仪器分析与生物应用圆二色仪

1、 圆二色仪是用来检测生物大分子蛋白质、多肽、核酸圆二色仪是用来检测生物大分子蛋白质、多肽、核酸等在溶液下的构象。等在溶液下的构象。 多肽和蛋白质多肽和蛋白质:-:-螺旋、螺旋、-折叠折叠; ; 多聚核苷酸及核酸多聚核苷酸及核酸: :单股、双股、三股螺旋单股、双股、三股螺旋 糖糖: :螺旋结构螺旋结构 各类生物大分子特定的构象是生物功能的结构基础。测定生物大分各类生物大分子特定的构象是生物功能的结构基础。测定生物大分子的这种结构并联系功能研究它们的变化，对了解这些分子如何表现子的这种结构并联系功能研究它们的变化，对了解这些分子如何表现功能有重要作用。功能有重要作用。 圆二色光谱法及其仪器已广泛应

2、用于有机化学、生物化学、配位化圆二色光谱法及其仪器已广泛应用于有机化学、生物化学、配位化学和药物化学等领域学和药物化学等领域, ,成为研究有机化合物的立体构型的一个重要方法成为研究有机化合物的立体构型的一个重要方法。光束光束光学活性样品光学活性样品各向异性差异吸收各向异性差异吸收CD信号信号圆二色光谱圆二色光谱圆二色仪结构示意图圆二色仪结构示意图 1 1、平面偏振光、平面偏振光 3 3、椭圆偏振光、椭圆偏振光 4 4、圆二色光谱、圆二色光谱平面偏振光平面偏振光的电向量的电向量 E E起偏振器起偏振器自然光自然光的电向的电向量量 E E 将自然光通过一个起偏振将自然光通过一个起偏振器器, ,出来

3、出来的的就是就是平面偏振光平面偏振光 起起偏振器偏振器( (尼科尔棱镜尼科尔棱镜): ): 只允许某一偏振面的光通过，只允许某一偏振面的光通过，而将其余偏振面的光都挡住而将其余偏振面的光都挡住的光学元件的光学元件 1 1、平面偏振光、平面偏振光 振动方向在同一平面内的电磁波为平面偏振光。振动方向在同一平面内的电磁波为平面偏振光。 2 2、圆偏振光、圆偏振光n两束互相垂直，振幅两束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，相等的平面偏振光，其位相相差四分之一其位相相差四分之一波长时，其合成矢量波长时，其合成矢量E E的末端轨迹沿着螺的末端轨迹沿着螺旋形旋转，如果对着旋形旋转，如果对着光的传播方向观察，光的

4、传播方向观察，电矢量电矢量E E的末端轨迹的末端轨迹为一圆，这就是为一圆，这就是圆偏圆偏振光振光。n实线实线表示表示两个互相垂直的波，其两个互相垂直的波，其位相相差位相相差1/41/4波长；波长；虚线虚线表示叠加表示叠加而成的圆偏振；中间长线箭头所指而成的圆偏振；中间长线箭头所指为光波传播方向；为光波传播方向；测向测向指向指向虚线的虚线的箭头箭头表示叠加后的表示叠加后的电向量。电向量。 左、右圆偏振光左、右圆偏振光 平面偏振光可分解为振幅、平面偏振光可分解为振幅、频率相同频率相同, ,旋转向相反的旋转向相反的两两圆偏振光圆偏振光。 电矢量按顺时针方向旋转电矢量按顺时针方向旋转的圆偏振光称为的圆

5、偏振光称为右圆偏振右圆偏振光光（R R） 电矢量按逆时针方向旋转电矢量按逆时针方向旋转的圆偏振光称为的圆偏振光称为左圆偏振左圆偏振光光（L L） 两束振幅、频率相同两束振幅、频率相同, ,旋旋转方向相反的偏振光也可转方向相反的偏振光也可以合成为一束以合成为一束平面偏振光平面偏振光 3 3、椭圆偏振光、椭圆偏振光 两束偏振光的振幅两束偏振光的振幅( (强度强度) ) 不相同不相同, ,则合成的将是一束则合成的将是一束椭圆偏振光。椭圆偏振光。 圆偏振光的合成圆偏振光的合成(a),(b)(a),(b)振幅相等的左、右圆偏振光合成平面偏振光；振幅相等的左、右圆偏振光合成平面偏振光；(c),(d)(c)

6、,(d)振幅不相等的左、右圆偏振光合成椭圆偏振光振幅不相等的左、右圆偏振光合成椭圆偏振光 4 4、 圆二色性圆二色性 圆二色性圆二色性(circular (circular dichroismdichroism, CD):, CD):光学活性物质将平面光学活性物质将平面偏振光改变成椭圆偏振光的效应偏振光改变成椭圆偏振光的效应 是利用是利用不对称性分子对左右圆偏振光吸收的不同不对称性分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结来进行结构分析构分析 对左、右旋圆偏振光的吸收率不同对左、右旋圆偏振光的吸收率不同, ,其光吸收的差值其光吸收的差值A A (Al - Ad) (Al - Ad) 圆二色性的存在使

7、通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光偏振光, ,且只在发生吸收的波长处才能观察到。所形成的椭且只在发生吸收的波长处才能观察到。所形成的椭圆的椭圆率圆的椭圆率为为: : = = tgtg- 1 - 1 短轴短轴/ /长轴长轴 当左、右圆偏振光进入物质时，光学活当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质对左、右偏振光的吸收值性物质对左、右偏振光的吸收值 EL EL 和和 ER ER 不同，其差值不同，其差值 E=EL-ER E=EL-ER 就是就是圆二色性圆二色性 EL ELER 0ER 0，CD CD 为为 “” EL ELER 0, CD E

8、R 95 95 SDS-PAGESDS-PAGE电泳后，银染色一条带，电泳后，银染色一条带， 扫描主峰扫描主峰 9595 基因工程产品的比活性符合国际标准。基因工程产品的比活性符合国际标准。 蛋白浓度：远紫外区：蛋白浓度：远紫外区：1515 30 30 ugug/ml/ml 近紫外区：近紫外区：150150300300ug/ml 用用 量：量：800ul800ul 检测方法：紫外吸收法、检测方法：紫外吸收法、 考马斯亮兰考马斯亮兰G 250G 250等。等。 常用检测仪器：紫外分光光度计。常用检测仪器：紫外分光光度计。 溶剂溶剂 1cm cell 1mm cell 0.1mm cell 甲醇甲

9、醇 210 195 185 极性极性 乙醇乙醇 210 195 185 极性极性 三氟醋酸三氟醋酸 264 252 245 四氯化碳四氯化碳 250 240 230 非极性非极性 氯仿氯仿 240 230 220 介于中间介于中间 己烷己烷 210 185 180 非极性非极性 溶剂溶剂 1cm cell 1mm cell 0.1mmDistilled Water 185 180 17510mM Sodium phosphate 1820.1M Sodium phosphate 1900.1M Sodium chloride 195 0.1M Tris-HCL 2000.1M Ammonium citrate 220 1.样品的浓度样品的浓度：根据样品性质、测量的波长范围决定。：根据样品性质、测量的波长范围决定。 远紫外远紫外： 200 微克微克/ml 左右；近紫外浓度增加左右；近紫外浓度增加10倍倍2. 缓冲体系缓冲体系: :对测定结果的影响。对测定结果的影响。如果有需要辅助离子时尽如果有需要辅助离子时尽 量不用量不用NaCl，Na离子离子噪音大。噪音大。蛋白样品常用介质蛋白样品常用介质：H2O; 10mM PBS; 0.5