生命科学超微量样本检测工作和紫外检测工作技术应用

1、生命科学超微量样本检测工作和紫外检测工作技术应用主要内容一、分光光度计检测原理二、超微量分光光度计NanoDrop三、NanoDrop一、分光光度计检测原理A:吸光度吸光度K:摩尔消光系数摩尔消光系数(Lmol-1cm-1)L:光路径（光路径（cm）C:物质浓度（物质浓度（mol/L）比尔-朗伯定律C=A/KL核酸的检测260法核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收的特性，最大吸收波长在250-270nm之间，形成核酸后期最大的吸收波长在260nm，吸收波谷在230nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：10OD260nm相当

2、于50g/mldsDNA、37g/mlssDNA、40g/mlRNA、30g/ml单链寡聚核苷酸蛋白的检测UV法280法比色法:LowryBradfordBCAUVmethod纯化的蛋白蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰简便，蛋白结构无破坏但是，不同的蛋白质具有不同的消光系数；核酸可引起强烈干扰ExPASy蛋白质序列数据库消光系数查找方式比色法所有蛋白显色原理试剂与蛋白质的肽键或其他基团反应，在特定波长下形成最高吸收峰。优点：受核酸等杂质的影响较小受氨基酸种类和数量的影响较小核酸、蛋白精确定量荧光法原理：荧光染料与核酸/蛋白特异结合，而不与

3、其他杂质结合。提高了检测的灵敏度和准确性传统分光光度计传统分光光度计清水清洗样品润洗1-2min二、二、 NanoDrop分光光度计分光光度计上样检测擦拭10s上样量最低为上样量最低为0.5ul节约宝贵的样本节约宝贵的样本 全光谱扫描全光谱扫描应用更广泛应用更广泛动态范围是动态范围是10mm比色杯检测的比色杯检测的200倍倍2ng-15000ng/ul dsDNA 专利技术专利液体表面张力技术的基座石英光纤高度抛光不锈钢套封马达基座，可自动调整光程应用核酸检测260/280260/230蛋白检测Microarray/Proteinlabels检测菌液检测全光谱扫描自定义方法1、核酸检测样品类型

4、寡核苷酸核酸检测结果核酸浓度A260吸收值A280吸收值260/280比值约为1.8(DNA)或者2.0(RNA)A260/230比值约为2、蛋白检测-UV法样品类型摩尔消光系数质量消光系数实例2摩尔消光系数实例3质量消光系数蛋白检测结果蛋白浓度A280吸收值A260/280比值约为0.53、蛋白检测-比色法以BCA方法为例，检测蛋白浓度dsDNA检测时，最常用的染料为PicoGreendye，PicoGreendye是一种新型的dsDNA染料：其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越4个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、

5、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。并被2010年版中华人民共和国药典选为药物残留DNA定量方法4、荧光法以PicroGreen方法为例，检测dsDNA浓度5、菌液OD检测OD600OD600 应用：应用：在诱导细菌蛋白表达时，可监视细菌生长的过程在诱导细菌蛋白表达时，可监视细菌生长的过程在制作感受态细菌时，可判断细菌生长的最佳时期在制作感受态细菌时，可判断细菌生长的最佳时期在检测时，会形成光散射当光穿过样品到达检测器时，部分光会损失，因为样品能吸收部分光在细菌悬液中，由于产生了光散射，穿过菌液到达检测器的光减少了，从而会导致样品OD值增大的假象。监测细菌的生长,OD600在不同仪器上检测在不同仪器上检

6、测OD600的结果：的结果：OD600的检测受到两大因素影响：仪器的光学部件；检测的样品类型ND的比色皿模块和基座都可以进行菌液检测：用ND检测菌液的优势NanoDrop2000c基座检测菌液时应注意：基座检测时，最大的光程为1mm，注意将得到的OD值乘10，以便得到10mm下的OD值进行后续分析。基座检测时，应充分混匀，并取2mL菌液进行检测新应用拓展一、Microarray/Protein&labels二、检测细胞的死活率三、对染料工业产品进行质控四、纳米粒子定量一、在DNAMicroarrays中的质控纯化的RNA纯化的DNAcDNA加入荧光染料杂交数据分析Y Y Y Y Y Y

7、Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y在ProteinArrays中的质控纯化的蛋白或细胞裂解液杂交数据分析加入标记蛋白或荧光二抗Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY Y Y Y Y YMicroarray/Proteinlabels检测在Microarray/Proteinlabels实验中，对核酸/蛋白与染料的结合效率质检染料编辑细节FOI标记效率FOI(Frequency Of Incorporation)FOI(Frequency Of Incorporation)Cy3Cy3标记标记RNARNA的的FOI=(OD550/0.15)FOI=(OD550/0.15)* *

8、(324)/(OD260(324)/(OD260* *40)40)Cy5Cy5标记标记RNARNA的的FOI=(OD650/0.25)FOI=(OD650/0.25)* *(324)/(OD260(324)/(OD260* *40)40)FOI20FOI20时时, ,说明染料杂交效率高，染料十分匹配；说明染料杂交效率高，染料十分匹配；20FOI1520FOI15时时, ,说明染料杂交比推荐值低，但勉强可以用；说明染料杂交比推荐值低，但勉强可以用；FOI15FOI20 可用Cy5标记RNA的FOI=(OD650/0.25)*(324)/(OD260*40) =(0.002/0.25) *324/

