PCR和ELISA在食源性致病菌检测中的应用

1、PCR 和 ELISA 在食源性致病菌检测中的应用摘要 阐述了 PCR和ELISA这两种技术在食源性致病菌检测中的研究，并对这两种方法特点与应用进行了探讨。关键词 PCR; ELISA ;致病菌检测中图分类号 TS207.4 文献标识码 A 文章编号 1007-57392008)09-0182-03近几年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的 致病菌污染状况进行了连续的动态监测，结果表明，微生物 源性食物中毒占居首位， 高达 39621 。随着食品工业的 发展以及对食品安全的重视，传统分析方法已经远不能满足 食品检测的需要，迫切需要灵敏度

2、更高、特异性更强、简便 快捷的食品安全检测技术和方法。因此，近年来世界各国的 许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，改进 和开发了一些快速的检测技术和方法。其中聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA )以其简便、快速、 灵敏、成本低、检测谱广等特点在食源性致病菌检测方面的 应用也越来越受到人们的青睐。1PCR 技术PCR 技术即聚合酶链式反应，也称无细胞克隆系统，是1985 年诞生的一项 DNA 体外扩增技术， 该技术自问世以来， 就以惊人的速度广泛地应用于生命科学的众多领域。目前在 食品工程领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的应 用也越来越受关注。1.1PCR

3、 技术原理PCR 是在体外合适条件下，以单链 DNA 为模板，以 1对人工合成的寡核苷酸为引物，在热稳定 DNA 聚合酶作用特异性扩增 DNA 片段的技术。 整个反应过程通常由 2040个 PCR 循环组成，每个 PCR 循环包括高温变性低温复性 适温延伸 3 个步骤。方法是：首先将靶 DNA 双链加热变性 为单链，然后加入 2 段人工合成的与靶 DNA 两端邻近序列 互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物；该 对引物与互补的 DNA 单链碱基互补结合后， 在有 DNA 聚合 酶和 4 种 dNTPs 底物存在的情况下， 引物沿模板 DNA 链（靶DNA单链）按5 末端向3末端方向延

4、伸，自动合成新的DNA 双链，新合成的 DNA 双链又可作为扩增的模板，继续 重复以上的DNA聚合酶反应。经过2040次循环，可将靶DNA 序列扩增近百万倍。1.2PCR 技术在食品致病菌检测中的应用利用 PCR 检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细 胞，然后裂解细胞，使细胞中的 DNA 释放，纯化后经 PCR扩增细胞靶 DNA 的特异性序列，最后用电泳法或特异性核 酸探针检测扩增的 DNA 序列。1.2.1 单核细胞增生李斯特氏菌的检测。 单核细胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes ， LM )是食品卫生中的重要

5、病原菌，多通过食品经口感染，被列为 20 世纪 90 年代食品中的四大病原菌之一。过去对食品中LM 进行检测时，克隆培养的标准方法需要 34周的时间才能得出结果。国外已广泛将 PCR 技术用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌， 国内 的报道也不少。杨百亮等( 1994)通过条件优化，建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒 2 ，并在同年 报道了以I对位于该菌P -溶血素基因内的26bp寡核苷酸为引物，用 PCR 对市售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌 的检测3。金大智等运用实时荧光 PCR ( Real-time PCR)技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引 物和探针

6、的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污 染的可能性。对 26种病原菌进行的检测结果表明，用实时荧光 PCR 法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感， 特异性更高。1.2.2 金黄色葡萄球菌的检测。金黄色葡萄球菌肠毒素(SE )可引起人类中毒，其内毒素中毒休克综合症毒素ETA、(TSST1 )可引起中毒休克综合症，产生的脱皮毒素(ETB )与一系列脓疱性葡萄球菌感染有关。金黄色葡萄球菌 肠毒素是一种可溶性耐高热蛋白，根据血清型别不同，分为A、B、C、D 和 E 等 5 个型。所有的金黄色葡萄球菌肠毒素 都有一个相同的基本结构即含有二硫键和单一多肽链。其中 肠毒素D ( SED)的基因位

7、于质粒上，由 256个氨基酸残基组成，基因长为 774 个碱基对，已全部定位。目前金黄色葡 萄球菌肠毒素 D 的鉴定主要是依赖于免疫学技术， 该技术需 要细菌纯培养和制备肠毒素，试验周期长、步骤繁多，使其 在食品卫生学鉴定时受到限制， 近年来 PCR 技术的发展为食择SED基因的第360381对碱基为上游引物，第 654 675品病原微生物的鉴定提供了新的途径。云泓若等(1999)选对碱基为下游引物，应用PCR技术扩增出SED基因的316bp 长的 DNA 片段，并建立了直接利用细菌裂解液作为模板的PCR 方法 4。1 .2.3沙门氏菌的检测。 Nguyen 等根据肠炎沙门氏菌 c7克隆株具有

