第十九章补体检测及应用

1、精选ppt 第十九章第十九章 补体检测及应用补体检测及应用精选ppt第一节第一节 概概 述述一、补体的性质一、补体的性质精选ppt1 1、补体的概念与来源、补体的概念与来源n 补体（complement，C）又称补体系统，是一组存在于人和脊椎动物血清与组织液中具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白,是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件。n体内多种组织细胞均能合成补体成分，其中肝细胞和巨噬细胞是补体的主要产生细胞。精选ppt2、补体系统的组成n补体并非单一成分，是由30余种活性成分组成的补体系统，是体内最复杂的一个限制性蛋白酶解系统（limited pro

2、teolysis system）。n按其生物学功能分为三类：精选ppt1、补体系统的固有成分：指存在于体液中参与补体激活过程的补体成分。经典激活途径： C1q、C1r、C1s、C4、C2；甘露聚糖结合凝集素激活途径：MBL、丝氨酸蛋酶；旁路激活途径：B因子、P因子、D因子；共同末端通路：C3、C5、C6、C7、C8、C9。精选ppt2、补体调节蛋白：指参与调控补体活化的抑制因子或灭活因子，多以其功能命名。 C1抑制物（C1 inhibitor，C1INH）、C4结合蛋白（C4BP）、I因子、H因子、S蛋白和膜协同因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）。3、补体受

3、体（complement receptor，CR）：指介导补体活性片段或调节蛋白生物学效应的各种受体，以其结合对象来命名，如C1rR 、C5aR/C3aR、C1qR，对C3片段的受体则用CR1-CR5表示，调节蛋白的受体。精选ppt3、补体系统的命名原则n参与补体经典激活途径的固有成分,按其被发现的先后分别命名为:C1(q、r、s)、C2、C9；补体系统的其他成分则以因子命名，用英文大写字母表示：如B因子、D因子、P因子；n补体活化后的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示，通常a为小片段，b为大片段，但C2a为大片段，C2b为小片段;精选pptn具有酶活性的成分或复合物在其字符上画一横线

4、表示，如 等；n灭活的补体片段在其字符前加英文字母i表示，如失活的C3b称为iC3b;n补体调节蛋白多以其功能命名：C1抑制物、C4结合蛋白等。bBbC3精选ppt4、补体的性质n补体大多为糖蛋白，其中C1q分子量最大，D因子最小；n血清蛋白电泳中，补体大多位于球蛋白区，少数位于 或球蛋白区，如C1q、C8等为球蛋白，C1s、C9为球蛋白。精选pptn正常血清中补体含量相对稳定，补体蛋白约占总蛋白量的10%左右，补体各组分含量相差较大，其中C3含量最高，达1-2mg/ml，Df最低。n补体的性质不稳定，较其他蛋白质对理化因素更为敏感，加热、紫外线照射、机械振荡、酸碱和酒精等因素均可破坏补体。精

5、选pptn在010 补体活性保持3-4天， -20 以下冷冻或真空干燥可使其活性保持较长时间，标本保存应置于-20 以下。n补体灭活：加热5630min可使血清中绝大部分补体失去活性，故补体活性检测应尽快进行。n补体代谢主要在血液和肝脏中进行，代谢率快，每天约更新一半。n各种属动物间血中补体含量不同，豚鼠血清中含量丰富，故实验室多采用豚鼠血清作为补体来源。 精选ppt补体补体成分成分分子量分子量电泳电泳区带区带血清含量参考值血清含量参考值（g/ml）补体补体 成分成分分子量分子量电泳电泳区带区带血清含量参考值血清含量参考值（g/ml）C1q390270C979240C1r9535B952102

6、40C1s8535D252C211712030P220225C319011300C1INH150180C41802430600C4bp1100250C5190275I因子因子9350C6128260H因子因子159400480C7120255S因子因子88500C81631200精选ppt 二、补体的活化途径n生理情况下，血清中大多数补体蛋白以酶原形式存在于体液中，一旦被活化物质激活，补体各组分便产生连锁酶促反应即级联（cascade）反应，表现出相应的生物活性。精选pptn补体的激活途径按起始顺序不同分为三种：n经典途径（classical complement pathway）：抗原抗体复

