微生物发酵提高玉米豆粕型日粮营养价值的初步研究

1、微生物发酵提高玉米豆粕型日粮营养价值的初步研究摘要: 对玉米 豆粕型日粮进行混菌固态发酵，以去除其中的抗营养因子。研究结果表明，发酵饲料的抗原蛋白发生了大幅的降解，发酵后蛋白质相对分子质量主要集中在 18 kDa 以下，小于5 kDa的小分子肽含量从发酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白质的体外消化率提高了 4 0 个百分点。发酵饲料的棉子糖家族寡糖被彻底降解，其淀粉含量降低了 3 5 个百分点，直链淀粉含量提高了4 13 个百分点，有益的代谢产物乳酸等有机酸的含量达到 2 78% ，pH 下降至 4 43。关键词: 玉米; 豆粕; 微生物; 发酵Abstract: Corn soyb

2、ean meal diet was fermented by mixed strains via solid state fermentation to removethe anti nutrient factor The results showed that antigen proteins in fermented feed were degraded sharp-ly The relative molecular weight of proteins after fermentation were gathered below 18 kDa，and peptidesbelow 5 kD

3、a were increased from 1 35% to 3 60% ，accordingly the protein digestibility in vitro was in-creased 4 0% Besides，raffinose family oligosaccharides were degraded thoroughly，while the starch con-tent decreased 3 5% ，the amylose increased 4 13% ，organic acids content including lactic acid reached to2 7

4、8% ，and the pH decreased to 4 43Key words: corn; soybean meal; microbe; fermentation目前，国内饲料主要以玉米 豆粕型为主，其中玉米作为主要的能量饲料，常常占到日粮组成的60% 左右，而豆粕是动物日粮中蛋白质的主要来源，提供饲料工业 75% 的饲用蛋白1。豆粕和玉米中含有的多种抗营养因子制约着玉米 豆粕型日粮的利用率，影响动物的生长性能。玉米 豆粕型日粮中的抗营养因子主要是抗原蛋白和棉子糖家族寡糖等。抗原蛋白主要是大豆球蛋白( 11S) 与 伴大豆球蛋白( 7S) ，能够引起动物腹泻、生长受阻等过敏反应2 4。棉

5、子糖家族寡糖主要是棉子糖和水苏糖等低聚糖，由于动物小肠黏液中缺乏 半乳糖苷酶，这些低聚糖不被消化而直接进入大肠中，被结肠中的微生物发酵产生甲烷和二氧化碳等气体，引起动物胃肠胀气5。目前，通过添加酶制剂可以有效降解此类抗营养因子，2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 国 油 脂27但由于酶底物专一性的限制和处理成本偏高，目前在大宗饲料原料的处理上使用缺乏经济性。因此，处理成本相对低廉的微生物发酵法日益受到人们的青睐和重视。发酵方法不但可以有效消除各类抗营养因子，而且可以产生多种功能性和营养性的乳酸、小肽等有益代谢物，既提高了饲料的营养价值和利用效率，还可以赋予饲料特殊气味，提高动物适口性。

6、本研究通过混合固态发酵法去除玉米 豆粕型日粮中的抗营养因子，均衡其蛋白结构和氨基酸组成，并改善淀粉结构组成，同时积累有益的代谢产物，提高饲料的营养价值。1 材料与方法1 1 材料玉米粉、豆粕、麸皮购自无锡市三里桥粮油市场; 胃蛋白酶( 110 000) 、胰蛋白酶( 1 250) 、 淀粉酶和马铃薯直链淀粉购自 Sigma 公司; 蛋白质标准购自 MBI Fermentas 公司; 其他试剂均购自中国医药集团上海试剂公司。预制硅胶层析板购自青岛海洋化工有限公司。枯草芽孢杆菌、酵母和乳酸菌均为本实验室保藏的菌株。1 2 发酵饲料的制备枯草芽孢杆菌、酵母和乳酸菌分别以 5% 的接种量接种于 100

7、 g 原料( 玉米粉 60 g，豆粕 20 g，麸皮 20 g) 中，料水比为10 8，35发酵48 h，65烘干，粉碎得到发酵饲料。1 3 淀粉含量测定1 3 1 总淀粉含量测定粉碎的样品脱脂、洗去可溶性糖后，在 淀粉酶作用下水解，再用盐酸水解成单糖，最后按还原糖测定，并折算成淀粉含量6。1 3 2 直链淀粉含量测定样品经 1793 改良提取器脱脂，之后分散在氢氧化钠溶液中，向一定的试样分散液中加入碘试剂，然后使用分光光度计于 720 nm 处测定显色复合物的吸光度7。参照马铃薯直链淀粉标准曲线计算出样品中直链淀粉含量。1 4 低聚糖的测定81 4 1 样品制备准确称取粉碎玉米 豆粕型日粮(

