TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤

1、TUNEL 细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤 -凋亡细胞的原位末断转移酶标记法(TUNEL 法细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是;细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质 DNA 双链 的断裂。 大量 DNA 片段暴露出的 3 羟基在末断转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT或 DNA 多 聚酶的作用下,与生物素或地高辛标记的核苷酸结合,最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或 HRP ,使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。TUNEL 细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂 1:酶浓缩溶液(Enzyme Solution试剂 2:标记溶液

2、(Lable Solution试剂 3:转化剂 -POD (Converter-POD 酶标记抗荧光素抗体(即用型试验所需其它试剂:非石蜡切片 :冲洗缓冲液 :磷酸盐缓冲液(PBS 阻断溶液 :0.3%H2O2甲醇溶液固定溶液 :4%多聚甲醛(溶剂 pH7.4新鲜配制的 PBS 溶液渗透液 :0.1%Triton甔 -100(溶于新鲜配制的 0.1%枸橼酸钠溶液Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚 名:曲拉通 X-100,乳化剂 OP分子式:C34H62O11石蜡切片 :二甲苯和乙醇(100%、 95%、 90%、 80%、 70%用蒸馏水稀释冲洗缓冲液 :磷酸盐缓冲液(PBS 蛋白酶

3、 K 工作液 1020mg/ml溶于 10mM Tris/HCl(pH7.47.8根据需要选择 :渗透液 :0.1%TritonX-100(溶于新鲜配制的 0.1%枸橼酸钠溶液胃酶溶液(0.25%-0.5%溶于 HCl , pH2或胰酶0.1M 枸橼酸缓冲液, pH6,微波修复材料:微波炉,微波输出功率 850W-2000W2 .选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本,常规脱水, 二甲苯透明,石蜡包埋。操 作 步 骤抗原微波修复 (供参考1. 组织经福尔马林固定后会产生广泛的蛋白质交连,因此石蜡组织进行凋亡检测时要进行预处理。经我公司科研人员的长期研究认为:TUNEL 染色时蛋白酶 K 的作用有

4、可能引起内源性核酸内切酶的释放, 造成假阳性反应,同时过量的蛋白酶 K 处理可破坏组织的结构,用微波技术替代上述处理可避免上述弊端 的出现。2. 微波已被愈来愈多地作为免疫组织化学和原位杂交的预处理过程, 经一定温度的微波处理可修复因 固定和包埋造成的抗原破坏,打断氨基酸的肽键结合,促进抗原决 定簇的暴露,恢复细胞膜的空间结构, 增加穿透效应,加速组织处理及染色过程。我们在作 TUNEL 染色前进行微波修复,可以达到蛋白酶 K 的 功效,取得较为理想的效果,背景染色很浅,凋亡细胞阳性颗粒与背景染色对比非常鲜明。3. 蛋白酶 K 作用的条件严格, 消化度常因组织的不同而在操作中不便掌握。 同时蛋

5、白酶 K 的价格昂贵, 而微波已作为一种常用仪器用于免疫组织化学染色中。(1 切片常规脱蜡入水(2将一烧杯盛 200ml 的 0.01 M 、 pH6.0的柠檬酸缓冲液,加热至 90 95,迅速放入切片,使用 680W(80%功率 、微波照射 1min ,加入双蒸水 (2025 80ml 作迅速冷却,将玻片移至 PBS(2025 。(3PBS洗 5min 3次。(4加 20%正常牛血清室温 30 min。(5将 TUNEL 反应混合液加在切片上, 37温育 90min(阴性对照片、 TUNEL 混合液中不 加 TDT 。(6PBS洗 5min 3次。(73%H2O2甲醇液室温阻断 10min

6、。(837温育 90min 。(9加 POD 转化剂, 37温育 30min 。(10PBS洗 5min 3次。(11DAB/H2O2显色。(12 苏木素淡染,常规脱水,透明,中性树胶封固。结果:细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞,结合形态特征,可确立凋亡细胞。阴性对照片无棕 色颗粒。细胞凋亡的检测技术简介(供参考一 . 凋亡细胞的形态学改变细胞表面:伪足 , 微绒毛等消失细胞体形态:细胞皱缩,变形,体积变小细胞核:染色质浓缩,早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形,晚期碎裂细胞器:密集但形态及结构完整,早期内质网短暂扩张细胞膜 :完好,晚期包裹细胞器或核碎片,形成 凋亡小体在组织中表现:常常以单个细

7、胞散在发生周围组织反应:凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞,上皮细胞吞噬,降解,不发生炎症反应发生条件:属于基因控制的程序性细胞死亡,多发生于器官萎缩,细胞介导的 免疫杀伤机制,小 剂量毒素作用以及多种病理生理状态二 . 细胞凋亡的形态学检测方法(一 凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测1. 制片(1常规组织学切片,进行脱蜡和水化。(2培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎 , 所以应采用低速离心制片 (250g,离 心 5min , 并事先将载玻片用 1%BSA处理, 使细胞易于贴附 . 离心后涂片 , 稍经空气中干燥后,迅速用 1%多 聚甲醛 4下固定 15-30min ,然后转入

8、80%乙醇后固定 1-2h ,保存于 -20待用 .2. 染色方法可用多种方法进行染色。(1可采用常规的组织学染色方法,如 Giemsa 染色, HE 染色或 Mayer 苏木素染色 .(2采 用 荧 光 染 料 染 色 , 如 DAPI(4 , 6 -diamidino-2-phenylindole,PI(propidium iodide 和 7-AAD(7-aminoacetinomycin D.其染色浓度为 :DAPI 1-2g/ml;PI 5-10g/ml;7-AAD 10-20g/ml.由于 PI 染 料同时也与 RNA 结合 , 所以应将细胞先用 RNA 酶消化 (50Kunitz单位的 RNA 酶 ,37下作用 15min 或室温 下 30min 后 , 再进行 PI 染色。3. 结果观察典型的凋亡细胞形态学改变:细胞体积缩小及变形;核浓染及丧失亚形态结构,可见核染色质呈新月 形,或核碎裂成大小不等的核碎片;在组织切片上可见巨噬细胞或邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小 体。(二 凋亡细胞的电镜观察