7、合物结合C1q启动激活的途径；是抗体介导的体液免疫反应的主要效应形式；精选pptn替代途径（alternative complement pathway）：病原微生物等提供结合表面，不经C1、C4、C2的参与，在B因子、D因子、P因子的参与下直接从激活C3开始的途径，是在感染早期，最先发挥作用的途径；经典途径的激活可以导致替代途径的活化，反之则不行。精选pptn甘露聚糖结合凝集 素 （ m a n n a n binding tectin，MBL）途径，简称MBL途径：MBL结合至细菌而启动激活的途径，此途径不依赖于抗原抗体复合物的形成，在感染的早期就能发挥免疫防御效应，为急性期蛋白途径。精选

8、ppt1、补体激活的经典途径n主要激活物：IgG3、 IgG1 、IgG2和IgM类抗体与相应抗原形成的免疫复合物。此外还发现有许多因子可以激活此途径，如细菌脂多糖、dsDNA、C-反应蛋白和心肌线粒体等。精选pptn始动环节：C1q与IC中抗体分子的补体结合位点相结合。IgG分子必须要两个或以上，而IgM一个分子 即可激活C1q。精选pptn激活过程：补体C1-C9共11种成分全部参与的活化途径。经典途径的活化过程可分为识别、活化和膜攻击三个阶段。n识别阶段：C1q识别免疫复合物至C1酯酶形成（小片段C1s）。n活化阶段：活化的C1s依次裂解C4和C2，形成具有酶活性的C3转化酶（ ）和C5

9、转化酶（ ）的过程。bbC24bbbC324精选ppt经典途径经典途径精选ppt2、补体激活的替代途径n替代途径的激活剂：某些细菌、革兰氏阴性菌的内毒素、细菌的脂多糖、肽聚糖、葡聚糖、酵母多糖、凝聚的IgG4和IgA聚合物等。精选pptn激活过程：C3是启动替代途径并参与其后级联反应的关键分子。n 经典途径产生或自发产生的C3b与B因子结合，血清D因子的作用，形成C3转化酶（ ）， 不稳定，与血清P因子结合则形成稳定的C3转化酶（ ）； C3转化酶水解C3，形成C5转化酶（ 或 ）；bBbC3bnBbPC3bBbPC3bnBbC3精选pptn激活的特点：n可以识别自己与非己：C3b的中止与激活

10、n替代途径是补全权系统重要的放大机制：替代途径C3转化酶对经典途径补体的活化是一种放大机制。精选ppt3、MBL途径n激活物：病原微生物感染所诱导产生的急性期蛋白，如MBL、CRP等。n激活过程：MBL与细菌的甘露糖残基结合；再与丝氨酸蛋白酶结合，形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶（MASP-1、MASP-2），MASP具有与活化的C1q同样的生物学活性，可水解C4和C2，形成C3转化酶；其后过程与经典途径相同。n激活特点：MBL途径开始于急性期蛋白与病原体的结合，而不是抗原抗体复合物形成。精选ppt4、共同末端效应nC5转化酶裂解C5是补体级联反应中最后一个酶促步骤。n若补体激活发生在脂质双层上，

11、则形成MAC；n若补体激活发生在没有靶细胞的血清中则有关补体成分可同S蛋白形成亲水的无溶细胞活性的SC5b7、 SC5b8及SC5b9。6、三种激活途径的比较精选ppt5、三种激活途径的示意图精选ppt经典激活途径经典激活途径替代激活途径替代激活途径MBLMBL途径途径激活物质激活物质抗原抗体复合物抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBLMBL相关的丝氨酸蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶起始分子起始分子C1qC1qC3C3C2C2、C4C4参与补体成分参与补体成分C1C1、C4C4、C2C2、C3C3、C5-C5-C9C9C3C3、C5-C9C5-C9、B B因子、因子、D

12、 D因子因子C2-C9C2-C9、 MASPMASP所需离子所需离子CaCa2+2+、MgMg2+2+MgMg2+2+CaCa2+2+C3C3转化酶转化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBbC4b2bC4b2bC5C5转化酶转化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbC3bnBbC4b2b3bC4b2b3b生物学作用生物学作用参与特异性免疫的参与特异性免疫的效应阶段效应阶段, ,感染后期感染后期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段, ,感染早期感染早期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段, ,感染早期感染早期发挥作用发挥作用

13、6、精选ppt7、补体激活的调控n机体必须有严密的补体调控机制。正常生理情况下补体激活是机体的一种保护性反应,失控的补体激活反应可使大量补体无益消耗、产生剧烈的炎症反应以及造成机体自身组织细胞的病理性损伤。n补体的调控方式：补体成分的自身衰变和各种补体调节因子的作用。精选pptn自身衰变的调节:被激活后的补体蛋白往往不稳定。n补体裂解片段C4b、C3B、C5b呈游离状态时会迅速衰变,须与细胞膜结合才能产生补体的级联反应;nC3转化酶和C5转化酶亦极易衰变,从而限制后续补体成分的酶 促激活反应;n与细胞膜结合的C5也可自行衰变,使MAC无法大量形成。精选pptn调节蛋白的调节：n补体激活启动阶段

14、的调节；n对单一补体蛋白转化酶的调节；n对MAC形成的调节；n某些细胞表面存在的补体受体分子也参与补体活化的调节。精选pptnC1抑制物（C1INH）：以共价结合C1r、C1s，防止C1的自发激活，亦可使C1酯酶失去裂解C4和C2的能力。nC4结合蛋白（C4bp）：n竞争性抑制C4b与C2的结合，阻止C3转化酶的形成；n促进 分解，从中置换出C2b使C3转化酶失活；n辅助I因子裂解游离的C4b。bbC24精选pptnH因子：n竞争性抑制B因子与C3b的结合，阻止C3转化酶的形成n促进I因子灭活C3bnI因子：在C4bp和H因子的协同作用下可使C4b和C3b裂解。nS蛋白：与C5b67结合，阻止

15、其插入细胞脂膜而抑制MAC形成。精选pptn同种限制因子（HRF）：与C8蛋白结合而干扰C9和C8相结合，使自身细胞膜上不能形成MAC。n衰变加速因子（DAF）：n竞争性抑制B因子与C3b的结合，阻止C3转化酶的形成；n促进 分解，从中置换出C2b使C3转化酶失活；bbC24精选ppt三、补体的生物学功能三、补体的生物学功能n补体系统的生物学作用分为两大类：n补体在细胞膜表面激活并形成MAC，介导细胞溶解；n补体裂解片段介导的各种生物学效应。n补体系统的生物学功能：n补体介导的细胞溶解作用精选pptn调理吞噬和免疫粘附作用：是机体抗感染的主要防御机制。n补体的调理吞噬：补体裂解片段C3b、C4

16、b、iC3b等可与细菌、病毒等颗粒性物质结合，促进吞噬细胞对其吞噬；n免疫粘附作用：C3b与病毒或IC等结合后，可介导后者与具有C3b受体的人RBC、PLT等结合，从而有利于吞噬细胞捕获和清除。精选pptn炎症介质作用n过敏毒素作用：C5a、C3a、C4a与细胞表面的相应受体结合，能使肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒n激肽样作用：C2a、C4a可引起炎性渗出和水肿n趋化作用：C5a、C3aS可使N定向移动精选pptn清除免疫复合物作用n抑制IC的形成：空间位阻效应n促进IC的清除：C3b介导免疫粘附n免疫调节作用nC3可参与捕捉并固定抗原，通过与抗原提呈细胞上的CR1及CR2受体结合，使抗原易被A

17、PC处理和提呈n作用于多种免疫细胞，调节细胞的增殖分化：C3b与B细胞表面CR1结合，促进B细胞增殖分化n参与调节多种免疫细胞效应功能：NK结合C3b增强ADCC作用精选ppt第二节第二节 补体总活性测定补体总活性测定n补体总活性测定是对激活后补体最终效补体总活性测定是对激活后补体最终效应的检测方法，可借此反映补体的整体应的检测方法，可借此反映补体的整体功能。功能。n补体总活性测定方法是以红细胞的溶解补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以为指示，以50%50%溶血为判断终点，称为溶血为判断终点，称为CH50CH50。精选pptn补体活化途径不同，应用不同的激活物补体活化途径不同，应用不同

18、的激活物可活化不同的补体途径：可活化不同的补体途径：n基于经典途径的基于经典途径的CP-CH50CP-CH50（临床常规项目：（临床常规项目：CH50CH50）n应用于应用于C3C3旁路检测的旁路检测的AP-CH50AP-CH50（尚未列入（尚未列入检验常规）检验常规）nMBLMBL途径活性测定的可靠方法暂未建立途径活性测定的可靠方法暂未建立精选ppt（一）CH50测定法的实验原理n补体最主要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。精选pptn应用绵羊红细胞（应用绵羊红细胞（sheep red blood s

19、heep red blood cell, SRBCcell, SRBC）和其相应的抗体（溶血）和其相应的抗体（溶血素），作为能诱导补体活化经典途径的素），作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。将新鲜待检血清作体含量和活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以程度，以50%50%溶血时的最小血清用量作溶血时的最小血清用量作为判定

20、终点，可测知补体总溶血活性。为判定终点，可测知补体总溶血活性。精选pptn补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。n实验通常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验（50% complement hemolysis），即CH50。精选pptnS形曲线: 以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血时，对补体量的变化不敏感。在30%-70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。溶血程度

21、与补体含量的关系溶血程度与补体含量的关系 精选ppt 精选ppt（二）CH50试验方法 正式试验之前，应：正式试验之前，应：n调节制红细胞浓度调节制红细胞浓度n滴定溶血素效价滴定溶血素效价精选ppt1、红细胞浓度的调整n绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）自绵羊颈静脉无菌采血，注入放有玻璃珠的无菌干燥三角烧瓶中，轻轻旋摇15min，除去纤维蛋白。也可将羊血与等量或2倍量的阿氏（Al-sever）液混合，既可抗凝，又适用于储存。分装，4保存，可用2-3周。精选pptn实验前，取适量SRBC用生理盐水洗涤2次，第3次用缓冲液洗涤，离心弃上清液，取比积红细胞用缓冲液配制S

22、RBC悬液，浓度一般为2%-5%。n为使每次试验时SRBC的浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入20-30倍的稀释液中。在542nm波长处比浊，以吸光度为标准调整红细胞浓度。精选ppt2、溶血素滴定n溶血素可通过溶血素可通过SRBCSRBC免疫家兔获得，一般无需纯化；免疫家兔获得，一般无需纯化；n试验前需先行加热试验前需先行加热56 30min56 30min或或60 3min60 3min以灭活以灭活补体；补体；n溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用；溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用；n自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性

23、测定中，大多使用补体活性测定中，大多使用2 2个单位。个单位。n溶血素效价稳定，一般使用溶血素效价稳定，一般使用3 3个月后再作重新滴定个月后再作重新滴定精选pptn溶血素稀释与滴定方法如下：n溶血素稀释一般不用连续倍比稀释法，这是因为稀释到最后跨度太大，不易确定单位。n置37温育后观察结果，以最高稀释度的溶血素仍能产生完全溶血为最大的有效反应管，即确定为1个单位（如1：4000）。n在补体活性测定或补体结合试验中一般使用2U（即1：2000，试验时用1：1000的溶血素与2%SRBC等量混合致敏）。精选ppt3、稀释缓冲液：n磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验，pH调到7.2-7.4

24、之间。n加适量NaCl以保持等渗；n加适量活化补体必不可少的Ca2+和Mg2+；n加入0.1%明胶以稳定蛋白溶液；n加入0.02%NaN3防腐,以利保存。精选ppt4、50%溶血标准管：n作CH50试验时，应同时配制50%溶血标准管。n方法：取2%绵羊红细胞悬液0.5ml，加2.0ml蒸馏水，将SRBC全部溶解；再加入1.8%NaCl溶液2.0ml校正为等渗溶液；最后加入2%SRBC悬液0.5ml，即为50%溶血悬液；混匀后取此液2.5ml,随试验一起温育。精选ppt5、取新鲜血清标本，按表CH50试验在各管中加入血清与试剂，一并置于37水浴箱中温育30min。温育后各管2500r/min离心

25、5min，仔细观察比较，选择溶血程度与标准管最为相近的两管，在分光光度计上分别读取OD541值，以最接近标准管OD值的一管定为最高有效反应管。n 50%50%溶血总补体值的计算：溶血总补体值的计算： CH50（U/ml）1/血清用量稀释倍数n总补体活性参考范围：50-100U/ml。精选ppt血清总补体50%溶血活性测定精选ppt（三）方法评价nCH50试验测定经典途径总补体溶血活性，所反应的是补体9种成分的综合水平；n方法简便、快速，但敏感性较低；n影响因素多：实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。n补体的溶血活性与试验中反应体积成反比；n与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵

26、羊红细胞数量和反应温度有一定关系；n缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降；nCa2+、Mg2+可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应。精选ppt临床意义nCH50CH50增高见于：增高见于： 急性炎症、组织损急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等；伤、恶性肿瘤等；nCH50CH50降低见于：系统性红斑狼疮、类风降低见于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾、急性肾小球肾炎等。小球肾炎等。精选ppt 一、概述n目前主要测定的补体成分： 根据世界卫生组织（WHO）国际免疫学会报告，在30多种补体成分中，主要检测C3、C4、C1q、B因子和C1酯酶抑制物。n测定

27、方法可分为：溶血法和免疫化学法n溶血法：用以检测单个补体成分的溶血活性；n免疫化学法：测定补体含量。n过去常采用单向琼脂扩散试验或单向火箭免疫电泳n目前各检测部门多采用免疫比浊法。随着免疫检测仪器的自动化、速率散射比浊法（rate nephelometry）应用日益广泛。本法可检测包括C3、C4等补体成分在内的20多种血浆中的特种蛋白，是一种快速、敏感和准确的定量检测方法。精选ppt第三节第三节 单个补体成分的测定单个补体成分的测定n常作为单个补体成分的检测指标：常作为单个补体成分的检测指标：C3C3、C4C4、C1qC1q、B B因子和因子和C1C1酯酶抑制物等；酯酶抑制物等；n测定方法：测

28、定方法： n免疫溶血法免疫溶血法 （检测单个补体成分的活性）（检测单个补体成分的活性）n免疫化学法（检测单个补体成分的含量）免疫化学法（检测单个补体成分的含量） 自动化免疫散射比浊法自动化免疫散射比浊法精选ppt一、免疫溶血法一、免疫溶血法 n 原理原理：主要根据抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后可激活补体的经典途径，导致细胞溶解。n试验的指示系统试验的指示系统：该方法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体，即溶血素。将两者组合作为指示系统参与反应。n参照体系参照体系: :以人为设计的缺乏某种补体成分的血清以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照；为参照；精选ppt试验中参与

29、的两组补体：n一组是作为实验反应系统的补体，选用或制备缺少待测成分的试剂（参照血清常称之参照血清常称之“R R（removeremove）”试剂试剂），加入致敏SRBC（检测经典途径补体成分用）或总红细胞RRBC（检测替代途径补体成分用）指示系统后，此时由于补体不能连续激活，不发生溶血。n选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清，如某些人可天然缺乏C2、豚鼠缺C4、小鼠缺C5，家兔缺C6；n利用化学试剂人为灭活正常血清中某种成分制备缺乏该成分的补体试剂，如用氨或肼处理使豚鼠血清C4被破坏；用酵母多糖灭活C3等。n另一组为待测血清中的补体； 当加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补偿，补体成分齐全

30、，级联反应恢复，产生溶血。溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50%溶血为终点。精选ppt方法学评价方法学评价n采用免疫溶血法检测待测标本中某一单个补体成分是否缺乏，可以帮助诊断补体某个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的失天性补体缺陷。n无需特异仪器与设备，快速，但敏感性较低，影响因素多。n该法不是检测某补体成分的具体含量，而是检测其活性，在某些需了解该成分活性情况下，本试验适用。 n免疫溶血法常用于免疫溶血法常用于C2C2、C3C3、C4C4、C5C5、C6C6等补体成分的检测。等补体成分的检测。其中以其中以C3C3、C4C4两成分的检测更为常见。两成分的检测更为常见。精选ppt二、免疫化学

31、法二、免疫化学法n免疫化学法分类免疫化学法分类 n1.1.单向免疫扩散单向免疫扩散n2.2.火箭免疫电泳火箭免疫电泳n3.3.透射比浊法透射比浊法n4.4.散射比浊法散射比浊法n前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰因素多、结果重复性差，已趋于淘汰n后两种方法：通过仪器对补体的后两种方法：通过仪器对补体的C3C3、C4C4、B B因因子等单个成分进行自动化测定子等单个成分进行自动化测定 精选ppt方法评价：n手工免疫化学法：单向免疫扩散法与火箭免疫电泳多用手工操作，影响因素多，结果重复性差，现已逐渐趋于淘汰；n自动免疫化学法

32、：散射、透射比浊法通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行测定。待测血清标本的C3、C4成分经适当稀释后与相应抗体结合形成复合物，反应介质中的PEG可使该复合物沉淀，仪器对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测，并换算成所测成分的浓度单位。检测补体成分方法简单、特异、重复性好、可反映所测补体成分的绝对值，并能够进行标准化流程管理，进行质量控制，是目前国内外临床免疫检测中的主要检测方法。 精选ppt第四节第四节 补体结合试验补体结合试验n补体结合试验（complement fixation test，CFT）是经典途径的抗原抗体反应之一。凡能激活补体的IgM和IgG类抗体与相应抗原结合

33、的反应均可应用本法检测。n目前主要用于病毒性传染病诊断和流行病学调查，以及一些自身抗体、肿瘤相关抗原和HLA血清学分型的检测。 精选ppt一、试验原理一、试验原理n试验的参与反应的成分与系统（试验的参与反应的成分与系统（ 5种成分，种成分，3个系个系统）统）：n反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）；n补体系统；n指示系统：SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell，SRBCS）。精选ppt试验的二个阶段试验的二个阶段n第一个阶段：试验中先加入反应系统让其有优先结合的机会；n第二阶段：为SRBCS与补

34、体结合的阶段。n如果反应系统中存在待测的相应抗体（或抗原），则反应的第一阶段抗原抗体复合物结合补体，此时由于补体已被子结合掉，反应液中已无游离补体，故第二阶段加入指示系统不出现溶血，补体结合试验阳性。n如果反应系统中抗原（或抗体）缺乏，或两种不对应，则反应的第一阶段补体游离，与第二阶段加入的指示系统结合出现溶血，补体结合试验阴性。n试验中将反应系统的待测抗原（或抗体）作系列倍比稀释可作定量测定。n试验中以50%不溶血作为判断终点。精选ppt补体结合试验示意图精选ppt二、试验方法二、试验方法（一）试剂制备1、抗原：用于检测抗体的抗原应以适当方法纯化，以保证试验的特异性。 如使用成分复杂的粗制抗

35、原，可通过匀浆和反复冻融，初步提取可溶性抗原，经3000r/min离心20min去沉渣，取上清液再经10000r/min离心1h，取上清液作抗原。如使用此类粗制抗原，须用经同样处理的正常组织作抗原对照，以排除非特异性反应。 精选ppt2、抗原和抗体的滴定：n一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强阳性反应（100%不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（或单位）。n滴定方法：各试管中加入不同稀释度的抗原和抗体及另作不加抗原的抗体对照管和不加抗体的抗原对照管。再依照试验方法加补体和指示系统，经温育后观察溶血反应情况。n正式试验中，抗原一般用2-4个单位（1:32-1:16），抗体采用4个单位（

36、1:8）。半年左右可复查其效价是否变化。精选ppt抗原和抗体效价的方阵滴定注图中可见：1:64的抗原为1个单位； 1:32的抗体为1个单位；精选ppt3、补体的滴定 采用豚鼠血清为补体采用豚鼠血清为补体 对补体进行滴定和确定其用量，对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的最少补体用以能产生完全溶血的最少补体用量为量为1 1个实用单位个实用单位 正式试验时使用正式试验时使用2 2个实用单位个实用单位 补体的性质不稳定，每次试验补体的性质不稳定，每次试验前均应进行滴定前均应进行滴定 精选ppt补体的滴定：1：60的补体0.12ml可产生完全溶血，此为1个实用单位。按比例公式（0.122：60

37、0.2：X，经计算X50，即实际应用中的2个实用单位应为1：50稀释的补体0.2ml。精选ppt（二）血清标本 采血并及时分离血采血并及时分离血清用于检测或清用于检测或2020保存备用。保存备用。 试验前，应先将血试验前，应先将血清清5656加热加热30min30min（或（或603min603min）以灭）以灭活补体。活补体。 n血清标本遇有抗补体现象时，血清标本遇有抗补体现象时，n可作下列处理：可作下列处理：n加热灭活时提高加热灭活时提高12 n20冻融后离心去沉淀冻融后离心去沉淀 n以以3mmol/L盐酸处理盐酸处理 n加入少量补体后再行灭活加入少量补体后再行灭活 n以白陶土处理以白陶土

38、处理 n通入通入CO2 n以小白鼠肝粉处理以小白鼠肝粉处理 n用含用含10新鲜鸡蛋清的生理盐水新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清稀释血清 精选ppt（三）正式试验n按补体结合试验操作程序逐步加入各种试剂，温育后先观察各种对照管，且应与预期结果相符。n阴性、阳性对照管分别应为明确的溶血与不溶血；n抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管应完全溶血；nSRBC对照管不应出现自发性溶血。n补体对照管中2U应全溶，1U全溶或微不溶，0.5U应不溶。若0.5U补体对照管出现明显溶血，表示补体用量过多；如2U不出现完全溶血，则表明补体用量不够，对结果的正确性均有影响，应重复试验。nCFT结果，受

39、检血清管不溶血为阳性，溶血为阴性。精选ppt补体结合试验的操作程序精选ppt三、方法学评价三、方法学评价 n优点：n补体结合试验敏感性高，能测定0.05g/ml的抗体；n特异性强，由于各反应成分事先经过滴定，比例适当，出现交叉反应的几率较小；n反应结果明显，溶血与不溶血易于区分；n试验条件要求低，容易普及，不需特殊仪器或只用分光光度计检测溶血反应后的血红蛋白量；n应用面广，不同性状的抗原和抗体均可检测。精选pptn缺点：n参与成分多，影响因素复杂，操作繁琐且要求严格，稍有疏忽便影响结果。n补体性质不够稳定，难于标准化，且抗原或待检血清可能有抗补体作用。n现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现

40、，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验逐渐被遗弃n补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用指导作用 精选ppt第五节第五节 补体受体的测定补体受体的测定补体受体：补体受体：存在于多种细胞，是清除免疫复存在于多种细胞，是清除免疫复合物、净化机体内环境的重要膜性成分合物、净化机体内环境的重要膜性成分 检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计数相应的细胞数量和计数相应的细胞数量 精选pp

41、t补体受体目前已知的补体受体归为目前已知的补体受体归为以下五类：以下五类：CR1（CD35） CR2（CD21） CR3（CD11b/CD18） CR4(gp150/95，CD11c/18) C3aR/C5aR精选ppt名名 称称 别别 名名 CDCD分类分类 配配 体体 细细 胞胞 分分 布布 CR1 CR1 C3bC3b受体，受体，C4B/C3bC4B/C3b受体受体 CD35 CD35 iC3biC3b、C3bC3b，C4bC4b、iC4biC4b，C3c C3c 红细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B B细胞、树突状细胞、肾小球上皮细胞细胞、

42、树突状细胞、肾小球上皮细胞 CR2 CR2 C3dC3d受体，受体，EBEB病毒病毒受体受体 CD21 CD21 iC3biC3b、C3dgC3dg、C3dC3d、EBEB病毒、病毒、IFN- IFN- B B细胞、树突状细胞细胞、树突状细胞 CR3 CR3 iC3biC3b受受体、体、Mac-1Mac-1抗抗原原 CD11b/CD11b/CD18 CD18 iC3biC3b、植物凝集素、某些细、植物凝集素、某些细胞多糖胞多糖 中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、细胞、NKNK细胞细胞 CR4 CR4 gp150/9gp150/95 5 CD11C/CD11C/CD18 CD18 iC3biC3b、C3dC3d、C3dg C3dg 中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板 C5aR/ C5aR/ C3aRC3aRCD88CD88C5a/C3a(C5a/C3a(活化活化G G蛋白蛋白) )内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞内皮细胞、肥大细胞、吞噬细胞补体受体特性精选ppt第六节 补体测定的应用n补体系统及其单个成分