8、 60 目)10 000 g，加入 50 00 mL 80% 的乙醇，水浴 70 浸提 1 h 以上，过滤取上清液，用 80% 乙醇洗涤 3 次，合并滤液，用真空旋转蒸发仪浓缩至 5 mL 左右，定量转移到 25 mL 容量瓶中，并以 80% 的乙醇定容。样品液用低温高速离心机于 12 000 × g、4离心 1min，4 保藏备用。1 4 2 TLC 检测采用 TLC 方法直接观察棉子糖和水苏糖的降解情况，在预制硅胶层析板上点样，点样量为 5 L，点样后用展开剂( 体积比1101 的正丙醇 乙酸 水) 展层，展开至离前沿 2 cm 处，用 1% 1 萘酚的含 10%正磷酸的 95%

9、乙醇溶液显色，烘箱 100保温 10 min。1 5 蛋白含量及氨基酸组成测定粗蛋白含量的测定: 凯氏定氮仪测定; 氨基酸的测定: 氨基酸自动分析仪测定。1 6 抗原蛋白测定分别精确称取发酵前和发酵后的样品各 1 00g，用 0 03 mol / L Tris HCl 缓冲液( pH 8 0) 10 00mL 浸提 1 h，然后于 3 000 × g、4 离心 10 min，取上清液，再于 10 000 × g、4离心 10 min，4 保藏备用。SDS PAGE 按照参考文献9进行。1 7 小分子肽含量测定参考大豆肽粉的测定方法测定玉米 豆粕型日粮中肽的含量。酸溶蛋白的含

10、量减去游离氨基酸的含量即为肽的含量10。1 8 蛋白质的体外消化率蛋白质的体外消化率采用胃蛋白酶和胰蛋白酶两步法测定11。1 9 总酸含量的测定总酸含量按照参考文献12进行，结果以乳酸含量计。2 结果与讨论2 1 蛋白含量及氨基酸组成的变化采用凯氏定氮法测定发酵前后饲料中的粗蛋白含 量 ，结 果 表 明 粗 蛋 白 含 量 由19 16% 提 高 到20 74% 。利用氨基酸自动分析仪测定发酵前后饲料中氨基酸组成的变化，结果如表 1 所示。表 1 发酵前后饲料中氨基酸组成的变化 %组 成 发酵前 发酵后 组 成 发酵前 发酵后赖氨酸 0 76 0 88 甘氨酸 078 092蛋氨酸 0 21

11、0 29 苏氨酸 050 057天冬氨酸 1 68 1 90 精氨酸 100 115谷氨酸 3 34 3 76 丙氨酸 092 110丝氨酸 0 84 0 94 酪氨酸 047 050组氨酸 0 43 0 45 半胱氨酸 018 020亮氨酸 2 37 2 75 缬氨酸 085 098脯氨酸 2 42 2 83 苯丙氨酸 087 099异亮氨酸 1 07 1 22 总计 1603 18262 8CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 3从表 1 可以看出，发酵后氨基酸总量从原来的16 03% 提高到 18 26% ，各种氨基酸成分也比发酵前均有所提高，其中赖氨

12、酸提高了 15 79%，蛋氨酸提高了 38 01%。2 2 抗原蛋白的变化豆粕中的蛋白质主要包括大豆球蛋白( 11S) 和 伴大豆球蛋白( 7S) ，其中 伴大豆球蛋白包括、'和 3 种亚基。这些抗原蛋白及各种抗营养因子影响动物的生长率、营养物质的吸收，影响肠内环境导致过敏，造成的免疫反应导致氨基酸结构发生变化，影响蛋白质结构和稳定性等13。采用 SDS PAGE 电泳法测定发酵后抗原蛋白降解情况，结果如图 1 所示。从图 1 可以看出，发酵后大分子蛋白特别是抗原蛋白明显降解，而小分子蛋白含量增加。在 SDS PAGE 电泳图的基础上考察了发酵前后玉米 豆粕型日粮中相对分子质量在 5

13、kDa 以内的小分子肽含量的变化情况，结果发现发酵后小分子肽含量从1 35% 提高到 3 60% 。小分子肽能完整地通过肠黏膜细胞进入体循环14，它的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点15，此外小分子肽还具有促进肌红细胞复原，促进微量元素吸收，能提高动物的生产性能16。2 3 蛋白质体外消化率的变化微生物发酵后，大分子蛋白质结构的变化以及小分子蛋白质含量的提高都会影响动物的消化率。采用胃蛋白酶 胰蛋白酶两步法测定发酵前后饲料蛋白质的体外消化率，结果如图 2 所示。从图 2 可以看出，日粮中蛋白质的体外消化率从发酵前的85 9% 提高到 89 9% 。说明小分子肽和氨基酸含量的提高，

