兽医微生物学试验指导精

1、兽医微生物学实验指导畜牧兽医教研组编龙岩学院00六年十月编写说明本实验指导配合兽医微生物学使用，目的是训练学生掌握兽医微生物学最基本的实验操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的兽医微生物学理论知识，同时，通过实验培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是，严肃认真的科学态度；为以后课程的学习和将来的工作以及科学研究打下坚实的基础。本实验指导是在参考有关院校的兽医微生物学实验教材的基础上，结合我们的实验室条件以及仪器设备状况，经过多方取舍编写而成，可供生物科学系师生参考。由于编者水平有限，加上时间仓促、经验不足，在许多方面肯定有不少缺点与错误，希望各位读者批评指正。在编

2、写过程中，得到龙岩学院生物系全体师生的大力支持，在此表示感谢。编者2006.10实验一微生物染色法1实验二培养基的配制和灭菌7实验三细菌的分离与培养10实验四双向免疫扩散试验13实验五凝集反应17实验六酶联免疫吸附试验（ELISA）20实验七细菌各论（1）23实验八细菌各论（2）26实验九病毒的鸡胚培养28实验十病毒的血凝及血凝抑制试验31实验一微生物染色法一、目的要求1、学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。2、了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。3、学习掌握细菌芽抱染色方法。二、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必

3、须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀

4、死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法所以能将细菌分

5、为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或

6、丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三、实验器材1、菌种：苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。3、草酸钱结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸储水、双料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀绿溶液。四、方法步骤（一）单染色步骤：1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸储水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。

7、4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7、镜检：油镜观察并绘图。（二）革兰氏染色步骤1、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S和E（见图示），并滴一滴蒸储水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。2、干燥与固定：方法同（一）中2,3步骤。图示3、染色：结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-干燥-镜检记录。（三）细菌的芽抱染色1、制备菌液

8、：加1-2滴蒸储水于试管中，从斜面挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。2、加染色液：加5%孔雀绿2-3滴于试管中用接种环搅拌，使其充分混合。3、加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。4、涂片：从试管底部挑菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜，晾干。5、固定：将涂片通过微火3次。6、脱色：水洗，直到流出的水中无绿色为止。7、复染：加番红染色2-3分钟后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸去余水，于酒精灯火焰上烘干。8、镜检：用油镜观察绘图五、结果与思考1、绘图记录观察结果菌种颜色属性芽泡染色革兰氏染色放大倍数_X放大倍数_X菌种菌种游离芽抱颜色颜色菌体颜色属性芽抱囊颜色2、

9、在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？3、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？4、为什么芽抱要采用复染色法？（芽抱和菌体分别染成什么颜色）实验二培养基的配制和灭菌一、实验目的1 .了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2 .了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具体操作方法。二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能

10、力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100c下融化，于45c以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。、实验器材1 .药品及试剂：可溶性淀粉KNO3目K2HPO43H20MgsO47H2OFeSO47H2O1mol/LNaOH琼脂2 .仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（5.5-9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻纯、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠。四、方法步骤（

11、一）培养基的制备与分装1 .称量按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。2 .熔化在沸水浴锅中加热熔化。3 .调pH用INNaOH调pH至7.4-7.6。4 .过滤趁热用多层纱布过滤（本实验勿需过滤）5 .分装将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，装量不超过试管的1/4,注意管口不要沾上培养基。6 .加棉塞然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。（二）无菌水的制备7 .用量筒量取45ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。8 .用5ml吸管取4.5ml水

12、于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（三）器皿的准备9 .培养皿的包装每6套一包，用旧报纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。10 .吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。11 .玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。（四）培养基、无菌水、器皿的灭菌12 .将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌13 .灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。14 .器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。五、思考题1 .培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？2 .加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？3 .干热灭菌

13、应该注意哪些事项？4 .管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么实验三细菌的分离与培养一、实验目的掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象二、基本原理从混杂的细菌群体中获得只含有一种或某一株细菌的过程称为细菌的分离与纯培养。平板划线法是最常用的方法之一，通过沾有样本的接种环在平板上划线，将样本稀释”，培养后使之形成单个菌落，从而达到分离的目的。三、实验材料沙门氏菌、大肠杆菌、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯四、实验步骤（一）平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一

