分子生物学实验理论与操作教程牡丹江医学院

1、分子生物学实验理论与操作教程分子生物学实验理论与操作教程中国农科院研究生院中国生化及分子生物学学会植物病虫害生物学国家重点实验室二零零四年七月目录前言-I第一部分 核酸提取-1实验一：基因组DNA提取-1实验二：总RNA提取-3第二部分 亚克隆技术-8实验三：质粒DNA提取-8实验四：DNA片段的酶切-9实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷-12实验六：DNA片段的连接-13实验七： DNA片段的回收-15第三部分 PCR技术-18实验八：PCR产物的克隆技术-18八1：T-载体构建 -19八2：PCR产物的T-载体克隆-20八3：PCR产物的平端克隆技术-21实验九：RT-PCR技术-21实验十

2、：定量PCR -25第四部分 文库构建技术-29实验十一：mRNA的提取及纯化 -29实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成-32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染-34实验十三：2,RACE技术-36第五部分 核酸杂交技术-40实验十四：DNA探针的标记-40实验十五：Southern杂交技术-44第六部分：基因及基因产物检测技术-48实验十六：DNA的测序技术-48实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译-53 2，基因的诱导表达-54实验十八：报告基因的应用-57实验十九：Western杂交技术-58第七部分 基因表达轮廓技术-67实

3、验二十：DD-PCR技术-73实验二一：SSH技术-74第八部分：遗传转化技术-75实验二二：感受态细胞制备-75实验二三：重组基因的转化及筛选-77实验二四：原生质体分离-78实验二五：农杆菌转化技术-79第九部分：分子标记技术-80实验二六：RFLP技术-86实验二七：RAPD技术-86实验二八：AFLP技术-87实验二九：SSR技术-89第十部分：细胞技术-89实验三十：细胞凋亡-89十一：附录 一-92 二-96第一部分 核酸提取目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、RT- PCR及RAC

4、E技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。实验一:基因组DNA的提取DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根

5、据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。方法1，基因组总DNA的大量提取本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。一：仪器高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM Na

6、Cl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液三:操作动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织)液氮,研碎10ml裂解液(含1/10体积酚),(65预热), 加入等体积氯仿,65放置30分钟，间隔510min轻摇一次,离心(12000-15000rpm, 15min )上清液静止下0.6体积冷异丙醇,0.1体积3MpH5,2乙酸钠, 挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥,2mlTE(或水)10ulRNase，65,10-30分复溶和除RNA等体积酚/氯仿,氯仿抽提（轻轻混匀、冰浴沉淀

7、5min，5000RPM离心5min，取上清）上清液2V无水乙醇、1/10VnaAC,-20,2或-80，30min 10000RPM,10min沉 淀 70%冷乙醇洗涤真空干燥干粉-20保存，或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20或4保存四：鉴定所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。注意:1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解2，酚一定要碱平衡3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促

8、进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.方法二：细菌基因组DNA的微量提取法本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；及100%乙醇三：操作1.5ml

9、 对数生长期细菌细胞离心，5000rpm,1min沉淀溶于500l TE缓冲液中混匀 30l 10%SDS,3L蛋白酶，混匀，37,1小时 100l NaCL(5M) 混匀 80l的CTAB/NaCL,*混匀；65 10min（可不做）加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心12000rpm,4-5min取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。注意，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。 2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。方法三：酵母菌基

10、因组DNA的提取一：仪器：同方法一二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前三：操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞离心，12000rpm,1-2min沉淀溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37,1hr离心，12000rpm,8-10min 沉淀溶于100L，0.5l蛋白酶，混匀，37,1hr加入1.2ml的CTAB/NaCL,200l20%PVP 混匀 65,30min等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心,12000rpm

11、,4-5min上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。实验二：总RNA的提取 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有的提取过程中都有五个关键点，即）：样品细胞或组织的有效破碎；），有效地使核蛋白复合体变性；），对内源酶的有效抑制；）有效地将从和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2),直接在酸性条件

12、下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。方法一:总RNA的试剂盒快速提取一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿

13、混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。一：仪器恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽二：试剂RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇操作步骤(一):细胞或组织破碎A:微生物材料：发酵天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理)：用经DEPC处理的水洗菌丝

14、体次，并尽量除去残存的水：加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA：研磨后的样品转移至ml变性液的容器中匀浆。B:动植物细胞培养材料(适用的样品量为细胞:108)1:细胞或组织培养:按常规方法进行2:深层悬浮培养细胞的破碎: (1)细胞收集:含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4,3000g离心5分钟 (2)细胞洗涤:上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4,3000g离心5分钟, (3)细胞破碎:在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆3:表面培养细胞的破碎: (1)确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108 (2)细胞收集

15、:将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大. (3)用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次. (4)将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞.C:植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织) (1)将600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟. (2)将0.05g新鲜组织用液氮冰冻 (3)在液氮下,研磨组织块

