构建.约105个菌落/ug的转化率足以满足简单克隆实验. (五) 一般培养液中必须含有原平板筛选转化所用的抗生素,以维持对质粒有无的选择.部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失,因为那些偶然丢失了质粒后以耗能小的方式将会淘汰那些携带质粒的细菌.扩增的质粒可以用小量法从培养基中制备.通常在这一时刻要制备培养物的保存液,方法是将培养物分散于含有一定的甘油溶液中冻存,甘油的作用是保护细胞免受冰晶形成的伤害(甘油贮液).这样的贮液能使同一菌株(质粒)在必要使被接种增殖并再次制备这样的贮存液保存.六.结

58、果分析实验十一、菌落PCR反应一、实验目的 掌握应用PCR的方法大量扩增阳性克隆子的技术。二、实验原理 将细菌在无菌水中煮沸5分钟，其他同质粒和基因的PCR反应。三、实验仪器、材料及试剂实验仪器：PCR仪、微量移液管、0.5mlEP管、小枪头、实验材料：上述筛选试验中获得的筛选平板上的单菌落实验试剂：PCR所需各种试剂四、实验步骤 1.用200L的枪头活无菌牙签从平板上挑取菌落，选取直径大于1mm的菌落，如要保存菌落拷贝，移动前要轻触平板； 2.将菌转至装有50L灭菌水的PCR管，震荡使细胞分散； 3.将管置于沸水活99加热5min，使细胞裂解，DNase变性； 4.12000/min离心，除去细胞残片； 5.取10