植物原生质体融合技术的研究进展

1、46湖北中医学院学报2008年3月第10卷第1期JournalofHubeiCollegeofTCMMarch120081Vol110,No11【生物技术】植物原生质体融合技术的研究进展徐文锦,刘湘,宁勇22(11湖北中医学院2005级硕士研究生,湖北武汉430065;21湖北中医学院医学检验与技术系,湖北武汉430065)关键词:生物技术;植物原生质体;融合技术中图分类号:Q946文献标识码:A文章编号:1008-987X(2008)01-0046-03原生质体融合(protoplastfusion),亦称细胞融合(cellfu2sion)体细胞杂交(somatichybridization

2、)超性杂交(para2sexualhybridization)或超性融合(parasexualfusion),是指不同根据不同的情况而定。113酶制剂游离原生质体常用的酶有纤维素酶CellulaseOnozukaR-10,半纤维素酶Hemicellulase,果胶酶PectinaseY-23和离析种类的原生质体不经过有性阶段,在一定条件下融合创造杂种的过程1。原生质体融合可避免受精作用中的种的特异性配子酶MacerozymeR-10等,其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。不同植物材料选用哪种酶较好取决于所用细胞和组织的来源。近年来讨论的焦点是开发一种微生物型的纤维素酶和果胶酶用于原生质体分离14。

3、114培养基识别反应,有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限2。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。自1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后3,Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株4;1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株5年2jimura6BKM8p培养基等,其它培。利用KM8p经V-KM已成功地培养了200多种原生,是目前适用范围较广的原生质体培养基15。无机盐是培养基的主要成分之一,其中氮源研究较多。罗建

4、平等16在原生质体培养中发现高浓度NH4+抑制原生质体分裂。现常用有机氮如谷氨酰胺水解酪蛋白等作氮源,来提高原生质体的分裂频率17。在酶解和初培养时,由于原生质体无细胞壁,培养基保持相对较高的渗透压是必要的。随着原生体培养时间的延长,可逐步降低渗透压以提高细胞的耐受力18。常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好,可获得较高的植板率,且对细胞毒害也小19。原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。不同植物的原生质体培养,对激素的浓度要求差异很大,且生长素和细胞分裂素的配比也不尽相同20。原生质体培养基的pH值一般为516-518。但水飞蓟原生质体培养中适当提高pH值至610-612,则有利于原生质体

5、分裂21。115培养密度,许多种内、种间、系或杂种植株。的不断改进,。植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。1原生质体的分离和培养111起始材料起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响7。叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏。许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片8。此外,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织,悬浮培养物和体细胞胚等,均可作为分离原生质体的材料。如Ma等报道,在禾本科植物中,胚性细胞悬浮物是很好的分离原生质的材料9。但是,采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养,才能达

6、到分离原生质的状态;而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量10。同时,基因型直接影响原生质的分离培养效果,不同基因型分离的原生质体产量和活力差别很大11,并直接影响原生质体植株再生12。112材料的预处理原生质体对培养密度较为敏感。密度过小,原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡;密度过高,造成营养不良,再生细胞团很小,而且很快停止生长。在一定范围4内,原生质体具有较强的恢复分裂能力,一般密度以5×101×10ml为宜116培养方法5-122。许多研究者报道,酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。Power等13报道,酶解以前对材料进

7、行暗处理,有利于原生质产量的提高。在实验中,材料是否需要预处理要作者简介:徐文锦(19792),男,湖北中医学院2005级硕士研究生。原生质体的培养方法有液体浅层培养、琼脂糖包埋和看护培养等几种方式。有些植物适于液体浅层培养23-24,琼脂糖2008年3月第10卷第1期湖北中医学院学报March120081Vol110,No11JournalofHubeiCollegeofTCM47包埋培养有利于水飞蓟原生质体分裂21。另外,固液双层培养法也被应用于原生质体再生25。Schween等26报道,近年来一种装有玻璃纸层的培养皿被广泛用于原生质体的培养中。2原生质体融合不对称杂交只有DNA重组而没有

8、额外的染色体,胞质杂种避免了胞质基因供方的野生性状进入杂种其遗传性状稳定的遗传,也是有希望成为直接用于育种的有效途径35。已在农(烟草种间36)果(宽皮柑和构橘37)花卉(保春花和自Carlson等27在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来,原生质体融合技术在植物中已广泛应用。据不完全统计,到2003年初,已获得木本植物近100个组合的体细胞杂种植株7。211原生质体融合方法鄂春花38)中广泛应用。3杂种细胞的筛选和鉴定311杂种细胞的筛选在原生质体融合后的群体中,有融合体、未融合体、多元融合体和嵌合体,杂种细胞的筛选就是从中区分出预期的融合重组类型。目前主要的筛选方法有3种:(1)突变

