12 第12章 免疫组织化学技术

1、免 疫 组 织 化 学 技免 疫 组 织 化 学 技术术: :是 指 用是 指 用 标 记 的 特标 记 的 特异 性 抗 体异 性 抗 体 在 组 织在 组 织细 胞细 胞 原 位原 位 通 过通 过 抗抗原 抗 体 反 应原 抗 体 反 应 和 组和 组织 化 学 的织 化 学 的 呈 色 反呈 色 反应应 ， 对 相 应 抗 原， 对 相 应 抗 原进行进行定性、定位、定性、定位、定 量定 量 测 定 的 一 项测 定 的 一 项免疫检测方法。免疫检测方法。免疫组织化学技术免疫组织化学技术免疫组织化学的优点免疫组织化学的优点 1 1、特异性强、特异性强免疫组化从理论上讲也是免疫组化从理论

2、上讲也是“一对一一对一”的组的组织细胞中抗原的特定显示织细胞中抗原的特定显示 2 2、敏感性高、敏感性高抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合 3 3、定位准确，形态与功能相结合、定位准确，形态与功能相结合 4. 4. 方法步骤统一方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则一若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。通百通。免疫组织化学过程免疫组织化学过程1抗原的提取与纯化2制备特异性抗体3标记物与抗体结合形成标记抗体4标本的处理与制备基 本 过 程5抗原抗体免疫学反应以及标记物呈

3、色反应6观察结果免疫组织化学技术免疫组织化学技术分类分类标记物免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术酶免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术第一节第一节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术: : 用用酶标记已知酶标记已知的抗体（或抗原）的抗体（或抗原）与组织或细胞与组织或细胞中相中相应的抗原（或抗体）反应，应的抗原（或抗体）反应，形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物，复，复合物中的合物中的酶催化底物显色酶催化底物显色，通过，通过光镜或电镜光镜或电镜对标本中对标本中的抗原或抗体进行定性、定位，也可通过图像分析定的抗原或抗体进行定性、定

4、位，也可通过图像分析定量。量。 分类酶桥法过氧化物酶抗过氧-化物酶（PAP）法 双桥PAP法碱性磷酸酶抗碱性 磷酸酶（APAAP）法非标记抗体酶免疫组化技术酶标记抗体免疫组化技术直接法 间接法直接法直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。间接法间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标记抗体免疫组织化学染色直接法间接法优点操作简便 特异性强检测敏感性

5、高制备一种酶标二抗可用于检测多种 抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法 操作较为繁琐酶桥法酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图（图11-1111-11）。非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法过氧化物酶抗过氧化物酶（过氧化物酶抗过氧化物酶（PAPPAP）法）法：是在酶桥法基础上加以改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图11-12）。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体

6、），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图11-13）。非标记抗体酶免疫组织化学染色PAP法双桥双桥PAPPAP法法：该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。非标记抗体酶免疫组织化学染色+底物底物二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag兔源兔源APAAPAPAAP复合物复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAPAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物复合物碱性磷酸酶抗碱性磷碱性

7、磷酸酶抗碱性磷酸酸酶（酶（APAAPAPAAP）法）法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物：酶酶底物底物颜色颜色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）二氨基联苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘红色4-氯-1-萘酚灰蓝色碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）-萘酚磷酸盐+快蓝深蓝色-萘酚磷酸盐+快红红色溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）+氮蓝四唑（NBT）紫蓝色一、酶免疫组织化学技术的操作程序一

8、、酶免疫组织化学技术的操作程序1.1.取材与制片取材与制片（1 1）活体组织：组织切片或印片。）活体组织：组织切片或印片。（2 2）各种体液、穿刺液：直接涂片或离心）各种体液、穿刺液：直接涂片或离心 后沉淀物涂片。后沉淀物涂片。（3 3）培养细胞：悬浮培养细胞离心沉淀作细）培养细胞：悬浮培养细胞离心沉淀作细胞涂片；盖玻片上的单层培养细胞直接固定。胞涂片；盖玻片上的单层培养细胞直接固定。（一）标本的处理一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序2. 2. 固定与保存固定与保存 常用固定剂及固定时间：常用固定剂及固定时间： 10%10%中性福尔马林液中性福尔马林液6 612h

9、12h ZenkerZenker固定液固定液2 24h4h BouinBouin固定液固定液2 24h4h。（一）标本的处理一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序2. 2. 固定与保存固定与保存 固定剂的选择：固定剂的选择： 蛋白质类抗原蛋白质类抗原: :乙醇或甲醇乙醇或甲醇 多糖类抗原多糖类抗原:10%:10%甲醛溶液甲醛溶液 冷丙酮冷丙酮: :冷冻切片冷冻切片 乙醇加乙醇加5%5%冰醋酸冰醋酸: :涂片涂片 甲醛甲醛: :石蜡包埋的材料石蜡包埋的材料（一）标本的处理一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序2. 2. 固定与保存固定与保存 （