14、点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使-10-平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6,此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，

15、再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37c温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。（二）液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白陈水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在

16、液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中。3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37c温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。（三）半固体穿刺接种法-11-用途：观察细困动力，保存困种。方法：1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37c温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。（四）斜面培养基接种法用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。操作方法：1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，

17、自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37c温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。五、结果与思考题1、结果描述各接种方法细菌的生长情况2、思考题如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？-12-实验四双向免疫扩散试验、实验目的并熟练掌握免疫扩散法的操作步骤掌握其在抗血清效价的测定和特异性抗体的分析中的应用。二、实验原理在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见

18、的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向免疫扩散

19、法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互-13-扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。另外沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之问的异同点，因而应

20、用范围较广。三、实验器材1 .材料和试剂(1) PH8.6,0.1M巴比妥巴比妥钠缓冲液(2) 1%预复琼脂(或琼脂糖)(3) 1%琼脂糖凝胶。(4) 猪瘟标准抗原及被检免疫血清。2 .设备和器材玻璃板、模具，打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒(内铺有湿润的滤纸)、温箱(25C)、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。四、实验步骤1 .预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥(或自然干燥)，即可用以制备凝胶板。-14-2 .凝胶板的制备溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约34mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所

21、需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）梅花型:3 .免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25c中，一般保温2448h,观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血精的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。五、结果与思考题-15-1

22、.结果写出所测免疫血清效价2.思考题本实验操作应注意哪些事项?-16-实验五凝集反应一、实验目的掌握凝集反应的概念、原理及操作方法和注意事项二、实验原理颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应的抗体结合，在适量电解质（通常是0.85%NaCl）存在的条件下出现凝集现象，称为凝集反应。凝集反应的方法有两种：直接法；间接法。颗粒性抗原与抗体直接结合，出现凝集现象，称为直接凝集反应。如玻片凝集反应和试管凝集反应。将可溶性抗原预先吸附于一种与免疫无关的颗粒性载体表面，然后与相应的抗体结合，出现凝集现象，称为间接凝集反应。三、实验器材玻璃板、微量移液器、蜡笔、布氏阳性血清、阴性血清、生理盐水、布氏平板凝集抗原

23、、火柴、被检血清、96孔微量反应板、猪瘟间接血凝试验抗原、被检血清、稀释液。四、实验步骤（一）布氏平板凝集1、蜡笔打格子，每个格子为2cm*2cm,横为6个。2、用吸管按0.08ul、0.04ul、0.02ul、0.01ul量加入前4格被检血清，第5格加入阳性血清、第6格加入阴性血清。-17-3、各格中加0.03ul布氏平板凝集抗原。4、用火柴棒将抗原和相应液体血清搅匀。5、3-5分钟观察凝集现象。牛、马在0.02ul格中出现凝集（相当效价是1:100）,猪、羊在0.04ul格中出现凝集（相当效价是1:50）为阳性。说明该家畜已感染布氏杆菌病。（二）猪瘟间接血凝试验1、在96孔微量反应板一排1

24、8孔内加50ul稀释液，2、第1孔加50ul被检血清，对比稀释为1:2,混匀，在此孔吸50ul到第2孔，混匀为1:4,以此类推，至U7孔，并把7孔混匀后，弃去50ul,第8孔为阴性对照。3、用移液器各吸25ul猪瘟间接诊断抗原，加入1-8孔内，应从后向前加抗原。4、把微量反应板放微量振荡器上摇2分钟，后置37度湿盒内作用1、5-2小时。5、观察血凝结果，不凝集的孔，红细胞沉入孔底尖部，凝集时，红细胞铺满孔底。（猪瘟抗体合格是，1:16以上。）五、结果与思考题1、结果（1）描述玻板凝集试验各血清量中凝集现象及结果（2）列出所检测的猪血清，布氏抗体和猪瘟抗体效价2、思考题（1）、何为前滞、后滞现象