9、细胞互补选择法。包括遗传互补、营养缺陷互补、白化突变体之间互补以及生长激素的自主互补等。该方法的局限性在于突变体不易获得,而且有些突变体不易再生,所以尚未得到广泛应用;(2)早期原生质体融合的方法有NaNO3法、高pH-Ca2+法、2+PEG(聚乙二醇)法,后来逐渐发展为PEG与高pHCa、高pH相结合;20世纪80年代初又开始探索使用电融合法,并发展出一些其他方法,如微融合法。这些方法各有特点,目前广泛使用的是PEG法和电融合法。PEG法的融合频率可达10%15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体间的融合。在应用PEG进行融合时,重要的影响因素包括PEG的种类、纯度、浓度、处理时间及原生

10、质体的生理状况和密度等。近年来一些研究建议在PEG溶液中加入融合促进剂(伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜、链霉蛋白等),可有效提高原生质体的融合频率。该法有可能免除杂种细胞的筛选28。20世纪80年代初迅速崛起的一种细胞融合方法:电融合根据原生质体特性差异的机械选择法。例如根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。当以荧光特性作为根据时,可采用流式细胞仪来区分杂种细胞,该法不但准确,而且效率高(大约5×10个细胞/s)。用荧光化合物标记原生质体并不影响细胞再生植株的能力39,但由于仪器价格昂贵,使用者还很少;(3)。一般用碘乙酰胺)(I),单独培;,大部分染色体,;只有融合体

11、发生互补作用才能生长,从而挑出杂种。用此法筛选已有很多成功的例子40。312杂种细胞的鉴定法,是目前最流行的物理诱导融合方法29。电融合法有2骤:(1)(014115MHz,100250V/c线方向泳动,;(2)(一般为3×sel,1013KV/cm)来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。该方法获得再生植株后,必须进一步证实杂种的真实性并了解它与亲本的联系与区别。除了传统的形态学、细胞学及生化方法得到了继续发展外,近年来基因组DNA的RAPD(随机扩增多态性)RFLP(限制性片段长度多态性)AFLP(扩增片段长度多态性)和SSR(简单重复序列)分析广泛应用于对称或不对称杂种细胞鉴定41

12、。4展望对细胞没有毒害作用,并且操作简便,融合同步性好,可在显微镜下观察融合的全过程,整个过程中的参数容易控制。至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。影响电融合的效果主要是电压大小持续的时间和原生质体的尺寸pis等3130。DeFilip2比较豌豆原生质体的电融合和化学(PEG法)融合后发现,电融合在保持原生质体的活力,减少细胞膜的损害和原生质体的畸变破裂及细胞器的融合等方面都要好于化学融合。但是电融合法需要昂贵的电融合仪,因此目前仍不如化学法适用普遍。Schweiger32虽然对植物原生质体的研究取得了很大的进展,但是利用原生质体技术改良高等植物的遗传性状并将之运用于生产实践中还有很大距

13、离。今后的任务为:(1)进一步扩大原生质体培养材料的种类及基因型。虽然在一些蔬菜及豆科的牧草上已经取得了一些进步,但是对高等植物原生质体的培养中有重要经济价值及药用价值的植物种类的研究相对较少,这是限制高等植物遗传操作开展及其在生产上应用的原因之一;(2)加强对原生质体再生植株无性系变异的细胞遗传学研究,比如核质关系、不亲和性、细胞分裂的调控及细胞全能性的机制、遗传物质的重组等生物学基础理论的研究;(3)选择应用先进的融合方法进行多种方式的融合,除对称融合外,还要注意不对称融合的研究。今后在进一步加强原生质体培养基础理论研究时,应将重点放在利用原生质体融合技术进行遗传性状的改良,以获得优良性状

14、的个体并通过无性途径固定下来。参考文献:1张献龙,唐克轩1植物生物技术M1北京:科学出版社,200511241把电融合法与微培养法相结合,建立了单对原生质体融合技术程序,这是融合技术上取得的最突出的成就,不仅改进了融合方法,而且是两亲本间一对一融合,有可能解决融合细胞的选择问题,是一种有前途的技术体系。目前正在研究用电脑控制进行自动化操作,以提高操作效率。Li等33建立的激光融合法在融合烟草原生质体时避免了亲本原生质体中叶绿体分布的影响,是近年来比较新的一种方法,但目前研究不多。212原生质体融合的方式原生质体的融合方式常见的有两种:对称融合和非对称融合。通过这两种融合方式可产生3种类型的杂种

