四、酶促反应动力学酶促反应动力学(kineticsofe

1、 四、酶促反应动力学 酶促反应动力学（kinetics ofenzyme-catalyzed reaction ）是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。 Michaelis 与与 Menten 发发展出展出酶动力学酶动力学MichaelisMentenNelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258（一）温度的影响 温度对酶促反应速度的影响具有双重效应。其一是当温度升高时，随温度的升高反应速度加快（温度系数Q10为1-2；每增加10 ，反应速度为原反应速度的1-2倍）；其二是当温度升高到

2、一定限度时，随温度的升高，酶发生变性而使速度降低。 说明：温度系数（tempperature coefficient）是指反应温度升高10度，其反应速度与原来的反应速度之比。 每种酶都有其最适温度，在温血动物提取的酶，其最适温度一般为35-40；植物的为40-50；某些细菌的酶可高达70 。 最适温度不是酶的特征性常数，随环境因素而变化。酶干燥状态下和低温下保存较好。最适温度T(二）PH的影响n在一定的在一定的pH pH 下下, , 酶具酶具有最大的催化活性有最大的催化活性, ,通通常称此常称此pH pH 为最适为最适 pH(optimum pH)pH(optimum pH)。a.a.过酸或过

3、碱影响酶蛋白过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。的构象，使酶变性失活。b.b.影响酶分子中某些基团影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一的基团或维持构象的一些基团）些基团）c.c.影响底物分子的解离状影响底物分子的解离状态态缓冲液体系缓冲液体系木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱脂酶胆碱脂酶胃蛋白酶胃蛋白酶PH影响酶活力的原因可能有以下几个方面 ： 1、过酸过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性失活。 2、PH影响底物分子和酶分子的解离状态。最适PH与酶活性中心结合底物的基团及参与催化的基团PK值有关，往往只有一种解离状态最有利于与底物结合，在此PH下酶活力最

4、高；也可能影响到中间产物ES的解离状态。总之，都影响到ES 的形成，从而降低酶活性。 3、PH可影响酶分子中另一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。 最适PH可因底物浓度、种类及缓冲液浓度不同而不同，而且常与酶的等电点不一致，所以该值也不是常数。动物：6.5-8.0；植物及微生物：4.5-6.5，但有例外。如胃蛋白酶为1.5；精氨酸酶为9.7 应当指出的是酶在试管反应的最适PH与它所在正常生理的PH并不一定完全相同。这是因为一个细胞内可能会有几百种酶。不同的酶对此细胞内的生理PH的敏感性不同；也就是说PH对一些酶是最适PH，而对另一些酶则不是，不同的酶表

5、现出不同的活性。这种不同对于控制细胞内复杂的代谢途径可能具有很重要的意义。三）酶浓度的影响 在酶促反应中，如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。如右图。 这种正比关系可由下式表示： V=KE 该式也可以由米氏方程推导出来。式中的K表示K3S/（Km+S）。注意：使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制物的粗酶制剂。（四）底物浓度的影响 1、底物浓度对反应速度的影响 底物浓度（substrate concentration）对反应速度的影响比较复杂。在一定的酶浓度下，如将初速度对底物浓度的关系作图，可以发现：当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应（first o

6、rder reaction）。随着底物浓度的升高，反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应（mixed order reaction）。若再增加底物浓度，曲线表现为零级反应（zero order reaction），这时尽管底物浓度还可以不断增加，但反应速度却不再增加，说明酶已被底物所饱和，反应速度达到了最大反应速度。如下图。 底物浓度对反应速度的影响 提高提高底物浓度增强酶活性底物浓度增强酶活性表現表現 2134567800 2 4 6 8底物浓度 mmole生成物浓度806040200S+EP(在固定時間內反應)2、米氏方程式 人们曾提出各种假说来解释上述现象，其中比较合理的解释是“中间产

7、物学说”。按此学说，1913年前后Michaelis and Menten在前人工作的基础上，作了大量的定量研究，积累了足够的实验证据，从而提出酶促动力学的基本原理，并归纳出一个数学表达式，即： v =VmaxS/（Km+S） 此式即为米氏方程式，它的前提是酶与底物的“快速平衡说”开始反应速度快，迅速地建立平衡。米氏方程式圆满地表示了底物浓度与酶反应速度间的定量关系。这就使“中间产物学说”得到了人们的普遍承认，现在一般称为“米氏学说”。 米氏方程最初是有Michaelis和Menten提出，然后有Briggs和Haldane又加以补充与发展。 其公式的推导： 按照酶被底物的饱和现象出发，依据“

8、稳态平衡”假说理论，推导如下： 米氏方程的推导米氏方程的推导: :n在在MichaelisMichaelis和和MentenMenten的酶促反应动力学基础上，的酶促反应动力学基础上，19251925年，年，BriggsBriggs和和HaldaneHaldane提出酶反应分两步进行，即提出酶反应分两步进行，即“稳态平衡稳态平衡”理论：理论： 第一步：第一步： 第二步：第二步：（1 1）（2 2）ESES的浓度与（的浓度与（1 1）（）（2 2）都有关系）都有关系 说明：设E为酶的总浓度；ES为中间产物浓度；S为底物浓度；EES为游离状态酶的浓度。并且由于底物的量通常要比酶的量高很多，所以在最

