一种新型Zn_2_近红外荧光探针的研究

1、2007年第65卷第13期, 12291233化 学 学 报ACTA CHIMICA SINICAVol. 65, 2007 No. 13, 12291233* E-mail: zywuReceived December 15, 2006; revised January 12, 2007; accepted March 19, 2007. 国家自然科学基金(No. 20205004)和教育部科学技术研究重点(No. 106122)资助项目.1230化 学 学 报 Vol. 65, 2007近年来, 人们开始研究细胞内Zn2的测定方法和技术, 先后建立和发展了锌离子传感器、Zn2荧光探针、核磁

2、共振和微电极等多种方法. Zn2荧光探针法通常具有选择性好、灵敏度高、简便快捷等特点, 因而得到了迅速的发展, 是目前最常用的一种方法. 其中应用最广泛的是由Frederickson等5研究制备的N-(6-甲氧基-8-喹啉)-p-甲苯磺胺(TSQ)及其衍生物6,7. Zinquin是其中的衍生物之一, 已用于活体细胞内Zn2的检测6. 尽管这些基于喹啉的荧光探针都非常有用, 但是它们的激发波长都在紫外区, 检测过程对活体细胞的损伤较大, 同时也不能避免来自生物体本身的自发荧光, 因而并非理想的荧光探针. Hirano 等8,9图示1 TAEA-IR-780的合成Scheme 1 Synthes

3、is of TAEA-IR-780先后合成了ZnAF-1,ZnAF-2, ZnAF-1F, ZnAF-2F 等荧光探针, 经过不断改进, 在一定程度上改善了紫外光对活体细胞的损伤问题(激发波长492 nm, 发射波长 515 nm), 使活体细胞内的锌离子探测成为可能.近红外荧光探针发射波长在7001200 nm范围内, 具有较小的辐射能, 而且在该波长范围内生物分子自身荧光较弱, 可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度, 因而受到很多学者的重视. 本文以IR-780为原料, 合成了一种用于检测Zn2的新型近红外荧光探针, 可避免活体细胞的损伤, 降低生物体自身的荧光背景, 为进一步改善Zn2的

4、活体检测提供了可能.压蒸馏后得蓝色固体, 再次以V(CH3CH2OH) V(CH3COOCH2CH3)14的混合溶剂为洗脱剂过碱性Al2O3柱进行纯化, 减压蒸馏后, 得蓝色固体. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) : 0.91.8 (m, 38H), 2.3 (s, 2H), 2.45 (s, 2H), 3.43.8 (m, 4H), 4.04.3 (m, 3H), 5.3 (s, 3H), 5.65.8 (m, 1H), 6.98.2 (m, 8H); ESI-MS: calcd 649.97, found 651.3.1.4 TAEA-IR-780荧光探针对Zn2的荧光响应

5、 1.4.1 TAEA-IR-780贮备液的配制称取7.5 mg TAEA-IR-780, 溶于0.965 mL二甲亚砜(DMSO)中, 配成10 mmolL1的贮备液备用. 取60 µL 10 mmol L1的贮备液, 稀释至10 mL, 得0.06 mmolL1待用液.1.4.2 羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液的配制称取HEPES 2.38 g, NaNO3 0.085 g, 配制100 mmolL1的HEPES缓冲液(pH7.4)备用. 1.4.3 测量过程取2.8 mL的HEPES (pH7.4, I0.1), 加入0.06 mmolL1的待用液50 µL

6、 (TAEA-IR-780的最终浓度为1.0 µmolL1), 不同浓度的Zn2溶液 50 µL, 检测荧光强度. 测量荧光强度时, 激发波长为683 nm, 狭缝宽度为5.0 nm/5.0 nm.1 实验部分1.1 仪器和试剂FL3-P-TCSPC荧光检测仪(美国JY公司), 激发/发射检测狭缝为5.0 nm/5.0 nm.IR-780 (98%, Aldrich), TAEA 三(2-氨乙基)胺, 98%, Aldrich, HEPES (羟乙基呱嗪乙硫磺酸, 98%, Al-drich), ZnSO47H2O (99.5%, 天津市大茂化学试剂厂), 其余试剂均为分析

