猪肢体体外循中神经组织损伤和固有免疫的实验研究

1、猪肢体体外循中神经组织损伤和固有免疫的实验研究        【摘要】  目的: 观察体外循环灌注保存猪肢体12 h后神经组织病理改变和固有免疫系统的改变, 探讨固有免疫系统在体外循环灌注中对猪肢体神经组织的影响。方法: 实验分3组, 实验组: 随机取10头实验用landrace猪为实验对象, 取每头猪的1条前肢体进行实验, 经32体外循环灌注保存12 h; 对照组: 实验组猪的另一前肢放置于4冰箱低温保存; 再灌注组: 将2例对照组肢体体外循环灌注1 h。收集3组肢体神经组织、 冰冻神经组织样品, 进行

2、病理及补体C3b/c、 C4c和固有免疫抗体IgG和IgM抗体的免疫荧光强度的检测, 同时观测猪肢体跟腱反射。结果: 实验组猪的神经反射正常, 而对照组猪未引出神经反射, 再灌注组神经反射很弱。病理结果显示实验组神经组织有轻微的水肿, 免疫荧光染色补体C3b/c、 C4c和固有免疫抗体IgG和IgM抗体免疫荧光强度增强, 而对照组神经组织轻微水肿, 免疫荧光染色补体C3b/c、 C4c和固有免疫抗体IgG和IgM抗体免疫荧光强度没有改变, 再灌注组神经损伤明显, 可见水肿和无髓鞘现象。结论: 体外循环对肢体神经组织可能有保护作用。尽管体外循环也激活固有免疫, 但对神经组织仍有保护作用。 【关键

3、词】  体外循环 猪肢体神经组织 固有免疫 再灌注断肢的神经损伤的程度与肢体再植成功率有很大的关系, 如神经损伤较小, 断肢患者在身体恢复后感觉会很好, 并且运动灵活, 所以良好的保存神经, 是恢复肢体功能的关键因素之一1。神经系统和免疫系统紧密相连2, 免疫包括固有免疫和获得性免疫。固有免疫是近年来研究的热点。固有免疫系统包括补体系统、 NK细胞和巨噬细胞和固有抗体等。补体(complement, C):  是存在于人和脊椎动物血清中一组经激活后具有酶活性的蛋白质, 参与抗微生物防御反应、 免疫调节及缺血再灌注损伤等, 而C3是补体系统中含量最多、 最重要的一个组分, 它

4、是补体两条主要激活途径的中心环节, 有着重要的生物学功能, 因此对C3的研究日趋重视。C4也是补体系统中的重要分子, 在补体活化中起作用。固有抗体是指在没有任何抗原主动免疫的情况下, 正常机体内天然产生存在的一种免疫球蛋白。固有抗体在维护机体免疫状态平衡、 调节生理机能、 防御感染、 监视肿瘤等多方面具有重要的意义。人们研究肢体损伤与周围神经的关系3, 4, 我们通过断肢的股动脉和股静脉与体外循环机相连建立猪断肢模型来检测用12 h体外循环保存猪肢体对神经组织的影响, 观测补体和固有抗体的激活情况和神经组织的病理改变。1  材料和方法1.1  材料  landra

5、ce猪（10例, 平均质量是53.7 kg）, 购自瑞士 Inselspital,  兔抗人C3b/c、 C4c购自丹麦DAKO公司,  羊抗猪IgGFITC购自英国Abcam Limated公司, 羊抗猪 IgMFITC 购自英国AbD Serotec公司, 羊抗兔IgG(H+L)FITC 购自美国Southern Biotechnology Associated 公司。1.2  方法1.2.1  建立猪断肢体外循环保存模型和分组  10例landrace 猪, 肌内注射ketamine (20 mg/kg) 和xylazine (2 mg/

6、kg),  然后静脉内注射 midazolam (0.5 mg/kg) 和 atropine (0.05 mg/kg), 麻醉后, 切断猪两前肢, 一断肢做实验对象研究, 将其股动脉和股静脉与体外循环机相连, 使用Draeger respirator, 热缺血时间大约1 h, 肢体内灌注32血液保存液, 保存12 h, 此作为实验组; 另一断肢放 4冰箱低温保存, 作为对照组,  将两例对照组肢体12 h后体外循环灌注1 h做为再灌注组。1.2.2  标本的采取  收集两组猪前肢的神经组织, 实验组体外循环开始前收集的神经组织做为基础值。样本组织做冰冻切