25、?-18-(2)、血清学反应为何要设阳性、阴性对照?(3)、试述本试验操作的注意事项。-19-实验六酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的1、掌握ELISA试验的原理、方法和优点2、了解ELISA在实际生产中的应用二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）的基本原理是通过化学和免疫学的方法，将酶标记在抗原或抗体上（酶结合物），使其保持免疫学、生物学活性。当酶结合物与相应的抗体或抗原发生反应时，就可形成即有免疫学活性又有酶活性的抗原-抗体-酶”的复合物，然后加入相应的酶底物，借助酶的催化作用，无色的底物发生水解，氧化或还原反应等，形成有色的或电子致密的不溶性产物。这种产物用肉眼、分光光度计、

26、普通显微镜或电子显微镜都可以观察，从而判定样品中抗原或抗体的存在。由于颜色反应的深浅与样品中相应抗原或抗体含量成正比，所以对样品的测定即可以定性又可以定量。三、试验材料猪瘟抗体检测ELISA试剂盒、被检血清（耳静脉或前腔静脉无菌采血3-5毫升，分离血清，冷冻保存（但应避免反复冻融），备用）、移液器、酶标仪四、实验步骤1、用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板中，置湿盒于4c过夜。-20-2、弃去孔内液体。用洗涤液冲洗板3次，每次间隔3-5min,拍干。3、用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加100微升。同时，将猪瘟

27、阳性、阴性血清以100倍稀释作对照，37c培育1.5-2小时。4、重复第2步。5、用稀释液将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37c培育1.5-2小时。6、重复第2步。7、每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫升+底物缓冲液5毫升+30%过氧化氢18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（当阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。8、每孔加入终止液50微升，于酶联读数仪上测定490纳米（nm）波长的光密度（OD）。判定标准在猪瘟弱毒酶联板上：OD书.2为猪瘟弱毒抗体阳性；OD<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。在猪瘟强毒

28、酶联板上：OD菊.5为猪瘟强毒抗体阳性；OD<0.5为猪瘟强毒抗体阴性。五、结果与思考题1、结果列出各血清OD值，计算结果，判定被检血清猪瘟抗体情况。2、思考题（1） ELISA法为什么说是一种较敏感的血清学方法？（2） ELISA法操作时应注意哪些事项？如何判定结果？-21-22-实验七细菌各论（1）一、实验目的1 .了解几种常见病原性球菌的主要生物学性状.2 .掌握致病性葡萄球菌的鉴定方法.二、实验原理病原性球菌主要指葡萄球菌，链球菌，肺炎球菌，脑膜炎球菌，淋球菌等，这些细菌经常引起人类的化脓性疾病，故又称化脓性球菌，这些细菌在革兰氏染色，形态及培养等方面各有特性，熟悉掌握这些特点，

29、在临床进行微生物学检查时，即可做出正确的初步判断，以便做进一步的有关试验，如致病性，耐药性，分型（血清型，口I菌体型）等。致病性葡萄球菌的鉴定，方法很多，一般实验室常根据以下的特点来鉴定：1.产生金黄色色素.2.对家兔或绵羊红细胞有溶血作用.3.厌氧条件下分解甘露醇产酸不产气.4.血浆凝固酶试验阳性。血浆凝固酶试验多数致病性金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使含有构檬酸钠或吁素抗凝剂的人或兔等动物血浆发生凝固，凝固血浆沉积于菌体表面，阻碍细胞吞噬，即使被吞噬，不易被杀死。葡萄球菌感染灶局限化，也与此酶有关。在临床微生物学检查中，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。血浆凝固酶试验有

30、玻片法和试管法两种。三、实验材料-23-金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌(白葡)、化脓性链球菌24小时血琼脂平板培物、生理盐水，接种环，酒精灯，革兰氏染液，载玻片，蜡笔，兔血浆(14稀释)，毛细吸管，37c水浴箱。四、实验步骤1 .观察化脓性球菌在血琼脂平板上的菌落大小，表面，边缘，透明度，溶血性及颜色，观察记录结果。2 .形态染色的检查取一洁净载玻片，在背面分成4格标号。(2)每一格取23接种环生理盐水后，分别取金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌(白葡)、化脓性链球菌，制成的细菌涂片，注意每取一种菌前，接种环要经火焰灭菌。(3)革兰氏染色后，油镜观察各菌的染色特性及形态排列，记录结果。3、血浆凝固酶试验(