9、(0.119*40) =0.54415 不建议使用二、用ND检测细胞死活率P. Michel et al ; NanoDrop based method for the rapid determination of viability decline in suspension cultures of animal cells, Analytical Biochemistry 430 (2012) 138-140传统检测细胞的死活率是用台盼蓝染色法而随着细胞的死亡数量增加，细胞破裂后释放出的游离蛋白也会增加，所以，我们通过用A280检测游离蛋白的含量来检测细胞的死活率。用ND检测细胞死活率的优

10、势应用：细胞培养、诱导细胞蛋白表达等应用：细胞培养、诱导细胞蛋白表达等传统的检测细胞的死活率是用台盼蓝染色法，但要用试剂染色，要在显微镜下计数，非常麻烦。通过用A280检测游离蛋白的含量来检测细胞的死活率；无需任何试剂，减少实验误差。举例：荧光素钠做为着色剂应用于军事、医疗和化妆品等行业；三、对染料工业产品进行质控染料出厂时，对染料的浓度进行质控，这对于确保着色的重复性有非常重要的意义！用ND，在490nm处检测荧光素钠的浓度用ND进行染料质控的优势浓度跨度1000倍的样品，仍能形成非常好的线性关系ND非常广的动态范围，可以保证高浓度和低浓度的样品都能精确检测无需稀释避免误差；不锈钢的基座耐腐

11、蚀；重复性非常好四、纳米粒子定量纳米粒子大小为1-100nm纳米金粒子（纳米金粒子（NP）的）的SPR分析分析直径为13nm，最大吸收峰为520nm；利用520nm处的OD值来进行NP浓度的测定；在很广的浓度范围里，线性都非常好；消光系数（即斜率）为3X1010M-1cm-1，与文献报道中的一致。用ND进行纳米粒子定量的优势应用：纳米疏水药物研发、肿瘤化疗纳米药物研发、纳米材料研究等应用：纳米疏水药物研发、肿瘤化疗纳米药物研发、纳米材料研究等1、超微量的上样量：节约珍贵的样品纳米材料通常不易获得且成本非常高，所以超微量的上样可以节约一大笔的经费；2、非常广的浓度检测范围能在很广的浓度范围里，得

12、到很好的线性来计算消化系数。三、三、NanoDrop家族家族ND2000ND2000cNDLiteND8000ND3300ND2000基础型基础型LessLess： 更微量更微量专利的液体表面张力技术，仅需专利的液体表面张力技术，仅需0.5l0.5l的样本的样本 更简单更简单大多数样本无需稀释，直接上样大多数样本无需稀释，直接上样 更快速更快速不到五秒钟即可得到完美的检测结果不到五秒钟即可得到完美的检测结果 MoreMore： 更宽更宽190-840nm190-840nm，可以测定低波长下的蛋白光吸收，如多，可以测定低波长下的蛋白光吸收，如多肽的肽的205nm205nm光吸收光吸收 更高更高检

13、测上限高达检测上限高达15,000 ng/l (dsDNA)15,000 ng/l (dsDNA) 更灵活更灵活- -提供多种检测模式提供多种检测模式 更新更新- -软件提供多种检测方式，且接受用户自定义软件提供多种检测方式，且接受用户自定义的检测的检测ND 2000c全能型全能型悬浮细胞/细菌培养检测范围：0.4-750ng/l（dsDNA）控温精确：370.5搅拌速度：150-850rpmFeatureBenefit比色皿检测1台既可用于微量样品检测又可用于传统的光谱检测的分光光度计比色皿进行细胞培养测定节省金钱和实验室空间 无需另购仪器（分光光度计或细胞密度计进行微生物细胞培养检测动力学

14、测定（具有温控功能）用于酶动力学和生长曲线测定基座检测+比色皿检测ND 8000高通量型高通量型显示多达8个样本的全波长数据（220-750nm）核酸浓度和纯度测定（2.5-3700ng/L,dsDNA)蛋白浓度和纯度测定（0.15-100mg/mL，BSA）上样托架LED指示灯用户自定义检测方法NanoDrop Lite精巧型精巧型小巧精干：260nm、280nm检测核酸的浓度和纯度，蛋白的浓度无需电脑标签打印机（可选）标签打印机特殊低温打印标签兼容实验室有机溶剂 -196到70稳定打印关键样本信息大标签用于样品管或记录本中小标签用于样品管盖ND 3300荧光分光光度计荧光分光光度计1.上样量1L，节约宝贵的样本2.三组高性能LEDUV:365nmBlue:470nmWhite460-650nm3.覆盖400-750nm光谱，无需更换滤光片4.预置检测方法自定义检测条件5.无需校正维护注意：它不适合做光谱扫描Other Samples其他其他 4-Methyl UmbelliferoneCy3/Alexa555Cy5/Alexa647Fluorescein-FITC-FAMQuinine SulfateDylight