7、片, 神经冰冻切片免疫荧光染色, 同时标本固定在40 g/L多聚甲醛中, HE染色。1.2.3  组织学和免疫荧光染色  猪神经组织固定在40 g/L多聚甲醛中, 包埋切成3 m切片, HE染色。冰冻组织切片切成5 m切片, 风干,  丙酮固定, TBS洗涤, 用一步直接和两步间接免疫荧光染色。所用抗体为兔抗人C3b/c、 C4c(DAKO, Denmark),  羊抗猪IgGFITC(Abcam Limated,  Cambrige, UK),  羊抗猪 IgMFITC (AbD Serotec,  UK), 已经证实人与

8、猪有交叉反应性; 二抗是羊抗兔IgG(H+L)FITC(Southern Biotechnology Associated,  Birmingham, AL,  USA), 切片用免疫荧光显微镜染色测定免疫荧光强度。1.2.4  统计学分析  实验组与对照组比较, 免疫荧光强度采用统计学软件SPSS10.0, 进行t检验, P<0.05认为有统计学意义。2  结果2.1  形态学及神经反射观察  12 h体外循环后实验组神经跟腱反射正常。实验组猪的神经反射正常, 而对照组猪未引出神经反射,  再灌注组神经反射

9、很弱。病理结果示实验组神经组织有轻微的水肿, 而对照组神经组织轻微水肿, 再灌注组神经损伤明显, 明显水肿, 严重的可见无髓鞘现象（图1）。图1  猪肢体神经组织的HE染色（×400）（略）A: 基础值; B: 实验组12 h体外循环后; C: 再灌注组.2.2  免疫荧光染色  C3b/c, C4c(图2)和固有抗体IgG, IgM染色(图3), 荧光染色强度分为5级, 0级无荧光, 1级微弱荧光, 2级明显荧光, 3级荧光明亮, 4-5级荧光强烈。12 h体外循环保存后补体较体外循环前明显增强: C3b/c基础值为0-1级, 12 h体外循环后为2-

10、3级, 对照组与基础值比较无明显变化, 为0-1级, 再灌注组荧光强度为3级; C4c 12 h体外循环2-3级, 较对照组（0-1级）和基础值（0-2级）含量明显增高, 再灌注组为3级; IgG基础值为0-1级, 12 h体外循环后为2-4级, 对照组为0-1级, 再灌注组为2-3级; IgM基础值为0-1级, 12 h体外循环后（实验组）为2-4级, 对照组与基础值比较无明显改变（0-1级）, 再灌注组为3级。图2  补体在猪肢体体外循环保存神经组织的荧光强度变化（略）图3  抗体在猪肢体体外循环保存神经组织的荧光强度变化2.3  统计学结果  C3

11、b/c 实验组免疫荧光强度为2.80±0.42, 对照组为0.90±0.32, P<0.05, 两组比较有统计学意义; C4c 实验组免疫荧光强度为2.70±0.48, 对照组为1.00±0.47, P<0.05有统计学意义; IgG 实验组为3.30± 0.67, 对照组为1.00±0.47, P<0.05有统计学意义;  IgM 实验组为3.00± 0.67, 对照组为0.90±0.56, P<0.05有统计学意义。1      

12、;   3  讨论    1960年就有报道成功再植断肢。最近随着显微外科的断肢再植已经成为常规的手术。但是目前影响再植断肢成功率的重要因素是断肢保存方法和缺血时间的长短, 运输途中常规的保存办法是将断肢浸入冰水中, 这种方法简单, 但是冷却不充分, 组织也可能因为断肢直接与冰屑接触而损伤到不可挽救的地步。另外临床上断肢缺血时间一般不超过6 h。超过6 h再的断肢将可能发生不可逆的改变, 严重的将可能失去断肢再植的机会。近年来, 人们一直致力于研究延长断肢保存时间有效的方法。DomingoPech等5研究9例犬肢体, 应用体