15、:对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。另外还有一类杂种叫异质杂种。同时,还有配子-体细胞融合和亚原生质体-原生质体融合34。48湖北中医学院学报2008年第10卷第1期再生的初步研究J1河南农业大学学报,2001,35(3):2212224124赖钟雄,陈振光1龙眼胚性细胞悬浮培养再生植株J1应用2石俊英,牟彩萍,向凤宁,等1西洋参和胡萝卜体细胞融合培养杂种鉴定及愈伤组织中人参苷Rb1含量分析J1山东中医药大学学报,2003,27(6):448245113CookingEC1MethodfortheisolationofplantprotoplastsandvacuolesJ1Nature,196

16、0,(187):927292914NagataT,TakebeI1Cellwallregenerationandcelldivisioninisola2tedtobaccomesophyllprotoplastsJ1Planta(Berl),1970,(92):301230815VardiA1Citruscellculture:isolationofprotoplast,plantingdensity,effectofmutagensandregenerationofembryosJ1PlantSciLett,1975,(4):231223616FujimuraT1Methodofproduc

17、ingricecybridcellsJ1PlantTissueCultureLetters,1985,2(2):7427517金晓玲,何平1木本植物原生质体培养与融合研究进展J1272625与环境生物学报,2002,88(5):48524911OchattSJ,ChevreauE,GalletM1OrganogenesisfromPasseCras2sane,and,OldHome,pear(PyruscommnisL)protoplastsandisoenzymatictrueness-to-typeoftheregeneratedplantJ1TheorApplGenet,1992,(83

18、):10321081SchweenG,HoheA,KoprivovaA,etal1Effectsofnutrients,celldensityandculturetechniquesonprotoplastregenerationandearlyprotonemadevelopmentinamoss,PhyscomitrellapatensJ1PlantPhysiol,2003,160:20922121Carlson,BeyondPO1haploidinCellandTissueCultureTechniqueforCerealCropImprovement1SciencePress,1983

19、,407-418128孙蒙祥,杨弘远,周嫦1用乙二醇诱导选定成对原生质体的融浙江师范大学学报(自然科学版),2003,26(1):5425918沈前华,杨柏云,郭金平,等1大花蕙兰原生质体分离的影响合J1植物学报,1994,36:4892493129CoralG1ElectrofusionofSacchavonmycescerevisiaeauxotropphicmu2tantsofidenticalmatingtypeusingalaboratory-madesystemJ因素研究J1江西农业学报,1996,8(1):3624019MaR,GuoYD,PulliS1Somaticembryo

20、genesisandfertilegreenplantregenerationfromsuspensioncell-derivedprotoplastsofrye(SecalecerealeL1)J1PlantCellRep,2003,22:3202327110陆荣生,韩美丽1木本植物原生质体培养研究进展J1广西1TurkishJournalofBiology,2003,27(1):125130MichaelR1Davey,PaulAnthony,Power,etal12004sivbsymposiumproutsidethecell":plantprotopons1InVitroC

21、ellJ林业科学,1998,27(4):1972201111NymanM,WallnA1Plantregenerationfromtrawberry(Fragaria×ananssa)12mesophyyllprotoplastsJ1Plantphysiol,(133):37523771Huancaruna-PeralesE,MomrtoplastsofappleJO1993,(34):71276113PowerJB,DaveyP,etal1Protoplastcultureandre2generation1In:GoodmanRM,ed1Encyclopediaofplantand

22、cropscienceM1NewYork:MarcelDekkerInc,2004,106521068114GummadiSN,PandaT1Purificationandbiochemicalpropertiesofmicorobialpectinases-areviewJ1ProccessBiochem,2003,38:9872996115焦瑞身1细胞工程M1北京:化学工业出版社,19941126116罗建平,贾敬芬,顾月华1沙打旺胚性原生质体培养优化及高363332BPlant,22121ppR,ZieglerH1Membranepermeabilitychan2ultrastructu

23、ralabnormalitiesduringprotoplastfusionJ1JplantPhysiol2000,156:62826341SchweigerHG1Individualselection,cultureandmanipulationofhigh2erplantcellsJ1TheorApplGenet,1987,23:76927831LiYM,GuanLJ,LouLR,etal1Laser-inducedtobaccoprotoplastfusionJ1SciChina,SerC:LifeSci1999,42:1222127134张献龙,唐克轩1植物生物技术M1北京:科学出版社

24、,20051132135李桂英,韩粉霞1植物不对称体细胞的研究进展J1核农学报,2003,17(6):44224461GuoWW,ChengYJ,DengXX11Regenerationandmolecularchar2acterizationofintergenericsomatichybridsbetweenCitrusreticulataandPoncirustrifoliataJ1PlantCellRep,2002,20:8292834137MizuhiroM,KenichiY,ItoK,etal1Plantregenarationfromcellsuspension-derivedprotoplastsofPrimulamalacoidesandPrimulaobconicaJ1PlantSci,2001,160:122121228138SuanYu-H,XueaQ-Zh,DingCh-M,e