消化道酶活力

1、第四章 牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度 对消化酶活力的影响牛蛙(Rana catesbeinana)隶属两栖纲无尾目蛙科，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是有名的肉用型蛙类。牛蛙具繁殖快、适应性强、生长迅速和抗逆性强等优点，且其养殖饲料易取。在我国，牛蛙的人工养殖得到了大规模推广1。研究消化酶的活力及其影响因素可了解动物对食物不同成分的消化能力，为动物天然饲料的选择、优质人工饲料的配制和适宜养殖条件的确立提供理论基础，对提高动物养殖的经济效益无疑是有帮助的。目前，对低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在经济养殖型鱼类2-9和爬行类10，对两栖类消化酶的研究报道较少11-14。奚刚等14对牛蛙幼体

2、发育阶段消化道蛋白酶和淀粉酶的活力变化情况进行了研究。有关成体牛蛙消化系统消化酶分布情况及各种理化因子对牛蛙消化酶活力的影响方面的研究尚未见报道。pH和温度是影响牛蛙生活的重要环境因子，其可通过影响消化酶活力直接影响牛蛙对食物的消化吸收能力，并最终影响牛蛙的生长发育。本文在检测牛蛙消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分布情况的基础上，对pH和温度对牛蛙消化酶活力的影响进行了研究，旨在增进对牛蛙消化生理特点的认识，为牛蛙人工养殖中环境因子的控制和饲料营养成分的合理搭配提供理论依据。1 材料与方法 1.1 实验材料 鲜活的成体牛蛙购自芜湖市黄山西路菜市场，重250300 g。将牛蛙毁髓处死，剖

3、腹，迅速取出胰脏和完整消化道。将消化道剪开，用4 预冷的0.65 %的生理盐水快速洗净，按食道、胃、前肠、中肠和后肠(直肠)取材，用吸水纸轻轻吸干，称重。1.2 酶液的制备 根据所称得的消化系统各部分的质量，加入20倍质量的4 蒸馏水，在冰水浴中充分匀浆，捣成糜状，以2000 r/min的速度冷冻离心15 min，取上清液即为酶液。保存于4冰箱中，8 h内分析完毕。1.3 消化酶活力的测定 蛋白酶活力的测定 采用福林-酚试剂法11，略有改动。取0.5 mL 1 %的酪蛋白溶液于试管中，分别加入不同pH值的缓冲液2 mL，混匀，30 水浴预热5 min。在反应管中按食道、胃、前肠、中肠、后肠和胰

4、脏顺序分别加入0.25 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.5 mL、0.5 mL和0.5 mL预热的粗酶液。恒温水浴锅控制反应温度，充分反应15 min。立即加入1.5 mL 10 %的三氯乙酸终止反应，静置15 min。对照管在加入10 %三氯乙酸后再加酶液。过滤，取滤液1 mL，加0.55 mol/L的Na2CO3 5 mL，福林-酚试剂1 mL，摇匀。在30 水浴中显色15 min。用7200型分光光度计，680 nm 波长条件下测光吸收值。以30 下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸作为1个酶活力单位(U)。 脂肪酶活力的测定 采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法4。取缓冲液2.5 mL和

5、聚乙烯醇橄榄油乳化液2 mL于锥形瓶中，30 保温5 min，然后在锥形瓶中加入1.0 mL酶液，30 下反应30 min后立即加入95 乙醇5.0 mL终止反应，再加3滴酚酞，用0.05 mol/L氢氧化钠滴定，对照组在加入95 乙醇后再加酶液，其余与实验组相同。以30 下每分钟作用于聚乙烯醇橄榄油乳化液产生的脂肪酸最后消耗1 mL 0.05 mol/L的NaOH为1个酶活力单位（U）。 淀粉酶活力的测定 采用3,5-二硝基水杨酸比色法4 ，略有改动。取0.665 mL预测粗酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液0.665 mL，混匀，将反应组置于30 恒温水浴锅中预热510 min，同