31、1)取洁净玻片一张，于两端各加兔血浆一滴。(2)用接种环取金黄色葡萄球菌苔一环，在玻片一端兔血浆中研磨混匀，接种环灭菌后再取白色葡萄球菌苔一环，在另一端兔血浆中研磨均匀。(3)观察兔血浆有无凝集现象。五、结果与思考题1、结果-24-(1)观察化脓性球菌在血琼脂平板上的菌落大小，表面，边缘，透明度，溶血性及颜色，观察记录结果。(2)油镜观察各菌的染色特性及形态排列，记录结果。(3)血浆凝固酶试验结果2、思考题(1)葡萄球菌与链球菌的血平板培养特点有何相似之处常需做哪些实验检查来区别？(2)鉴别葡萄球菌有无致病性的方法有哪些？-25-实验八细菌各论（2）一、实验目的1 .掌握肠道条件致病菌与肠道致

32、病菌的菌落特点。2 .掌握肠道杆菌的主要生化反应。3 .初步了解肠道杆菌的分离鉴定方法。二、实验原理肠道菌科的细菌为革兰氏阴性杆菌，大多数有鞭毛，能运动。少数无鞭毛不能运动，不产生芽胞，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐（欧文氏菌属例外）。这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。鉴别肠道杆菌一般用生化反应作初步鉴定，然后再根据各种菌的抗原特异性作进一步的鉴定（包括血清学试验和特异性噬菌体的溶菌试验）。肠道杆菌营养要求不高，在普通培养基上

33、能生长，大多形成中等大小，表面光滑形态相似的菌落，因而也不能做为鉴别的依据。但它们生化反应活泼，对糖和蛋白质可产生不同的代谢产物，可借生化反应鉴别各种肠道菌，特别是肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多数分解乳糖，临床上常用此特性分离肠道致病困。三、实验材料（大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌）的1824小时琼脂斜面培养物、中国蓝培-26-养基，SS琼脂的1824小时培养物、五管糖及双糖铁培养基的1824小时培养物。生理盐水、接种环、载玻片、酒精灯、革兰氏染色液、蜡笔等。四、实验步骤1 .取载玻片，用蜡笔分成4格，于每格放23接种环生理盐水。2 .用接种环分别取大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌制成涂片，

34、注意无菌操作。3 .革兰氏染色后镜检，记录结果。4 .观察各种细菌在不同培养基中的生长特点及生化反应情况，分别将结果填入实验报告。五、结果与思考题1、结果(1)观察各种细菌在不同培养基中的生长特点及革兰氏染色结果(2)各菌在不同培养基上的生化反应情况2、思考题(1)观察各种细菌在不同培养基中的生长特点有何不同？(2)如何鉴别肠道菌属？主要有哪些方法？-27-实验九病毒的鸡胚培养一、实验目的1、了解动物病毒鸡胚培养的意义和用途2、掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊液收获的方法二、实验原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和

35、试验以及抗原和疫苗的制备等。鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。各种病毒接种鸡胚均有其最适宜的途径，故应注意选择。本实验用鸡新城疫病毒(Newcastle-diseasevirus)接种鸡胚。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊腹腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。三、实验器材新城疫病毒液；白壳受精卵(自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好)；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5%碘酒，70%-2

36、8-酒精，银子，剪刀，封蜡(固体石蜡加1/4凡士林，溶化)，灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。四、实验步骤1 .准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育(37C,相对湿度是4560%),孵育三日后，鸡卵每日翻动12次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。2 .接种用孵育10-

37、12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。(a)将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。(b)将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。(c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液。(d)用石蜡封孔后于37c孵卵器孵育72小时。3 .收获-29-(a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。(b)用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。(c)将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4c以下的温度中保存。(d)观察鸡胚，看有无典型的症状。五、结