16、 (4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中.D:动物组织破碎(适用的样品量为1克组织) (1)将12毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟. (2)在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎.注1:研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2:变性液及相应的离心管需预冷 (二):RNA的抽提 在经变性液匀浆的细胞或组织600ul60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600ul酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒冰裕中10-15分钟, 离

17、心,4，10000g,20分钟上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70,30分钟沉淀RNA 离心4，10000g,20分钟沉淀RNA,冷冻干燥15分钟, RNA沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡(有时为了帮助溶解，可在65加热，但时间应极短)60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600ul酚氯仿异戊醇(25241),彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒冰裕中10-15分钟, 离心,4，10000g,20分钟上层水相吸至无菌离心管中等体积异丙醇二次沉淀(-70,30分钟),乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中(对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至

18、终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，保存。)注：1变性液组成：25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM-巯基乙醇)，65溶解，过滤灭菌，4预冷。2酸性酚配制：55时，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。方法二:氯化锂法提取总RNA本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失

19、的缺陷。仪器：同上试剂：氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】悬浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】其余同上操作步骤：1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入510ml氯化锂尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中 2：匀桨液在04放置4小时后，12000g离心30分钟 3：取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2 4：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯

20、化锂尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置1530分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟 5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20放置1小时，5000g离心。 6：70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于70保存。方法三：蛋白酶热酚法本方法适合于病毒RNA的提取仪器：同上试剂：蛋白酶K（终浓度50ug/ml）2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6) 0.2MnaCL其余同上操作：1，提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,3740-50分钟2，加入等体积65预热的酚溶

21、液，轻徭,在65保温5分钟后再轻徭。3，离心，取上清，氯仿抽提一次4，取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。5，70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6，RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于70保存。上面介绍了一些核酸（DNA、RNA）提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。以下一些原则和建议对核酸提取的操作可能会有一定的裨益。1：在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌

22、酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。2：有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到5060，并将反应时间缩短到1525min，但酶用量必须提高1020倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。3：许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防

23、止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。4：许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法（1）CTAB多次抽提。（2）在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。（3）在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，

24、因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。5：在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。6：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。7：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀

25、对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。8：在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，70下>30min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。9：在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。10：核酸提取后可通过PCR 、RTPCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中

26、筛选出完整基因。有关这些内容在下面各篇幅中会详细介绍。第二部分：基因克隆技术目的基因的克隆是分子生物学实验中的核心内容，起着承上启下的作用，通过克隆技术可实现目的基因的无限扩繁、长期保存的目的；利用该技术能实现基因重组、基因改造、构建工程菌和转基因动植物。基因克隆技术主要包括载体的获取、酶切、脱磷、连接和转化及筛选、鉴定等内容。本部分将介绍除基因鉴定外的其他内容。实验三：质粒DNA的提取和纯化整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程中携带外源基因的工具为载体。载体有1）在宿主细胞中具独立复制能力；2)带抗性等选择标记；3)有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的

27、外源DNA而不影响自身复制的特点。目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿主细胞，有不同选择标记的克窿载体或表达载体。这些载体有以下几类：1)宿主为大肠杆菌的细菌质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、拈粒和卡粒等；2)宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统（YAC）为代表的酵母菌质粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体；3)以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体；4)宿主为植物细胞的Ti质粒、植物病毒及带有真核启动子的改造质粒；5)动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。在上述所有载体中通用型大肠杆菌质粒载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具

28、极多的内切酶特异序列、许多具互补性质等特点而成为最基本的通用克隆载体。在克隆操作中往往都是将待克窿片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。大肠杆菌质粒多为一些双链、环状的DNA分子，其大小范围从1Kb-200以上Kb不等，它们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体裂

29、解方法主要有煮沸法，SDS法，碱解法,Triton-溶菌酶法等。质粒DNA的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等，但由于目前所用质粒的复制量极大，小量常规制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及探针标记等方面的工作需要。在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果：1培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌2培养菌应在37,220rpm下,生长16-18小时3不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。下面介绍几种质粒DNA提取的方法：方法一: 碱解法提取质粒DNA本方法适合于质

30、粒DNA的微量提取一：仪器超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪二：试剂：Solution 50mM 葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4保存：Solution II 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4保存：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4保存：氨苄青霉素50mg/ml,：溶菌酶：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)：异丙醇：LB培养基10:

31、电泳试剂见附11:TE缓冲液三：操作步骤含氨卞（100ug/ml）的LB培养基培养菌体 37 200rpm 过夜吸取1.5ml 离心，5000rpm,1min沉淀( 充分去除LB培养液) 加入预冷的100ul Solution ,充分振荡悬浮 加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,加入150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min离心,12000g,5min取上清酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心5000g 5min上清0.6体积的异丙醇,室温,5min, 离心,12000g,5min沉淀冷冻干燥 悬于50ldd水或TE RNA酶至20ng/ul37-6

32、5，30-60分钟(可不做)酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀（-70，15min/-20,2 hr） 离心 10000g，5-10min沉淀 冻干复溶 -20保存电泳鉴定注：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。 4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测