9、初反应时间内，S浓度的减少可忽略不计。同时，由于在最初反应时间内，产物的生成很少，所以其逆反应可忽略不计。 因此根据中间产物学说的反应有： ES的生成速度为：v1=k1（EES)（S） ES分解的速度为：v2+v3=ES（k2+k3） 根据恒态理论，ES形成的速度应等于分解的速度，所以： k1（EES）（S） = ES（k2+k3） 即： （k2+k3）/k1= （EES）（S） /ES 令Km= （k2+k3）/k1 ，则有 Km= （EES）（S） /ES 也就是 ES=ES/（Km+S） 因为反应速度的大小与ES成正比，即v=k3ES，将其带入上式则变换为： v=k3ES/（Km+S）

10、而当底物浓度很高时，酶全部被底物所饱和，此时E=ES，而反应速度达到最大反应速度，即：Vmax=k3ES=k3E，所以将其带入上式即可得到以下表达式： v=VmaxS/（Km+S） 即米氏方程式。3、米氏方程式的分析 （1）当SKm时，v = VmaxS/Km ，反应为一级反应。 （2）当SKm时， v =Vmax，反应为零级反应。 （3）当v=Vmax/2时，Km=S，即米氏常数的含义为反应达到最大反应速度一半时的底物浓度。它的单位是摩尔/升，与底物浓度的单位一样。4、米氏常数的意义 （1） Km值是酶的特征性常数之一。它一般与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶， Km值不同。 （2）

11、如果一个酶有几个底物，则对每一种底物各有一个特定的Km值。并且 Km值还受PH及温度的影响。因此，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段，但必须在指定的实验条件下进行。 。（3） Km值可表示酶与底物的亲和力（当k3k1或k2k3时）。 Km值愈大，亲和力越小； Km值愈小，亲和力越大。一般Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。 Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断没的专一性，并有助于研究酶的活性中心。 （4）可用来判断某一反应所用底物浓度的大小。即可根据所要求的反映速度求出应当加入底物的合理浓度；也可根据已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度5. K5. Km m与与K Ks s

12、K Km m不等于不等于K Ks s。在在K K3 3K K1 1、K K2 2时时， K Km m看看作作K Ks s，也只有此时也只有此时1/1/Km Km 才可以近似表示酶与底才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。物结合的难易程度。 6.6.K Km m与与K Km m 无抑制剂时，无抑制剂时，ESES的分解速度与形成速的分解速度与形成速度的比值符合米氏方程，为度的比值符合米氏方程，为Km; Km; 而有抑制剂时发而有抑制剂时发生变化，则不符合米氏方程，为生变化，则不符合米氏方程，为K Km m 。Km=Km=所以所以1/1/KmKm表示形成表示形成ESES的趋势大小的趋势大小特例：特例

13、： Km=K2/K1=Ks(Km=K2/K1=Ks(在在K3K3K1K1，K2K2时时) )7.7.KmKm可以帮助推断某一反应的方向和途径可以帮助推断某一反应的方向和途径乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸乳酸丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶乙酰乙酰CoACoA丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶乙醛乙醛Km=1.7x10Km=1.7x10-5-5mol/Lmol/LKm=1.3x10Km=1.3x10-3 -3 mol/Lmol/LKm=1.0 x10Km=1.0 x10-3-3mol/Lmol/L 丙酮酸 5. 5. 米氏常数米氏常数Km和Vmax的求法的求法的求法 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + +

14、V V V Vmax S max S V VmaxmaxV=Vmax SKm + S-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/va.a.双倒数作图法双倒数作图法( (LineweaverLineweaver-Burk)-Burk)斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmaxb. v-v/Sb. v-v/S作图法作图法( (EadieEadie- -HofsteeHofstee) )将米氏方程改写：将米氏方程改写： c.Hanes-c.Hanes-WoolfWoolf作图法作图法 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V

15、Vmax max S S V Vmaxmaxd. d. EisenthalEisenthal和和Cornish-BowdenCornish-Bowden直接线性作图直接线性作图 将米氏方程改写为：将米氏方程改写为： 6、多种底物的反应 实际上大多数酶反应的机理是比较复杂的，一般包含有一种以上的底物，至少也是两种底物，即双底物反应： E A+BP+Q目前认为大部分双底物反应可能有三种反应机理： （1）依次反应机理（ordered mechanism） B P E+A EA EAB EPQ EQ E+Q用图式说明： A B P Q E E EA EAB EPQ EQ需要NAD+或NADP+的脱氢酶

16、的反应就属此类型。 （2）随机机理（random mechanism ） 加入底物A及B后，产物P及Q以随机的方式释放出来。 同时，底物的加入也是随机的，E可以先和A结合，也可以先和B结合，其结果都是形成中间产物EAB。在产物释放时，可先释放P，也可先释放Q。 用图式来说明： A B Q P EEAEAB EPQEPE或者是： B A P Q EEBEBA EPQEQE如磷酸化酶催化的反应就属此类： 磷酸化酶 糖原+PG1P+糖原 （3）乒乓反应机理（ping pong mechanism） P B E+A EA FP F FB EQ E+Q可用以下图式来说明： A P B Q EE EA FP F FB EQ转氨酶是这种乒乓催化反应