7、纯. 1.2 溶剂的纯化和干燥量取50 mL的溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF), 用5 g KOH干燥10 h之后, 减压蒸馏, 5 mL初始馏分不回收, 得到纯净无色的DMF溶剂, 并加入5 g KOH干燥待用. 1.3 IR-780的TAEA衍生物(TAEA-IR-780)荧光探针的合成TAEA-IR-780的合成如图式1所示. 称取IR-780 40 mg, 量取TAEA 70 µL、无水DMF 10 mL, 加至 100 mL 的三颈烧瓶中, 升温至80 , 在N2氛围下搅拌反应4 h. 冷却后, 减压蒸馏, 得蓝黑色固体. 将该固体溶解在 CH2Cl2中, 以V(CH3C

8、H2OH)V(CH2Cl2)114的混合溶剂为洗脱剂, 过碱性Al2O3 柱, 收集蓝色组分. 减2 结果与讨论2.1 TAEA-IR-780的荧光光谱特征IR-780是一种三碳菁近红外荧光染料, 其激发波长为780 nm, 发射波长为804 nm, stokes位移较小. 根据Peng等10报道, 当三碳菁被含有氨基的基团取代后, 其吸收波长将会蓝移, stokes位移将会增大, 其原因为分子内电荷转移(ICT). 我们用多氨基的TAEA基团取代No. 13唐友云等：一种新型Zn近红外荧光探针的研究21231了IR-780分子的氯原子, 合成了TAEA-IR-780并研究了其荧光特性. 图1

9、为TAEA-IR-780的荧光光谱图, 从图中可以看出TAEA-IR-780的吸收波长出现了较大蓝移, 最大激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 其stokes位移亦比IR-780明显增大(为67 nm). 这些结果与Peng等10的报道氨基取代对IR-780分子的荧光光谱的影响基本一致, 而且增大的stokes位移亦为Zn2的高灵敏检测提供了良好的保障.一直线, 经计算斜率为0.9144, 取整数可得出m1.图2 荧光强度变化值对数lg(F/F)与Zn2浓度对数lgB的函数关系图Figure 2 A plot of lg(F/F) as a function of the lg

10、Zn2假设溶液中游离的TAEA-IR-780浓度Af与其总浓度At之比为, 检测到的荧光强度可表示为:图1 TAEA-IR-780的激发和发射光谱Figure 1 The excitation and emission spectra of TAEA-IR-780FFAf0 AtF0Fb(3)其中Fb是空白缓冲溶液的荧光强度, F0是TAEA- IR-780与Zn2全部配合以后的荧光强度, F是实际检测的荧光强度. 由于已得出m1, 与Zn2浓度B的关系可表示为:2.2 测定原理TAEA是一个强的金属配位基团, 在 TAEA-IR- 780溶液中加入Zn后, TAEA基团与Zn配位结合, 假设

11、Zn与TAEA-IR-780配位生成mn的配位化合物, 可认为Zn2(B)与TAEA-IR-780 (A)反应存在以下平衡:KAB mBnAnm222n1 1nKAn1Bm(4)(1)图3中5条曲线是分别用不同n值和K值代入公式(4)计算而得出. 从图中可以看出, mn为11, K为9.65×105的曲线与实验数据最为吻合, 可见TAEA-IR- 780与Zn2是通过11配位结合. 根据配位基团TAEA的分子结构特点, 可推测其与Zn2形成了稳定的四配位化合物, 实现对金属离子的选择性结合. TAEA-IR- 780的配位作用如图式2所示. 该探针的作用机理可能是TAEA-IR-78

12、0中与IR-780直接相连的N原子与金属离子配位致使分子极化状态改变, 从而影响分子内电荷K是配位反应平衡常数. 根据修正的Stern-Volmer方 TAEA-IR-780的浓度程11推导出荧光强度信号的改变、A及Zn2的浓度B三者之间的关系可表示如下：FF0KAn1Bm F设FF0F, 代入上式并取对数得：转移, 导致荧光强度增加. Flg(lgK(n1)lgAmlgB (2) 实验考察了Zn2配位作用对探针的荧光特性的影F响, 在µmolL1的TAEA-IR-780溶液中分别加入不同F0和F分别表示空白溶液的荧光强度和加入Zn2后的浓度的Zn2溶液并测量了其荧光发射光谱(图4)