6、时对照组在100 沸水中煮510 min（使酶失活）。再向反应组和对照组试管中加入已预热的1 %的淀粉溶液0.67 mL，摇匀，于30 水浴反应20 min后再加入2 mL的3,5-二硝基水杨酸，摇匀。立即放入100 沸水中显色5 min，使酶失活并终止反应，流水冷却后稀释10倍，用7200型分光光度计，490 nm波长条件下比色，测光吸收值。以30 下每分钟水解淀粉产生1 mg麦芽糖作为一个酶活力单位（U）。 纤维素酶活力测定 采用羧甲基纤维素钠水解法4。取1.0 mL酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液3.0 mL，0.5 %羧甲基纤维素钠溶液0.8 mL，蒸馏水0.6 mL，混匀4

7、0 水浴糖化30 min，取出立即置于沸水浴15 min，对照组先置于沸水浴中使酶失活，其余步骤相同。取0.5 mL糖化液加3,5-二硝基水杨酸1.5 mL，沸水浴15 min，冷却，加蒸馏水3 mL，用7200型分光光度计，于550 nm处测吸光值。以40 每分钟催化纤维素生成1.0 g葡萄糖为一个酶活力单位（U）。1.4 pH梯度的设置利用不同pH值的缓冲液来调节反应的pH条件。实验中共使用4种缓冲液，以KCl-HCl配制的缓冲液，以Na2HPO4 -柠檬酸配制的缓冲液，以巴比妥钠-盐酸配制pH 8.0-9.6的缓冲液，以甘氨酸-氢氧化钠配制的缓冲液。胃消化酶的pH值范围为1.0、1.5、

8、2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，共9个pH值梯度。肠和胰脏消化酶的pH值范围为4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6和10.0，共9个pH值梯度。1.5 温度梯度的设置设置15 、20、25 、30 、35 、40 、45 、50 、55 和60 共10个温度梯度，根据上面所测胃、肠和胰脏各自的最适pH值，选择对应的缓冲液按上述方法分别测定胃、肠和胰脏在不同温度条件下的消化酶活力。1.6 数据处理实验数据取3次测量的平均值（±SD），用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较，P<0.0

9、5为差异显著。2 结果2.1 牛蛙消化酶的分布牛蛙消化系统不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力见表1。由表4-1可知，牛蛙消化系统三种消化酶的活力均以胰脏最高，显著高于其它部位（P<0.05）。在消化道中，蛋白酶活力以胃最高，显著高于食道和肠道（P<0.05）。肠道各段间、肠道各段和食道间蛋白酶活力差异不显著（P>0.05）。脂肪酶活力在消化道各段由前至后逐渐增加，肠道脂肪酶活力显著高于胃和食道（P<0.05），其中后肠脂肪酶活力显著高于前肠和中肠（P<0.05），胃和食道间脂肪酶活力大小差异不显著（P>0.05）。淀粉酶活力主要分布于肠道，肠道各段淀粉酶活

10、力显著高于胃和食道（P<0.05），肠道各段间淀粉酶活力差异不显著（P>0.05）。食道和胃淀粉酶活力大小相当，差异不显著（P>0.05）。我们还对牛蛙消化道纤维素酶的活力进行了检测，结果未观察到明显的酶活力。表4-1 牛蛙消化酶分布n=3; ±SD; Unit: U/g食道esophagus胃stomach前肠foregut中肠midgut后肠hindgut胰脏pancreas蛋白酶活力Activity of protease14.5b±2.5116.6a±17.37.98b±4.724.7b±8.03.63b±1

11、.6118.6a±24.3脂肪酶活力Activity of lipase0.14d±0.010.18d±0.020.27c±0.020.29c±0.050.36b±0.073.67a±0.10淀粉酶活力Activity of amylase0.14c±0.010.17c±0.021.02b±0.091.12b±0.081.05b±0.043.34a±0.05注：上标不同的平均值间差异显著，a > b > c > d（P < 0.05）2.2

12、pH对消化酶活力的影响2.2.1 pH对蛋白酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏蛋白酶的活力变化情况见图1。由图4-1可知，三个部位蛋白酶活力与pH关系均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和9.6。胃蛋白酶在pH值范围内显示较强的活力，pH值为2.2时最高，pH值大于2.2后胃蛋白酶的活力急剧下降，pH值为6.0时酶活力只有最大活力的5.0 %左右。肠蛋白酶活力在pH值范围内变化较平缓，在pH值范围内随pH值的升高而快速升高，在pH值7.4时达到最大值，pH值继续增大时酶活力逐步下降。胰蛋白酶活力在pH值大于4.0时迅速增加，pH值为9.6时达最大值，pH值为10.0时胰蛋