13、外循环灌注保存24 h, 发现仅有5的组织发生可逆性损伤以后, 人们开始重视应用体外循环灌注技术来保存肢体6。体外循环保存肢体可以使肢体在保存其间得到持续性血液灌注; 人工膜肺的应用可保证血液灌注液得到有效氧合, 从而使肢体得到非常有效的氧气供应, 避免无氧状态导致的乳酸及氧自由基产生所引起的肢体组织损伤; 并可对血液灌注液的各项指标进行及时检测, 根据血气结果调整酸碱电解质平衡和纠正代谢紊乱。神经的损伤程度直接关系到再植后肢体功能的恢复, 本实验的猪肢体体外循环保存12 h, 观测神经形态学改变和固有抗体的荧光强度的改变。    Nukada等7发现缺血再灌注后

14、神经组织有去髓鞘现象。病理结果显示12 h体外循环保存肢体后神经组织结构正常, 无去除髓鞘现象, 髓鞘质内有轻微的水肿, 尽管实验组和对照组比较无明显区别, 但是再灌注组神经损伤明显, 具有水肿和去髓鞘现象。12 h体外循环后实验组神经跟腱反射正常, 而对照组和再灌注组的神经反射弱或无。病理结果显示经过12 h体外循环后神经的损伤较小, 提示体外循环保存肢体对神经有支持保护作用。    固有免疫是机体与生俱有的抵御微生物或其他异物侵袭的第一道防线, 是机体在长期种系进化过程中形成的天然防御功能。固有免疫应答具有（1）无特异性, 作用广泛; （2）先天具备; （3）

15、初次与抗原接触即能发挥效应, 但无记忆性; （4）可稳定遗传; （5）同一物种的正常个体间差异不大等特点。研究表明固有免疫在缺血再灌注损伤发挥着重要作用8-10。补体是固有免疫系统中的重要部分, 在缺血再灌注时通过多种途径激活, 产生大量的活化片段, 这些片段在缺血再灌注损伤中发挥重要作用, 它们通过直接及对白细胞与内皮细胞的间接作用造成组织器官损伤。补体具有重要的生物学作用: (1)溶菌和溶细胞作用; (2)调理作用: 补体的调理作用是通过免疫复合物中的补体裂解片段与吞噬细胞表面相应的补体受体的结合实现的; (3)引起急性炎症反应: 补体裂解产生的小片段C3a、 C4a和C5a通过与受体相互

16、作用产生局部炎症反应等, 固有抗体在缺血再灌注损伤中也发挥着重要作用。抗体分子与抗原结合后活化补体, 使其更为准确、 集中、 有效地杀伤靶细胞并且介导NK和巨噬细胞的抗体依赖的细胞毒效应（ADCC）。本实验显示补体和先天性抗体在12 h体外循环灌注条件下被激活, 这将有助于进一步探讨固有免疫在其中的作用机制, 并将考虑用补体抑制剂进一步减弱体外循环引起的补体激活所致的组织损伤。【】  1 Navid Madershahian, Ragi Nagib, Jens Wippermann, et al. A simple technique of distal limb perfusion

17、 during prolonged femorofemoral cannulationJ. Cardiac Surg, 2006, 21(2): 168-169.2 Li M, Peake PW, Charlesworth JA, et al. Complement activation contributes to leukocyte recruitment and neuropathic pain following peripheral nerve injury in ratsJ. Eur J Neurosci, 2007, 26(12): 3486-3500.3 Ducic I, Me

18、sbahi AN, Attinger CE, et al. The role of peripheral nerve surgery in the treatment of chronic pain associated with amputation stumpsJ. Plast Reconstr Surg, 2008, 121(3): 908-914.4 Stone WM, Fowl RJ, Money SR. Upper extremity trauma: current trends in managementJ. J Cardiovasc Surg, 2007, 48(5): 551-555.5 DomingoPech, Garriga JM, Toran N, et al. Preservation of the amputated canine hind limb by extracorporeal perfusionJ. Int Orthop, 1991, 15(4): 289-291.6 Birnbaum DE. Extracorporeal circulation in noncardiac surgeryJ. Eur J Cardiothorac Surg, 2004, Supp