10、4 4）保存：）保存： 细菌涂片或器官组织切片细菌涂片或器官组织切片:4:4以下。以下。 病毒和某些组织抗原病毒和某些组织抗原:-20:-20以下以下。（一）标本的处理一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序 多克隆抗体：多克隆抗体： 敏感性较高、特异性相对较低敏感性较高、特异性相对较低 单克隆抗体：单克隆抗体： 特异性较高、敏感性相对较低特异性较高、敏感性相对较低（二）抗体的选择与处理一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序HRPHRP：底物底物: : 二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（DABDAB）：）： 棕色产物棕色产物 氨基乙基卡巴唑（氨基乙基

11、卡巴唑（AECAEC）：）： 橘红色产物橘红色产物 4-4-氯氯-1-1-萘酚：灰蓝色产物萘酚：灰蓝色产物APAP：底物底物:-:-萘酚磷酸盐，快蓝或快红：深蓝色或红色产物萘酚磷酸盐，快蓝或快红：深蓝色或红色产物 溴氯羟吲哚磷酸盐溴氯羟吲哚磷酸盐(BCIP(BCIP）, ,氮蓝四唑（氮蓝四唑（NBTNBT）：紫）：紫蓝色沉淀产物蓝色沉淀产物（三）免疫标记一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体，用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体，结果应为阴性。结果应为阴性。不加一抗，结果应为阴性。不加一抗，结果应为阴性。用不含靶抗原的标本进

12、行免疫标记，结果应为用不含靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阴性。阴性。对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阳性。应为阳性。（四）对照试验一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序 阳性细胞显色分布类型阳性细胞显色分布类型 细胞质细胞质 细胞核细胞核 细胞膜表面细胞膜表面（五）结果观察和分析一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序 阳性显色深浅反映抗阳性显色深浅反映抗原存在的数量，可以原存在的数量，可以作为定性、作为定性、 定位、定定位、定量依据量依据（五）结果观察和分析一、酶免疫组织化学技术的操作程

13、序一、酶免疫组织化学技术的操作程序 阳性细胞分布分为阳性细胞分布分为 散在分布散在分布 灶性分布灶性分布 弥散分布弥散分布（五）结果观察和分析阳性细胞呈灶性分布一、酶免疫组织化学技术的操作程序一、酶免疫组织化学技术的操作程序特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色分布在特定的部位分布在特定的部位, , 具结构性具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域域 由于细胞内抗原含量不同，所由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，不限于单个细胞，而是累及一片细胞

14、，均匀显色均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片显色强度不一一切片显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着细胞和周围的结缔组织均无区别的着色色（五）结果观察和分析第二节第二节 免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术定义定义: :采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原光显微镜下，分辨出抗原( (或抗体）的所在位置及或抗体）的所在位

15、置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原到对抗原( (或抗体）物质定位、定性和定量测定的或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。目的。一、组一、组 织织 的的 处处 理理标本的类型：标本的类型： 涂片和印片涂片和印片 组织切片组织切片 铺片铺片 培养的粘附细胞培养的粘附细胞 悬浮细胞悬浮细胞 活细胞活细胞标本的保存标本的保存 ： 标本固定干燥后，最好立即检测标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置保持干燥、置44甚至甚至-20 -20 以下保存以下保存二、荧光抗体的标记及染色二、荧光抗体的标记及染色常用的荧光素：常用的荧光素： FI

16、TCFITC黄绿色；黄绿色；RB200RB200、TRITCTRITC橙红色；橙红色；PEPE红色；红色；AMCAMC蓝色；蓝色；Cy3Cy3橙红色；橙红色；Cy5Cy5红色；德克萨斯红橙红色红色；德克萨斯红橙红色 标记方法：标记方法：搅拌法、透析法搅拌法、透析法标记抗体的纯化：标记抗体的纯化：游离荧光素、未标记或过度标记游离荧光素、未标记或过度标记 蛋白的去除蛋白的去除标记抗体的质量鉴定：标记抗体的质量鉴定：抗体特异性、效价、荧光素抗体特异性、效价、荧光素 与蛋白质结合比率与蛋白质结合比率F/PF/P荧光免疫组化染色荧光免疫组化染色 直接法：直接法：优点：优点：操作简便、特异性高操作简便、特

17、异性高 缺点：缺点：敏感度偏低、抗体敏感度偏低、抗体制备麻烦制备麻烦 抗原标记抗体标本载玻片 间接法：间接法： 优点：优点：较直接法灵敏，标记一种抗较直接法灵敏，标记一种抗 体可以鉴定多种抗原体可以鉴定多种抗原 缺点：缺点：非特异荧光、操作时间较长非特异荧光、操作时间较长 补体法：补体法： 优点：优点：敏感度较高、标敏感度较高、标记一种抗体可以鉴定多记一种抗体可以鉴定多种种 抗原、适用于任何抗原、适用于任何动物的抗原抗体系统动物的抗原抗体系统 缺点：缺点：非特异荧光、需非特异荧光、需新鲜补体、操作麻烦新鲜补体、操作麻烦标本抗原抗体载玻片标记抗补体抗体固定补体双标记荧光免疫染色法：双标记荧光免疫

18、染色法：用两种荧光素分别标记用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时中的相应两种抗原同时显示显示 标记抗体A抗原A抗原B标记抗体B标本载玻片非特异性荧光产生非特异性荧光产生某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光抗体不纯所出现的交叉反应抗体不纯所出现的交叉反应标记抗体质量差，游离荧光素干扰标记抗体质量差，游离荧光素干扰 标记抗体浓度过高标记抗体浓度过高免疫荧光染色时间过长免疫荧光染色时间过长洗涤时间不够洗涤时间不够 非特异性荧光消除非特异性荧光消除用非免疫血清或用非免疫血清或10%10%牛血清白蛋白温育切片封闭非牛血清白蛋白温育切

19、片封闭非特异抗原位点特异抗原位点动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体将抗体的浓度调整到高稀释度将抗体的浓度调整到高稀释度选择适合的切片方法选择适合的切片方法封固剂、镜油必须无自发荧光封固剂、镜油必须无自发荧光用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景伊文氏蓝衬染法伊文氏蓝衬染法第三节第三节 亲合免疫组织化学技术亲合免疫组织化学技术第三节第三节 亲合免疫组织化学技术亲合免疫组织化学技术 亲和免疫组织化学技术亲和免疫组织化学技术是指一些具有是指一些具有双价或多双价或

20、多价结合力的物质价结合力的物质如植物凝集素、生物素和葡萄球菌如植物凝集素、生物素和葡萄球菌A A蛋白等对某种组织成分蛋白等对某种组织成分具有高亲和力的特点具有高亲和力的特点，可以，可以与标记物与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等等结合结合, ,可采用可采用荧光显微镜荧光显微镜、酶加底物的、酶加底物的显色反应显色反应、放射自显影放射自显影或或电子显微镜电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。行对应亲和物质的定位或定量。（一）亲合素（一）亲合素- -生物素生物素- -过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术（AVI

21、DIN BIOTIN PEROXIDASE COMPLEX TECHNIQUEAVIDIN BIOTIN PEROXIDASE COMPLEX TECHNIQUE，ABCABC）1.1.原理：原理：预先预先按一定比例按一定比例将亲合素与酶标生物素结合将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的形成可溶性的ABCABC复合物复合物。当其与检测反应体系中的。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，接法）相遇时，ABCABC中末饱和的亲和素结合部位即可中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与与抗

22、体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABCABC标记体系连成一体进行检测。标记体系连成一体进行检测。一、生物素-亲合素免疫组化技术待测抗原 非特异性抗原A-亲合素 B-生物素 E-酶ABC 直接法（一）亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC）一、生物素-亲合素免疫组化技术ABC 间接法待测抗原非特异性抗原A-亲合素 B-生物素 E-酶（一）亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC）一、生物素-亲合素免疫组化技术 优点

23、：优点： 敏感性高敏感性高 特异性高特异性高 一抗和二抗工作浓度低一抗和二抗工作浓度低 操作时间缩短操作时间缩短 可以多重标记可以多重标记 缺点：缺点：有些组织有内源性生物素活性，有些组织有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理需要对组织进行预处理 ABCABC复合物在中性时带正电荷，复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合与凝集素等碳水化合物结合（一）亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，A

24、BC）一、生物素-亲合素免疫组化技术（二）桥联亲合素-生物素技术（BIOTIN-AVIDIN BIND , BAB OR BRIDGED AVIDIN-BIOTIN TECHNIQUE， BRAB）1.1.原理：原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原因此，最终形成的

25、抗原- -生物素化抗体生物素化抗体- -亲合素亲合素- -酶标酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。测的灵敏度。BRAB 直接法待测抗原 非特异性抗原A-亲合素 B-生物素 E-酶（二）桥联亲合素-生物素技术（Bridged Avidin-Biotin technique， BRAB）BRAB 间接法待测抗原非特异性抗原A-亲合素 B-生物素 E-酶（二）桥联亲合素-生物素技术（Bridged Avidin-Biotin technique，

26、 BRAB）2.类型（三）标记生物素-抗生物素技术（LABELLED AVIDIN-BIOTIN TECHNIQUE，LAB）1.1.原理原理: :以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。抗体连接进行检测。（三）标记生物素-抗生物素技术（LABELLED AVIDIN-BIOTIN TECHNIQUE，LAB）2.2.特点特点 高灵敏度，高灵敏度， 省略了加标记生物素步骤，操作较省略了加标记生物素步骤，操作较BRABBRAB法简便。法简便。 间接间接LABLAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高法采用生物素化第二抗体，可进一步提高 检

27、测灵敏度检测灵敏度二、葡萄球菌二、葡萄球菌A A蛋白蛋白 免疫组化技术免疫组化技术1.1.原理：原理： SPASPA能与多种动物能与多种动物IgGIgG的的FcFc段结合，还可与荧光素、酶、胶体段结合，还可与荧光素、酶、胶体金、铁蛋白结合，通过抗原抗体反应，借助各种标志物进行金、铁蛋白结合，通过抗原抗体反应，借助各种标志物进行免疫学检测。免疫学检测。二、葡萄球菌二、葡萄球菌A A蛋白蛋白 免疫组化技术免疫组化技术优点：优点： 不受动物种属限制。不受动物种属限制。 易于穿透组织，提高了方法的敏感性。易于穿透组织，提高了方法的敏感性。 操作简便操作简便 染色时间短染色时间短 灵敏度高灵敏度高 背景

28、着色淡背景着色淡三、凝集素组化技术三、凝集素组化技术1.1.原理原理 凝集素（凝集素（lectinlectin）：从植物、无脊椎动物和高等动物）：从植物、无脊椎动物和高等动物中提取的糖蛋白，具有与特定糖基专一结合的特性。中提取的糖蛋白，具有与特定糖基专一结合的特性。三、凝集素组化技术三、凝集素组化技术直接法直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。白或糖脂相结合。三、凝集素组化技术三、凝集素组化技术间接法间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素

29、抗体与结合在细胞上的凝集素反应。凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应。间接法三、凝集素组化技术三、凝集素组化技术亲和素亲和素- -生物素法生物素法四、链霉亲合素四、链霉亲合素- -生物素法生物素法 链霉亲和素链霉亲和素- -生物素法生物素法第四节第四节 免疫电镜技术免疫电镜技术 免疫电子显微镜技术（免疫电子显微镜技术（IEMIEM）：）： 利用高电子密度的颗粒性标记物（胶体金、利用高电子密度的颗粒性标记物（胶体金、铁蛋白）标记抗体，或用经免疫组织铁蛋白）标记抗体，或用经免疫组织/ /细胞细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原

30、（抗体）进微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。行亚细胞水平定位的技术。常见标记技术 铁蛋白 酶 胶体金一、免疫标记电镜技术的操作程序一、免疫标记电镜技术的操作程序 1.1.取材取材 2.2.固定固定 3.3.包埋包埋 4.4.制片方法制片方法 （1 1）厚切片：冰冻切片震动切片。）厚切片：冰冻切片震动切片。 （2 2）半薄切片）半薄切片 （3 3）超薄切片）超薄切片 （4 4）冷冻超薄切片）冷冻超薄切片 （一）标本处理一、免疫标记电镜技术的操作程序一、免疫标记电镜技术的操作程序 1 1包埋前免疫标记包埋前免疫标记 2 2包埋后免疫标记包埋后免疫标记 3 3无包埋免疫标

31、记无包埋免疫标记（二）免疫标记一、免疫标记电镜技术的操作程序一、免疫标记电镜技术的操作程序 在电镜下观察免疫标记的结果，通过标在电镜下观察免疫标记的结果，通过标记物显示免疫反应部位。记物显示免疫反应部位。（三）结果观察与分析二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术 1.1.原理原理（一）铁蛋白标记免疫电镜技术抗体与铁蛋白通过低分子量的抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体偶联剂形成抗体- -铁蛋白复合物。铁蛋白复合物。二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术2.2.技术要点技术要点 （1 1）包埋前染色法：固定；免疫组化染色；）包埋前染色法：固定；免疫组化染色；包埋、切片；电镜观察。包埋、切

32、片；电镜观察。 （2 2）包埋后染色法：固定；包埋、切片；）包埋后染色法：固定；包埋、切片；免疫组化染色；电镜观察。免疫组化染色；电镜观察。（一）铁蛋白标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术3.3.方法评价方法评价 敏感性高敏感性高 特异性好特异性好 对细胞内抗原定位较困难对细胞内抗原定位较困难（一）铁蛋白标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术1.1.原理原理 用酶标记抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合，用酶标记抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合，酶被原位固定在细胞内，利用酶的高效率的催化酶被原位固定在细胞内，利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的

33、电子密度产物，作用对其底物的反应形成不同的电子密度产物，借助电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗借助电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位、定性原进行定位、定性。（二）酶标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术（二）酶标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术2.2.技术要点技术要点（1 1）酶标抗体包埋前染色法：固定。免疫组）酶标抗体包埋前染色法：固定。免疫组化染色。包埋、切片。电镜观察。化染色。包埋、切片。电镜观察。（2 2）PAPPAP包埋前染色法：固定。免疫组化染包埋前染色法：固定。免疫组化染色。包埋、切片。电镜观察。色。包埋、切片。电镜观察。

34、（3 3）PAPPAP法包埋后染色法：固定。包埋、切法包埋后染色法：固定。包埋、切片。免疫组化染色。电镜观察。片。免疫组化染色。电镜观察。（二）酶标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术3.3.方法评价方法评价 敏感性高敏感性高特异性好特异性好易穿透细胞膜易穿透细胞膜分辨率相对对于铁蛋白、胶体金标记要低。分辨率相对对于铁蛋白、胶体金标记要低。（二）酶标记免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术二、常用免疫电镜技术（三）胶体金标记免疫电镜技术前列腺内分泌-旁分泌细胞免疫胶体金染色显示有降钙素的沉积 胶体金标记物与镍网上待侧标本的相应蛋胶体金标记物与镍网上待侧标本的相应蛋白质发生结合反应，

35、胶体金标记物与蛋白结白质发生结合反应，胶体金标记物与蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，可对细胞膜合处，电镜下可见黑褐色颗粒，可对细胞膜或细胞内的蛋白质进行定性和定位。或细胞内的蛋白质进行定性和定位。原理原理 1.1.标本包埋标本包埋 2.2.免疫组化染色免疫组化染色 白蛋白封闭，加第一抗体，白蛋白封闭，加第一抗体，加胶体金标记加胶体金标记IgGIgG，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复复染，电镜观察。复染，电镜观察。技术要点技术要点三、临床应用与评价三、临床应用与评价 细胞悬液或单层培养细胞表面抗原的细胞悬液或单层培养细胞表面抗原的观察；观察；单层培养细胞内抗原的检测；单层培养细胞

36、内抗原的检测；组织抗原的检测。组织抗原的检测。（一）免疫金电镜染色技术的应用（一）免疫金电镜染色技术的应用三、临床应用三、临床应用 铁蛋白标记免疫电镜技术适用于细胞膜表铁蛋白标记免疫电镜技术适用于细胞膜表面抗原的定位检测。面抗原的定位检测。 酶标记免疫电镜技术可用于细胞内抗原定酶标记免疫电镜技术可用于细胞内抗原定位检测。位检测。 胶体金标记免疫电镜技术既可以用于细胞胶体金标记免疫电镜技术既可以用于细胞膜表面抗原检测，也可用于细胞内抗原检膜表面抗原检测，也可用于细胞内抗原检测。测。第五节第五节 免疫组织化学技术的临床应用免疫组织化学技术的临床应用 荧光免疫组织化学技术的应用：荧光免疫组织化学技术

37、的应用： 1. 在自身免疫性疾病中的应用 2. 细菌和病毒的快速鉴定 3. 寄生虫的检测与研究 酶免疫组织化学技术的应用：酶免疫组织化学技术的应用：1. 提高病理诊断准确性 2. 癌基因蛋白的临床应用3. 对肿瘤细胞增生程度的评价 4. 发现微小转移灶 5. 在肿瘤分期上的意义 6. 指导肿瘤的治疗免疫组织化学技术的临床应用 （一）荧光激活细胞分类仪（FACS） （二）共聚焦显微镜技术（三）免疫组织化学显微切割技术 免疫组织化学技术的拓展 第六节第六节 影响免疫组织化学技术的影响免疫组织化学技术的 主要因素主要因素 标本的处理 标本的主要来源各种体液及穿刺液活体组织培养细胞标本固定的目的：标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构。保存组织细胞抗原性。防止标本脱落。除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存。抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。 标本的固定与保存 固定剂的选择固定剂的选择: :蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定。微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶。多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定。如有粘液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去。类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