13、白酶活力又迅速下降。图4-1 pH对蛋白酶活力的影响2.2.2 pH对脂肪酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏脂肪酶的活力变化情况见图4-2。由图4-2可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活力与pH关系曲线均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和8.0。胃脂肪酶活力在pH值范围内上升较快，pH值为2.2时达最大值，pH值大于3.0后胃脂肪酶的活力又不断下降，pH值为7.4时酶活力只有最大活力的17.0 %左右。肠道脂肪酶活力在pH值为范围内迅速上升，在pH值为7.4时达到最大值，而后又迅速下降；胰脂肪酶活力在pH值小于7.0时变化较平缓，pH值大于7.0时急剧上升，pH值为8.0时酶活

14、力达最大值，而后迅速下降。图4-2 pH对脂肪酶活力的影响2.2.3 pH对淀粉酶活力的影响 不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏蛋白酶的活力变化情况见图4-3。由图4-3可知，胃、肠道和胰脏淀粉酶的最适pH值分别为7.0、8.0和9.6。胃淀粉酶活力与pH关系曲线呈双峰型，pH值对淀粉酶活力影响很大。当pH值为2.2时有一个较小的峰值，接着在pH值值为7.0时又有一个较大的峰值，且此时酶的活力大约是pH为2.2 时的4-5倍。肠道和胰脏淀粉酶活力与pH的关系曲线均呈单峰型。在pH值小于7.0时，肠淀粉酶活力变化较平缓，pH值大于7.0时酶活力急剧上升，到pH值为8.0时达最大值，pH值继续升

15、高时酶活力又急剧下降。胰淀粉酶活力在pH值大于5.0时上升较快，pH值为9.6时达最大值，然后随pH值升高酶活力又急剧下降。图4-3 pH对淀粉酶活力的影响2.3 温度对消化酶活力的影响 温度对蛋白酶活力的影响 不同温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏蛋白酶的活力变化情况见图4-4。由图4-4可知，胃、肠和胰脏蛋白酶活力与温度的关系曲线均呈单峰型，最适温度分别为45 、50 和45 。胃蛋白酶活力随温度上升变化较平缓。肠蛋白酶活力受温度影响较大，从15 到50 肠蛋白酶活力上升了4-5倍，温度高于50 后，酶活力又迅速下降。胰蛋白酶活力在15 45 范围内随温度升高迅速增加， 45 达最大值，其后随温

16、度的上升酶活力又迅速下降。图4-4 温度对蛋白酶活力的影响 温度对脂肪酶活力的影响 不同温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏脂肪酶的活力变化情况见图4-5。由4-5可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活力与温度的关系曲线均呈单峰型，最适温度均为50 。胃脂肪酶活力随温度上升变化较平缓。肠道和胰脏脂肪酶活力在15 -45 范围内变化不大，45 以后则迅速上升，在50 达到最大值，此后在50 -60 范围内酶活力又迅速下降。图4-5 温度对脂肪酶活力的影响 温度对淀粉酶活力的影响 不同温度条件下，牛蛙胃、肠和胰脏淀粉酶的活力变化情况见图4-6。由图4-6可知，胃、肠道和胰脏淀粉酶活力与温度的关系曲线均呈单峰型，最适

17、温度均为35 。胰淀粉酶活力随温度上升变化较平缓。胃和肠道淀粉酶活力随温度上升变化较大。当温度从15 上升到35 时，胃和肠道淀粉酶活力上升了2-3倍，35 时，酶活力达到最大值。当温度继续上升时，酶活力又迅速下降。当温度达到55 时, 胃和胰脏淀粉酶活力几乎为零，当温度高于60 时，肠道淀粉酶也基本上失去了活力。图4-6 温度对淀粉酶活力的影响3 讨论3.1 牛蛙消化酶的分布本研究在牛蛙消化系统中检测到了蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，未检测到明显的纤维素酶活力。蛙类通常属肉食性动物，但牛蛙消化系统中具淀粉酶活力，这提示在配制牛蛙饲料时可适当添加淀粉性成分。牛蛙消化系统中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的