33、序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒DNA如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA实验四： DNA片断的酶切技术限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶

34、片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。本部分实验主要通过EcoR，Hind III两种限制性内切酶对DNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术一：仪器：离心机、恒温水浴、取液器、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪二：试剂EcoR,Hind ,DNA/Hind及DNA/EcoR标准质粒（或其他DNA样品）（浓度>

35、; 0.5g/l） TAE缓冲液三：操作 (一)EcoR 、Hind 单酶切及双酶切 1, 取支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入(l) B(l)灭菌水33 EcoR 缓冲液 Hind 缓冲液DNA （或质粒DNA）4 4 EcoR Hind 总体积 ，37保温4小时3，保温结束后65-7010min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)4，取2l左右的反应液加入2l电泳加样缓冲液，电泳（二）EcoR 、Hind III双酶切 1,取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂加入试剂体积（l）灭菌水 1MULT buffer2DNA（或质粒DNA） 4 EcoR Hind

36、 总体积 2，37保温小时，保温结束后65-7010min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)，取2l左右的反应液加入2l电泳加样缓冲液，电泳注意：，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀，反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在2030ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于，而此浓度将抑制内切酶活性。 4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模

37、板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。 5，本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法 a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCL及第二种酶，继

38、续保温。b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。在上述3种方法中遇到最多的可能为C 6，在水解结束灭活酶时可采用65加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。有关DNA限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。实验五:酶切片断的脱磷技术在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线

39、状DNA上去除5'磷酸基团，而DNA的脱5'磷酸基团是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3端为羟基、5端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5脱磷后,载体在5与3位均为羟基不能自连只有与带5磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。一：仪器离心机恒温设备真空干燥机取液器二：试剂碱性磷酸酶、DNA酶切片段、酚、氯仿、0.5M EDTA(pH 8.0) 、SD

40、S、 TE缓冲液、电泳缓冲液、7.5M NH4AC(pH 7.5)×碱性磷酸酶缓冲液： 10mM ZnCL 10mM MgCL 100mM Tris-HCL(pH 9.0)三：操作：在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入10×碱性磷酸酶缓冲液 10l碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1-2ulddH2O 到 100ul对于5突出则37下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37下温浴30分钟.对于平末端或3突出末端,则37下温浴15分钟,56下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37下温

41、浴15分钟. 56下温浴15分钟：温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，65加热20min，以灭活碱性磷酸酶：用酚、氯仿各抽提一次：加入1/2体积NH4AC，充分混匀，再加入体积的乙醇，20放置2hr（或7030分钟），12000g离心10分钟，沉淀DNA。：冷70%乙醇洗沉淀一次：TE溶解（终浓度为100g/l），-20保存四:检测将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连.注：1, pmol ends=3.04×ugDNA/DNA的碱基数2，在上述几个实验中，有机溶剂

42、沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NH4AC，如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。3,碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在6810SDS条件下级可灭活，因此实验中一般都采用CIP。实验六: 基因的重组连接技术DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA联接酶催化，但

43、分子生物学实验中主要采用T4DNA联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外

44、源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。A：溶液中连接一：仪器离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器二：试剂 T4DNA联接酶10×T4DNA联接酶缓冲液 200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT 500g/ml 牛血清白蛋白(可

45、不用) DNA/HindIII 酚/氯仿、酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)三:操作： 1:取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液T4DNA联接酶缓冲液1ul载体DNA片断 1ng插入目的片断 Xng连接酶1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u)加无菌水到10ulX=目的片断与载体片断的分子比例×载体ng数×目的片断的碱基数/载体ng数（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1）2:连接反应22保温3小时或4过夜(Promega连接酶,粘端连接)或22-261hr(BRL连接酶,粘端连接)或224-16hr(Promega连接酶

46、,平端连接)或1416-24hr(BRL连接酶)B：胶内连接：该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的DNA量、载体量及酶量都要增加。一：仪器：同A二：试剂：同A三：操作1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断2：65保温彻底溶化琼脂，取18ul（约）于一新管内再加入2ul载体（约）混匀，37510m

47、in3：配制2×T4DNA连接酶反应体系20ul，（其中含2×T4DNA连接酶缓冲液和不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后置于冰浴4：将预冷的2×T4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中立即混匀后立即置于冰浴中待凝固5：置于12连接过夜。6：此连接片断可直接用于转化，即转化前65溶化，取510ul转化。注1：粘端连接时模板DNA用量控制在间，而平连时模板量应>0.5ug。拈连时温度可在4过夜，而平连时最好在1216过夜2：用于转化的连接片断最好不要冰冻3：胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中

48、的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。实验七: DNA片断的回收技术目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等，下面分别介绍树脂、微量柱及液氮冻冻融回收技术。方法一：树脂回收技术本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。dsDNA长度bp20015003002007550回收率%6096996932一：仪器离心机电泳议电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置二：PCR片断纯化试剂盒 80异丙醇三：操作（一）从琼脂糖介质中纯化DNA片断1:用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方