8、的属特异性序列( 2.1kb HindIII 片段)设计出 1对引物，能快速地检测出肉食品标本中的沙门氏菌，检测的 敏感性和特异性均为 100，这保证了检测的准确性。沈孝民用 PCR 技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污 染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，并可在1d之内完成5。1.2.4 致病性大肠杆菌的检测。 肠毒素大肠杆菌 （ETEC）是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病因之一。该菌可产生2种肠毒素：热敏性肠毒素LT 和耐热性肠毒素ST,它们均能弓起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱并导致腹泻。ETEC 弓起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。

9、PCR 技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。王嘉福等（1997）根据LT和ST基因序列，合成了引物，并对128份食品样品中ETEC肠毒素基因（LT和ST）片段进行扩增，结果共有15个样品被检出污染了 ETEC，并且证实用于扩增的引物具有高度特异性6。卢林耿等（1999）用PCR法检 测大肠杆菌 0157 的志贺样毒素基因，试验表明弓物具有高 特异性 7 。1.3PCR 技术存在的主要问题及展望旦有极1.3.1 污染问题。 PCR 是一种极为灵敏的反应，少量外源性 DNA 污染，就可能出现假阳性结果，所以在操 作时必须加以注意。1.3.2 假阴性问题。食品是复杂的反应基质，影响

10、PCR反应的因素很多，如果不能有效排除各影响因素的干扰，很 可能出现假阴性结果。 此外，如果在PCR操作过程中各种试 验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结 果。对于这些问题必须有充分的考虑和排除措施。1.3.3 引物设计及靶序列选择。 引物的设计及靶序列的选择是决定 PCR 结果的关键因素， 引物不同则扩增物不同， 果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低PCR 检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而，必须对 扩增序列有充分的了解，并规范 PCR 实验室操作技术。1.3.4PCR 技术应用展望。尽管还存在着一定的问题，但由于 PCR 技术可以快速特异地扩增任何期望

11、的DNA 片断和目的基因，因而在食品检验领域有重要的实际应用价值。相信随着该技术的进步普及、发展和完善， PCR 技术将会得到更加普遍地应用和发挥更大的作用。2ELISA 技术ELISA 是一种非放射性标记免疫分析技术。20 世纪 70年代初，由 Engvall 及 Van Weemen 等在放射免疫分析的基础 上建立起来的一种非均相的酶免疫检测技术。2.1ELISA 原理ELISA 的基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免 疫学反应，免疫复合物所携带的酶分子可将特定的底物分子 转化为具有特定颜色的化合物，并由颜色的深浅反映样品中 抗原或抗体分

12、子的量。该方法具有灵敏、特异、快速、稳定 以及易于自动化操作等特点。2.2ELISA 技术在食品致病菌检测中的应用2.2.1 沙门氏菌的检测。田银芳等 8 应用直接 ELISA 方法对 350 份奶样进行沙门菌的检测。与常规方法相比，该方 法的敏感性和特异性分别为 100和 99.7。张艳红等 9 则 利用单克隆抗体建立了一种竞争 ELISA 方法，与国标法相比 灵敏性、特异性分别为 94.4和 97.7。杨静等 10 利用 2株单抗建立的直接 ELISA 方法对沙门菌属有高度的特异性， 且对 A-F 群代表菌株的最小检出量为 1 0cfu/L 。这充分展示ELISA 的特点，而且显示出与国标

13、法相比的优势。另外，还 有研究者将其他分离技术与 ELISA 结合起来以缩短检测周 期和降低检测限。 Mansfield LP 等11将免疫磁珠分离技术与ELISA 联合起来建立一个检测系统。 该系统对生鸡肉和饲料的检测限为2X 103cfu/25g，整个检测过程耗时不足27h,其中包括 18h 传统的前增菌和 6h 葡萄糖营养肉汤培养的样品预处理过程；而传统方法需要7296h。这对于快速检验是个很好的尝试。2.2.2大肠杆菌 0157的检测。大肠杆菌 0157 也是严重危害人类身体健康的食源性致病菌，可导致人畜死亡。赵志晶等研究获得了抗肠出血性大肠杆菌0157：H7 的多克隆抗体， 建立了用

14、于食品样品检测的双抗 ELISA 检测方法。 该方法对 纯培养菌液检测限为 103104cfu/mL ；只对 0157 菌株有特异性反应，对非 0157 菌株无交叉反应；经过增菌，鸡肉与 奶染菌样品中的大肠杆菌 0157 的检出下限均为 0.1cfu/gmL ）。 Norval JC 等 建立一种磁性微球结合酶联免疫吸附 试验，可以在 3h 内检测到 103cfu/mL 的大肠杆菌 0157：H7 。这极大地缩短了检测周期并降低了检测限。 SongJM 等建立种 ELISA 为辅助的高通量生物芯片系统，该方法大肠杆菌细胞检测限可达 3cfu/mL ，很大程度上提高了检测速率，降 低了检测劳动强

15、度。近些年，随着对检测灵敏度和检测时间 要求的不断提高， 人们又将 PCR 和 ELISA 方法结合到一起， 从而创造了 PCR-ELISA 技术。该技术是以 ELISA 特异性捕0157：获的微生物为模板进行 PCR 扩增， 从而提高检测灵敏度。 例 如， 2002年 Ge BL 等建立一种检测食品中的大肠杆菌H7 和产志贺毒素大肠杆菌的 PCR-ELISA 方法。该方法可以 检测到0. 1lO.Ocfu的产志贺毒素大肠杆菌和志贺毒素基因；还可以无需任何增菌即可在牛肉中检测到 105cfu/g 的菌 体。整个检测过程仅需要 6h,而且该方法适合于大规模监测和未来的自动化检测。2.2.3 单核

16、细胞增生李斯特菌的检测。 L monocytogenes是食源性致病菌中较为特殊的一种菌，该菌可以在食品低温 储藏过程中增长而且还可以导致死亡，所以各国对其的检测 显得更为关注。 1999 年， Enne de Boer 等7利用所建立的ELISA 方法经过前增菌后进行 L. monocytogemes 检测，其检测限达到 103105cfu/mL ，而且整个检测过程仅需要 16 24h。但是，Sewelld AM等建立一种检测食品中L monocytogenes 的高效快速的酶联荧光检测法，该方法的 菌体最佳检测水平为 104105cfu/mL ,包括孵育在内整个检 测过程仅需要52h。与传

17、统培养鉴定方法相比就大大缩短了 检测时间，加快了检测步伐。2.3ELISA 技术存在的主要问题及展望2.3.1ELISA 技术存在的主要问题。 首先该方法需要较多的仪器设备，如酶标仪、恒温箱及微量移液器等，不适宜基 层现场检测；其次，该技术的操作技巧性较强而且对关键点 的控制对结果影响很大。 在 ELISA 方法中重要的是第一步加 样，样品加入及混匀过程的误差会在以下的诸多操作中被逐 级放大，造成检测结果偏差较大甚至出现假阳性和假阴性。而且， 操作过程中易出现孔间交叉污染， 出现假阳性； 最后， 该方法检测限较高，达到 106cfu/L9 。因此，解决以上问题 将成为该技术的发展方向和推动力。

18、2.3.2ELISA 技术展望。 单一的免疫学检测技术检测限较高是困扰该方法推广应用的关键因素。为了解决这个矛盾， 许多学者把其他方法与免疫学方法结合起来以提高检测灵 敏性，且大大缩短了样品检测周期。发明更灵敏的检测方法 或者发现新的检测靶位点也显得非常重要。同时，如何完全 地释放或暴露样品中食源性致病菌的靶位点成为降低检测限的一个突破口。研究开发高效的样品前处理方法便成为充分发挥免疫学检测技术优势的前提，也是免疫学方法在食源性致病菌检测中推广应用的重点。3 参考文献1 唐福勇我国食品安全面临考验主要是微生物污染N2 杨百亮,赵立平,史兰琴,等快速检测牛奶中单中国经济时报，2004-11-24

19、核细胞增多症李氏菌 PCR 试剂盒的研制 J 中国公共卫生，1994，10（7）：304-305.3 杨百亮，聂向庭，马海利,等应用 PCR 检测单核细胞增多症李氏菌的研究J.畜牧兽医学报，1994, 25 (4):353-358.4 云泓若，李月琴，周天鸿 PCR 技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素D基因J.暨南大学学报(自然科学版),999 ,20（ 5） ：84-87.5 沈孝民，涂书清用 PCR 技术检测动物产品中沙门氏菌的研究 J中国动物检疫，1997，14（2）：8-10.6 王嘉福，冉雪琴，吴拥军，等应用聚合酶链式反应检测食品中肠毒素大肠杆菌 J.食品科学，1997, 18 (1):43-45.7 卢林耿，卫国荣，周晓明，等 PCR 法检测大肠杆菌0157志贺样毒素J.上海医科大学学报，1999 , 26 （6）:451.8 田银芳，王翌明 ELISA 方法与国标法在检测鲜奶中沙门氏菌的比较 J 中国乳品工业，1998，26（ 5）：32-33 9 张艳红，杜元钊，吴延功肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立 J 中国动物检疫，2002，19（7）：25-2810 杨静，焦新安，文其