18、活力均以胰脏最高，表明胰脏是牛蛙消化酶的重要分泌器官。不同消化酶在牛蛙消化道中的活力分布差异较大，蛋白酶的活力以胃中最高，这与黑斑蛙11和虎纹蛙12的相一致。脂肪酶活力则主要分布于肠道，特别是后肠。淀粉酶活力亦主要在肠道，以中肠较高。牛蛙消化酶活力的分布型表明其对食物中蛋白质性成分的消化主要在胃中进行，而对脂肪和淀粉性成分的消化主要在肠道中进行。根据牛蛙的这种消化特点，在配制牛蛙饲料时，不妨考虑制作复合饲料，外层以蛋白质性成分为主，内层适当包裹淀粉和脂肪性成分。牛蛙吞食饲料后，首先在胃中消化饲料外层的蛋白质性成分，在肠道中进一步消化饲料内层的淀粉和脂肪性成分，这样不仅可提高牛蛙的消化效率，而且

19、可提高饲料的利用率，降低养殖成本。3.2 pH对消化酶活力的影响酶的活力受pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出其活力。有关pH对蛙类蛋白酶活力的影响有一些报道，黑斑蛙11和虎纹蛙12的胃、肠道和胰蛋白酶的最适pH值分别为1.5、7.4和9.6，而黑眶蟾蜍13的胃蛋白酶最适pH值为2.2，肠蛋白酶最适pH值为9.6。牛蛙胃、肠道和胰蛋白酶的最适pH值分别为2.2、7.4和9.6，与这些蛙类基本一致。有关pH对蛙类脂肪酶和淀粉酶活力影响的报道较少，牛蛙胃、肠道和胰脂肪酶的最适pH值分别为2.2、7.4和8.0，其胃脂肪酶的最适pH值比鱼类2,3的低，这可能与牛蛙胃内的生理

20、pH值较鱼类低有关。肠道脂肪酶的最适pH值与多数鱼类2-4和中华鳖10的相似。牛蛙胃、肠道和胰淀粉酶的最适pH值分别是7.0、8.0和9.6，在中性或碱性范围，这与多数鱼类5-8和中华鳖10淀粉酶的最适pH在碱性或中性偏酸性范围内相一致。牛蛙胃淀粉酶活力受pH影响曲线出现了两个峰值（pH2.2和pH7.0），这与许氏平鮋(Sebastes schlegeli) 5的胃淀粉酶相似，导致这种情况的原因尚不清楚。我们测得牛蛙饱食后胃和肠道内生理pH值分别为和7.09.0，可见牛蛙饱食后消化道各部位的生理pH与不同消化酶的最适pH是相适应的。3.3 温度对消化酶活力的影响牛蛙属变温动物，其适宜的生存温

21、度范围为5-35 ，牛蛙蛋白酶和脂肪酶最适温度要远远高于其栖息的环境温度，这种现象在鱼类也普遍存在3,8,9。温度对酶反应的影响很大，酶的蛋白质本性决定了其对温度的高度敏感性，温度升高，一方面使酶促反应的速度加快，另一方面也加速酶活力的丧失，因而最适温度随反应时间延长而下降。在离体测定条件下，酶作用时间较短，而在正常生活条件下，酶消化食物所用的时间相当长，这就可以解释为什么最适温度会高于生理温度的现象。但在离体条件下测定的消化酶最适温度可反映消化酶的热稳定性和温度对酶活力的影响规律。牛蛙消化道蛋白酶的最适温度为45 或50 ，脂肪酶的最适温度为50 ，而淀粉酶的最适温度仅为35 ，表明牛蛙蛋白酶和脂肪酶的抗热性比淀粉酶强。根据牛蛙消化酶的这一特性，在牛蛙的人工养殖中，当环境温度升高时，在适当增加投喂量的同时，可考虑在饲料中适当增加蛋白质和脂肪性成分的配比，减少淀粉性成分的配比。参考文献1 曾中平.牛蛙的养殖技术M.北京:金盾出版社,1999.2 吴仁协,戈薇,洪万树,等.大弹涂鱼成鱼消化酶活性的研究J.中国水产科学,2007,14(1):99-105.3 付新华,孙谧,孙世春,等.大菱鲆消化酶活力J.中国水产科学,2005,12(1):26-32.4 沈文燕,寿建听,祝尧荣,等.银鲫消化酶活力