13、. 从图F荧光强度. (2)式说明：以lg()对lgB作图应是一条 中可以看出, Zn2浓度在(1.0×1091.66×105) molL1F范围内, 荧光强度随Zn2浓度的增加而明显增加. Zn2斜率为m, 截距为lgK(n1)lgA的一根直线. 图2为检测下限可达1.0×109 molL1 (由空白值的3倍标准F2实验所得荧光强度变化值对数lg()与Zn浓度对数偏差确定), 显示了较高的检测灵敏度. FlgB的函数关系图. 从图中可以看出函数关系曲线为1232化 学 学 报 Vol. 65, 2007图3 相对荧光强度对lgZn2的关系曲线Figure 3 R

14、elative fluorescence intensity as a function of lgZn2The curves fitting the experimental data were calculated from Eq. (4). (1) mn31, K8.98×1017; (2) m n21, K9.31×1011; (3) mn11, K9.65×10; (4) mn12, K9.64×10; (5) mn13, K 1.93×1018 Data points experimentally obtained511图4 TAE

15、A-IR-780 与不同浓度的Zn2作用后的荧光光谱图 Figure 4 Fluorescence emission spectra of TAEA-IR-780 in the presence of different concentration of Zn2(1) 0; (2) 1.0×109; (3) 1.0×108; (4) 1.0×107; (5) 2.0×107; (6) 4.0×107; (7) 1.0×106; (8) 8.33×106; (9) 1.66×105 molL1(ex683 nm)图5

16、 pH值对荧光强度的影响Figure 5 Effect of pH on the fluorescence intensityIF/F0F/F0, F0 was the blank value of fluorescent intensity; F was fluorescent图式2 TAEA-IR-780与Zn2的配位Scheme 2 The coordination of TAEA-IR-780 and Zn2intensity after adding Zn2 (the final concentration of Zn2was 1 µmolL1)2.4 干扰测定为了研究该荧

17、光探针的选择性能, 考察了一系列生物体系中常见金属离子的干扰情况, 检测结果如图 6所示. 由于与TAEA的配位能力很弱的原因, 在Na, K, Ca2, Mg2等碱金属和碱土金属离子的存在下, 该荧光探针都没有明显的响应. 而在过渡态金属阳离子Co2和Ni2的存在下, 荧光强度有少量的增加, 其原因可能是TAEA-IR-780可与这些过渡态金属阳离子亦可形成配合物有关, 但其增加值显著小于探针对Zn2的响应值. 而Fe3, Mn2和Cu2等离子的存在会引起荧光强度下降, 可能是这些金属离子可引起荧光淬灭. 结果显示该探针对Zn2具有良好的选择性, 抗干扰能力强, 有望用于生物活体检测.2.3

18、 pH值对荧光强度的影响TAEA-IR-780作为Zn的选择性荧光探针主要基于TAEA的配位作用, 而溶液pH值的大小会影响TAEA氨基的离解状态, 改变TAEA的配位能力, 进而影响TAEA-IR-780的荧光响应. 我们测定了不同pH值的HEPES缓冲溶液(100 mmolL1, I0.1)对荧光强度的影响(图5). 结果显示, 在中性pH范围, pH值对TAEA-IR-780的荧光响应的影响较小, 在pH7左右时, 相对荧光强度具有最大值. 而生物活体样品的检测一般在pH7.4的条件下进行的, 因此选择 pH7.4的HEPES缓冲溶液来进行所有的实验.2No. 13唐友云等：一种新型Zn

19、近红外荧光探针的研究21233References1 Berg, J. M.; Shi, Y. Science 1996, 271, 1081.2 Koh, J. Y.; Suh, S. W.; Gwag, B. J.; He, Y. Y.; Hsu, C. Y.;Choi, D. W. Science 1996, 272, 1013.3 Frederickson, C. J.; Hernandez, M. D.; McGinty, J. F. BrainRes. 1989, 480, 317.4 Yeiser, E. C.; Lerant, A. A.; Casto, R. M.; Leve

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