14、以及大分子蛋白质结构的变化都有助于提高蛋白的消化率。2 4 淀粉含量与组成的变化玉米中碳水化合物含量在 70% 以上，因此玉米具有很高的营养价值，是一种重要的能量饲料。但是玉米淀粉中含有非淀粉多糖等抗营养因子，动物食用后需在体内多种淀粉酶作用下水解为可利用的糖类，才能被吸收利用，因此淀粉在动物消化道内可能会因为得不到很好地调控而限制了其营养作用的充分发挥，甚至会造成动物吸收利用慢、利用率低等问题1。发酵前后饲料中淀粉和直链淀粉的含量如表 2 所示。表 2 发酵前后淀粉含量的变化 %项 目 发酵前 发酵后淀粉含量 57 9 54 4直链淀粉含量 8 39 12 52从表2 可以看出，发酵后淀粉含

15、量降低了35 个百分点，而直链淀粉含量提高了 4 13 个百分点。在微生物作用下玉米淀粉部分水解为糖类，并被微生物所利用，产生乳酸等小分子含碳物质，这类物质更容易被动物消化、吸收利用，有助于改善能量饲料的品质，提高饲料适口性，动物采食后可为其持续供应能量。同时，微生物发酵过程中产生的异淀粉酶等淀粉水解酶将支链淀粉切割成不同的直链淀粉片断，改变了淀粉的分子结构，使直链淀粉含量增加，改善了饲料的营养成分，相应提高了饲料的单位能量值。2 5 棉子糖家族寡糖的变化微生物发酵可以有效地降解引起动物胀气的棉子糖家族寡糖，发酵前后棉子糖和水苏糖的 TLC分析结果如图 3 所示。从图 3 可以看出，发酵后棉子

16、糖和水苏糖被完全降解。另外，棉子糖和水苏糖的降解对提高饲料的代谢能和蛋白质消化率都有好处，Irish等17研究发现，消除棉子糖家族寡糖后，饲料的代谢能可以提高 7% ，氮存留可以提高 4 4% 。2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 国 油 脂292 6 总酸含量的变化发酵饲料中乳酸菌的大量增殖提高了乳酸含量，会对饲料有酸化作用，可降低动物胃肠道 pH，抑制病原菌繁殖，调节动物肠道微生态环境，促进动物健康等18。通过测定发酵前后饲料的 pH 和总酸含量后发现，发酵饲料的 pH 从原料的 6 24 下降到4 43，乳酸含量达到了 2 78% 。3 结 论采用微生物发酵玉米 豆粕型日粮不但成

17、本低，对饲料营养成分破坏小，还可以同时去除多种抗营养因子。研究表明，发酵玉米 豆粕型日粮，淀粉含量降低了 3 5 个百分点，直链淀粉含量提高了4 13个百分点。抗原蛋白和棉子糖家族寡糖发生了大幅的降解，发酵后蛋白质相对分子质量主要集中在 18 kDa 以下，小于 5 kDa 的小分子肽含量从发酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白质的体外消化率提高了 4 0 个百分点。氨基酸的组成和含量也有一定的变化和提高。有益的代谢产物乳酸的含量达到2 78% ，pH 下降至 4 43，创造的酸性环境可以有效抑制饲料中病原菌的生长。发酵后的玉米 豆粕型日粮的营养价值得到明显改善，其动物饲养方面有待进一

18、步深入研究。参考文献:1赵敏，李长忠 非淀粉多糖酶在家禽玉米 豆粕型日粮中的应用J 安徽农业科学，2007，35( 11) : 3269 3270，32732何学军，齐德生 大豆抗营养因子及豆粕的质量评价J 饲料研究，2006( 5) : 32 343周风珍，张玲华，邝哲师，等 不同处理方法对豆粕抗营养因子的消除效果研究J 广东饲料，2005 ( 5) :35 364ZEECE M G，BEARDSLEE T A，MARKWELL J P，et alIdentification of an IgE binding region in soybean acidicglycinin G1J Foo

19、d Agr Immunol，1999，11( 1) : 83 905陈斌 微生物发酵对豆粕中抗营养因子及营养价值的影响D 杭州: 浙江大学，20056GB/T 5009 92008，食品中淀粉的测定方法S7 GB/T 156832008，大米直链淀粉含量的测定方法S8蔡国林，杨旭，曹钰，等 微生物发酵对豆粕营养价值的影响J 中国油脂，2008，33( 10) : 21 249陆健 蛋白质纯化技术及应用M 北京: 化学工业出版社，200510GB/T 224922008，大豆肽粉S11王潍波，赵国琦，韩庆广，等 胃蛋白酶 胰蛋白酶体外消化豆粕适宜条件的研究J 中国饲料，2009( 2) :41 4312蔡国林，郑兵兵，王刚，等 微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究J 中国油脂，2010，35( 5) :31 3413SONG Y S，PREZB V G，PETTIQREW J E，et al Fer-mentation of soybean meal and its inclusion in diets fornewly weaned pigs reduced diarrhea and measures of im-munoreactivity in the plasma J Anim Feed Sci Techn-ol，2010，15: