生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案

1、 HYPERLINK https:/ 生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案目录国内外生物制品病毒安全性法规概览 3生物制品病毒安全性控制国内相关法规列表 4生物制品病毒安全性控制国外相关法规列表 5生物制品病毒安全性控制核心理念及进展 8病毒安全性控制核心理念 8病毒安全性控制风险评估 9生物制品中病毒清除的工艺解决方案 11病毒去除研究的基本考虑 11案例分享：亲和层析的病毒清除研究 13除病毒过滤方法 15去除 / 灭活病毒能力的验证需要特殊考虑的问题 16总结 17参考文献 18国内外生物制品病毒安全性法规概览生物制品的一个共同特点就是存在病毒污染的风险。动物源性组织、细胞、体液及重

2、组真核细胞表达制备的生物制品，其动物源性病毒感染人类的风险性极高。由于动物本身健康检疫状况差，不同动物携带的病毒外源因子复杂多变，可控性因素尚不确定，对人体的潜在危害性较之经过系统鉴定和严格控制的真核细胞表达的生物制品风险更高。鉴于此，国内外关于生物制品病毒安全性控制，已经出台了一系列技术要求和指导原则，采取综合措施贯彻病毒安全性控制理念。因此，建立生物制品病毒安全性控制的技术要求对于保证药品的安全性和有效性具有重要的意义。根据药品注册管理办法和药品生产质量管理规范要求，由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品等需要进行病毒灭活工艺验证和生产过程控制。例

3、如：生化药品 GMP 附录对病毒去除 / 灭活及验证的必要性、适用性、有效性等提出具体的要求，明确规定基于风险控制原则，结合品种特性和原材料来源，采用有效去除 / 灭活病毒工艺步骤和方法。病毒去除 / 灭活工艺的有效性验证可参照有关病毒去除 / 灭活技术方法和指导原则等相关规定。病毒去除 /灭活的同时，不应对产品质量有不良影响。在生产工艺发生变更时，应重新评估病毒去除 / 灭活工艺的适用性。病毒去除/ 灭活验证不能代替原材料及生产过程的质量管理要求。生物制品病毒安全性控制国内相关法规列表发布时间文件名称阐述重点适用范围2002血液制品去除 / 灭活病毒 技术方法及验证指导原则病毒去除 / 灭活

4、技术及验证血液制品2002关于进一步加强牛源性及其相关药品监督管理的公告污染源控制 , 原材料控制生物制品2003人用单克隆抗体质量控制技术指导原则单克隆抗体制品的综合要求单克隆抗体2003人用重组 DNA 制品质量控制技术指导原则重组 DNA 制品的综合要求重组 DNA 制品2003细胞培养用牛血清生产和质量控制技术指导原则污染源控制 , 原材料控制生物制品2005生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则病毒安全性评价单克隆抗体 / 重组 DNA 蛋白制品 /生物组织 / 提取制品2005疫苗生产用细胞基质的技术审评一般原则疫苗的综合要求疫苗20112010 版 G

5、MP, 附录 4 血液制品血液制品的综合要求血液制品20172010 年版 GMP, 生化药品附录病毒去除 / 灭活生化药品2017细胞治疗产品研究与评价技术指导原则 ( 试行 )细胞治疗产品的综合要求细胞治疗产品考虑要点2020中国药典2020 年版三部凡例 - 基本要求生物制品的综合要求生物制品2020中国药典2020 年版三部生物制品通则 -生物制品的综合要求生物制品生产用原辅料2020中国药典2020 年版三部生物制品通则 -污染源控制 , 细胞基质的控制单克隆抗体 1 重组 DNA 蛋白制品2020中国药典2020 年版三部生物制品通则 -污染源控制，血浆病毒检测血液制品2020中国

6、药典2020 年版三部生物制品通则 -病毒安全控制的一般原则和具体要求生物制品2020中国药典2020 年版三部 ( 通则 3302)病毒检测生物制品2020中国药典2020 年版三部 ( 通则 3303)病毒检测生物制品2020中国药典2020 年版三部 通则 3306)血液制品生产用人血浆病毒核酸检测技术要求病毒检测血液制品2020中国药典2020 年版三部通则 3604 新生牛血清病毒检测血液制品2018细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的细胞治疗产品的综合要求细胞治疗产品生物制品生产用原材料及辅料质量控制生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制血液制品生产用人血浆生物制品病

7、毒安全性控制外源病毒因子检查法 鼠源性病毒检查法国内有关生物制品病毒安全性控制技术要求和指导原则主要包括：2002 年 CFDA 发布的 “ 血液制品去除 / 灭活病毒技术方法及验证指导原则 ”、2005 年 CFDA 药品审评中心 ( CDE) 颁布的 “ 生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则 ”，现行版中华人民共和国药典制定了生物制品病毒安全性控制一般原则和具体技术要求。生物制品病毒安全性控制国外相关法规列表发布时间发布机构文件名称阐述重点适用范围1999ICH病毒安全性评价、去除技术、验证ICH Q5A (R1): Viral Safety Evaluati

8、on of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origen人体或动物细胞来源生物技术产品的病毒安全评价病毒安全性评价生物制品病毒安全2009EUEMEA/CHMP/BWP398498/2005:Guideline on Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Medicinal Products病毒安全性评价单克隆抗体 /重组 DNA 蛋白制品生物技术新型药物产品的病毒安全性评价指南CHMP/BWP/268/95:No

9、te for Guidance on Virus Validation Studies -The1996EUDesign, Control and Interpretation of Studies Validating the Inactivationand Removal of Viruses单克隆抗体 /病毒灭活技术及验证重组 DNA 蛋白制品 /病毒验证研究指南注解 - 病毒灭活和去除验证研究的设计 , 控制及解读血液制品2019US1050 (USP42-35NF): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived

10、from Cell Lines of Human or Animal病毒安全性评价单克隆抗体 /重组 DNA 蛋白制品人体或动物细胞来源生物技术产品的病毒安全评价2019US1051(USP 40-35NF): Design, Evaluation, and Characterization of Viral Clearance Procedure病毒安全性评价单克隆抗体 /重组 DNA 蛋白制品病毒清除程序的设计，评价和表征2016EUEP5.1.7(9.5): Viral safety病毒安全性要求2005PDAVirus Filtration病毒过滤病毒过滤器单克隆抗体、重组 DNA 制

11、品、血液制品、基因治疗产品2016EUEMA/CHMP/BWP/532517/2008:Guideline on Development, Production, Characterization and Specification for Monoclonal Antibodies and Related Products单克隆抗体及其相关产品的开发、生产、特性鉴定和规范指南单克隆抗体制品的综合要求单克隆抗体制品2016EUEP 853(9.0): Human plasma for fractionation血液制品的血液制品人血浆成分分离综合要求2016EUEP 1646(9.0): Hu

12、man plasma pooled and treated for virus inactivation血液制品的血液制品人血浆合并及病毒灭活处理综合要求2012EMA/CHMP/BWP/706271/2010 Guideline血液制品的EUon plasma-derived medicinal products Revision 4综合要求血液制品2011EU血液制品指南第 4 版EudraLex - Volume 4 Good manufacturing practice(GMP) Guidelines, Annex 14: Manufacture of Medicinal Produc

13、ts Derived from Human Blood or PlasmaGMP 指南第 4 卷，附录 14: 人体血液或血浆来源医药产品生产DIRECTIVE 2002/98/EC: Setting standards of quality and safety for thecollection, testing, processing, storage and distribution of human blood血液制品的综合要求血液制品的血液制品2003EUN/AUSand blood components and amending. Directive 2001/83/EC人血及成

14、分血的收集、检测、处理、储存和分配中质量和安全的标准制定21 CFR Part 606: Current good manufacturing practice for blood and blood components血液及成分血的现行良好操作规范21 CFR Part 630: Requirements for Blood and综合要求血液制品血液制品的血液制品综合要求N/AUSBlood Components Intended for Transfusion or for Further Manufacturing use用于输血或生产使用的血液及成分血的要求21 CFR Part

15、640:Additional Standards for Human Blood and Blood血液制品的综合要求血液制品的血液制品N/AUSProducts人血及其制品的其他标准综合要求血液制品2016USUSP 1180 (40-NF35) Human Plasma人血浆FDA Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal血液制品的综合要求单克隆抗体血液制品单克隆抗体1997USAntibody Products For Human Use人用单克降抗休制品制备和检测中的考虑要点制品的综合要求制品1985

16、USFDA Points to Consider in the Production and Testing of New Drug andBiologicals Produced by Recombinant DNA Technology采用重组 DNA 技术的新药和生物制品的生产和检测的考虑要点污染源控制及病毒检测方法重组 DNA 制重组 DNA 蛋白制品品的综合要求1997ICHQ5D Derivation and Characterization of Cell污染源控制，单克隆抗体 /Substrates Used for Production of Biotechnological

17、/Biological Products细胞基质的控制重组 DNA 蛋白制品用于生物技术 / 生物制品的细胞基质的来源和表征FDA Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to污染源控制，单克隆抗体 /1993USProduce Biologicals细胞基质的控制重组 DNA 蛋白制品用于生物制品生产的细胞系鉴定的考虑要点FDA .Guidance for Industry: Revised recommendations for the prevention2015USof human immunodefi

18、ciency virus (HIV) transmission by blood and blood污染源控制血液制品products行业指南 : 关于预防血液和血制品传播人免疫缺陷病毒的修订建议FDA. Recommendations for the management of donors and units that are血液制品 /1987US2017US2007US关于对捐赠者和单位对乙型肝炎表面抗原初始反应的管理建议FDA. Guidance for industry: nucleic acid testing (NAT) for humanimmunodeficiency vi

19、rus type 1(HIV-1) and hepatitis Cvirus (HCV): testing product污染性控制 /血液制品 /disposition, and donor deferral and reentry行业指南 : 人免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 和丙型肝炎病毒 (HCV) 的核酸检尉 : 检测产品配置，供体屏蔽与归队病毒检测细胞治疗产品FDA Guidance for industry: adequate and appropriate donor screeningtests for hepatitis B; hepatitis B surface

20、antigen(HBsAg) assays used to test donors of whole blood and blood components,污染性控制 /血液制品 /including source plasma and source leuko- cytes行业指南 : 对乙肝病毒进行充分及合适的献血者筛查 ; 用于献血者全血及成分血，包括原料血浆和白细胞的乙肝表面抗原试验病毒检测细胞治疗产品FDA. Guidance for industry: use of nucleic acid tests on pooled andindividual samples from do

21、nors of whole blood and bloodinitially reactive for hepatitis B surface antigen (HBsAg)污染源控制细胞治疗产品2004USadequately and appropriately reduce the risk of transmission of HIV-1 and病毒检测细胞治疗产品HCV行业指南 : 应用核酸检测技术对献血者全血和成分血 ( 包括原料血浆和白细胞）进行充分且适当的检测以降低 HIV-1 和 HCV 的传播风险1999FDA. Guidance for Industry in the ma

22、nufacture and clinical evaluation ofin vitro tests to detect antibodies to the human污染性控制 /血液制品 / USimmunodeficiency virus type 1 and type 2病毒检测细胞治疗产品在生产和临床评价中应用体外试验检测抗体中人免疫缺陷病毒型和型的行业指南1993FDA. Revised recommendations for testingwhole blood, blood components source plasma, and source leukocytes forU

23、Santibody to hepatitis C virus encoded antigen污染性控制 /血液制品 /components (including source plasma and source leukocytes) to污染性控制 /血液制品 /N/AUSN/AUS2016EU2012EU(anti-HCV)对全血，成分血，原料血浆和白细胞进行丙型肝炎病毒编码抗原抗体检测的修订建议FDA Recommendations concerning testing for antibody to hepatitis Bcore antigen (Anti-HBc)关于乙型肝炎核心抗

24、原抗体检测的建议FDA Complete list of donor screening assays for infectious agents and HIV diagnostic assays.致病原及 HIV 诊断方法的献血者筛查方法完整清单EMA/CHMP/BWP/723009/2014: Viral safetyof plasma-derived medicinal products with respect to hepatitis E virus(Reflection paper)血浆来源制品中的戊型肝炎病毒安全（读后报告 )CHMP/BWP/360642/2010: Warn

25、ing on transmissible agents in summary of product characteristics and package leaflets for plasma-derived medicinal products Revision 1血浆来源制品产品特性和包装说明书中关于传染因子的警示，第一版CHMP/BWP/303353/2010: Creutzfeldt-Jakob disease and plasma-derived病毒检测污染性控制 /病毒检测特定病毒污染控制特定病毒污染控制特定病毒污染控制特定病毒污细胞治疗产品血液制品 /细胞治疗产品血液制品 /细

26、胞治疗产品血液制品血液制品2011EUand urine-derived medicinal products (revision 2)克雅氏病，血浆来源及尿源性药用制品（第二版 )染控制血液制品2016US2012USUSP 1240 (40-35NF): Virus testing of human plasma for further manufacturing用于后续生产的人血浆病毒检测FDA Guidance for industry: use of nucleic acid tests on pooled and individual samplesfrom donors of w

27、hole blood and blood components including sourceplasma, to reduce the risk of transmission of hepatitis B virus行业指南 : 对献血者全血和成分血（包括原料血浆和细胞）的混合及单体样品进行核酸检测以降低乙型肝炎病毒的传播风险污染源控制 /血液制品病毒检测污染性控制 /血液制品病毒检测N/AUS21 CFR Part 610: General Biological Products Standards (610.40-610.48)生物制品通用标准N/AUSUSP1047 Gene Th

28、erapy Products基因治疗产品FDA Chemistry Manufacturing, and Control (CMC)Information for Human污染源控制 /病毒检测污染源控制 /病毒检测生物制品 基因治疗产品2020USGene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)人用基因治疗新药临床研究申请 (INDs ) 的化学，生产和控制 ( CMC)信息污染源控制 /病毒检测基因治疗产品生物制品生产用原辅料Characterization and Qualification of Cell Substr

29、ates and Other BiologicalMaterials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease生物制品的 /生物制品2010USIndications综合要求生产用原辅料用于有传染性疾病的病毒疫苗生产用细胞基质和其他生物材料的鉴定和确认EP 5.12 Raw materials of biological origin for the production of cell based生物制品的生物制品2016EUand gene therapy medical products综合要求生产用原

30、辅料用于细胞和基因治疗产品生产的生物来源的原材料USP Ancillary materials for Cell, Gene and Tissue-engineered生物制品的生物制品2016USproducts综合要求生产用原辅料用于细胞，基因和组织工程产品的辅料总之，国外关于生物制品病毒安全性控制技术要求和指导原则主要包括 ICHQ5A( 生物技术产品的病毒安全性评价) 、日本药典 ( JP17: 所列生物技术 / 生物制品病毒安全的基本要求 ) 、美国药典 ( USP41 1050: 人源或动物源细胞系制备的生物技术产品的病毒安全性评价，等同采用 ICH Q5A) 、人用单克隆抗体制品

31、制造和测试考虑要点 ( FDA) 、欧洲药品管理局( EMEA，临床试验用生物技术药物病毒安全性评价指导原则、除病毒工艺验证指导原则) 、欧洲药典( EP 9.0: 5.1.7病毒安全性通则 ) 、世界卫生组织 ( WHO: 动物细胞作为生物制品生产的基质的建议及细胞库的鉴定、上市疫苗中发现外源因子的风险评估指导原则) 等。各国技术要求或指导原则均具有其科学性、规范性及严谨性，但各自的适用范围不完全一致，且均未涵盖所有相关生物制品。生物制品病毒安全性控制核心理念及进展病毒安全性控制核心理念近年来，生物药在我国已经形成“燎原之势”，各种生物仿制药、创新药的研发、生产不断地出现在市场上。由于生物技

32、术领域的发展及上市后生物制品安全性实践经验不断积累，生物制品病毒安全性控制新的技术和理念不断发展，加快推动了生物制品病毒安全性控制原则的研究和建立 , 主要包括：风险评估及全过程控制全生命周期管理及分阶段要求质量源于设计及其实施路线通用制备工艺病毒清除验证模块化工艺步骤病毒验证病毒样颗粒 ( VLP) 替代病毒等生物制品病毒安全性控制核心理念主要包括三个互补控制策略，即：病毒污染源的控制生产过程质量控制及检测病毒清除验证、评估三个互补阶段均应严格执行药品GMP, 任何单一部分都不能提供足够的病毒安全性保证。只有将三个部分结合起来才能达到病毒安全性控制要求。上述国内和国际生物制品病毒安全性控制技

33、术要求和指导原则核心理念主要是根据三条互补控制策略，在风险评估的基础上控制生物技术产品的潜在病毒污染，即：对于细胞系和其他原材料的病毒外源因子污染进行控制对制造过程适当步骤中间品进行测试和监控对病毒清除工艺进行评估和验证病毒安全性控制风险评估不同类型的生物制品在来源、潜在污染病毒的特性、制备工艺等方面的不同，导致其病毒安全性风险大小存在差异，对于潜在的病毒污染源和可能的污染途径进行风险分析及评估，找出风险点，以便根据评估结果实施病毒安全性控制策略 。本文以 ICH Q5A阐述如何进行病毒安全性控制风险评估及实施三个互补阶段控制。风险评估：细胞系和其他原材料的来源控制( 见图1 左上部分)、生产

34、过程中适当步骤产品的测试( 见图 1 下部分 ) 以及对病毒清除工艺的评估 ( 见图 1 右上部分 ); 病毒安全性控制首先应当以风险评估为基础 ( 以数字“0”标识), 评估内容见图 1 中箭头区域所示；病毒的潜在污染风险应尽可能小 , 同时病毒清除工艺的能力尽可能高。图 1 . 风险评估流程示意图ICH Q5A 对病毒安全性控制强调通过风险识别、风险评价以及相应的风险降低措施实施，贯彻风险评估的理念。来源控制策略：根据风险评估的结果，病毒污染的源头控制是一个关键点，事关病毒安全性控制的成败。 ICH Q5A 对于病毒污染的来源进行了逐层把控，在风险评估的基础上 , 起始物料的病毒筛查是一个

35、关键点，特别体现在细胞基质的控制上。图 2 呈现了基于风险评估来源控制示意图，其中 “1” 表示三个互补阶段第一个控制策略。图 2 . 风险评估基础上的来源控制示意图制造过程中间品检测：在病毒污染的源头控制上，来源控制已经设置了一道防线。为了进一步确保病毒安全性，在制造过程中适当阶段进行产品测试，这是病毒安全性的第二道防线。病毒污染检测结果的准确性和可靠性与污染来源、污染病毒的特性、生产工艺步骤等密切相关，应综合各因素对制造过程中最适阶段的产品( 未加工粗品、中间品或成品等) 进行检测， ICHQ5A 主要关注未加工粗品的检测。制造过程适当步骤产品检测示意图如图 3，其中数字 “2 表示三个互

36、补阶段第二个控制策略。图 3 . 制造过程适当步骤产品检测示意图病毒清除工艺评估：在病毒污染的来源控制及制造过程中间品检测两道防线基础上，通过病毒清除工艺评估构建第三道确保病毒安全性的防线。病毒清除工艺评估和验证目的是确认工艺清除病毒的可靠性，即对于已存在 / 可能存在的病毒 ( 相关病毒、特异模型病毒 ) 可被清除 ( 达到一定的要求) ; 为未知病毒安全性提供一定程度的保证。病毒清除工艺评估示意图见图 4，其中数字 “3 表示三个互补阶段第三个控制策略。图 4 . 病毒清除工艺评估示意图生物制品中病毒清除的工艺解决方案有效的病毒清除研究仍然是生物制剂制造商面临的挑战之一。这些研究是工艺验证

37、的重要组成部分，对确保药物安全至关重要。从利用层析步骤去除病毒的基本考虑要点出发，结合实际的案例阐述此类工艺解决方案。病毒去除研究的基本考虑病毒去除研究的计划和设计一般以法规文件规定作为起始，需要考虑的基本因素主要表现在两方面：表达系统为人源细胞系；生产和纯化过程中使用了动物来源的原材料。基于以上两方面病毒去除研究的设计考虑要点为：对细胞系的分析对构建的主细胞库进行逆转录病毒、逆转录病毒颗粒和其他病毒检测，没有发现任何感染性病毒或病毒颗粒的表达。模式病毒的选择根据细胞系的分级，原材料的来源以及需要评估的工艺步骤，确定以下六个模式病毒：-MuLv，鼠白血病病毒，曾用于临床试验研究，可代表细胞系中

38、的潜在逆转录病毒污染；-BVDV，牛病毒性腹泻病毒，曾用于临床试验研究，代表牛血清原材料的常见污染物；-2 型腺病毒，对人类细胞敏感；-PRV，伪狂犬病毒可以在该细胞系中生长为无脂包膜病毒，扩大了病毒范围；- 脊髓灰质炎病毒，RNA 病毒，对许多环境条件具有抵抗力，有文献报道可用于病毒去除研究；-MMV，鼠细小病毒，最小的病毒，对该细胞系敏感。在生物制品的生产过程中有多个步骤都可以达到除病毒的目的，但通常都需要通过一个适当的病毒清除研究，来评估你在工艺过程中设计的除病毒步骤是可以有效的降低病毒载量的。最典型的两种方法如图 5 所示是：用于病毒灭活或去除的步骤，如低 pH 处理和热处理。用于病毒

39、清除的步骤，如用于纯化的层析步骤也可以降低病毒的载量。Steps contributing to viral clearanceUnpurifiedbulkPurifiedVirusfiltrationCan remove both envelopedand non-enveloped virusesLow pHincubationInactivation of enveloped virusesPolishing chromatography 1 and 2AIEX,CIEX,HIC,MMC furtherremove impuritiesCapture chromatographyThe

40、target protein is capturedand the virus flows throughbulkSteps dedicated to virus inactivation/removal图 5 . 单克隆抗体 (mAb) 下游生产过程中降低病毒载量的典型步骤层析步骤在病毒清除研究中的应用概述在设计新的工艺路线，或者在现有工艺中变更参数以及在临床试验的不同阶段制备样品时，确保终产品病毒清除满足要求都是至关重要的，当细胞系或者生长因子等原辅物料发生变化时，也应保证病毒的清除率。利用层析的方法去除病毒，需要在样品中加入指示病毒，在 scale-down 模型进行研究，收集数据以评估

41、层析介质的病毒清除能力（见图 6）。图 6 . 层析步骤病毒清除研究的简化工作流程病毒清除研究中的scale-down 模型的建立，应注意使用相同的柱床高度和相同的流速，以此来模拟大规模的生产（见图 7）。图 7 . 病毒清除研究中 scale-down 模型建立的说明开展病毒清除研究时，必须要明确在减少病毒污染的工艺步骤中所使用的单元操作是什么，因为它取决于生产工艺和产品类型，在确定去除病毒的操作单元时应该是 case by case 的设计。而设计良好的层析工艺在减低病毒荷载方面表现出色。例如使用 AIEX 和复合 AIEX 层析的洗脱步骤，可以使病毒载量下降 4-5logs。而其中复合模

42、式的 AIEX 层析介质在病毒清除研究的过程中表现得高效并且耐用，可以提供较宽的 pH 和电导率的操作范围。HIC色谱也具备这个范围的病毒清除能力。CIEX 和亲和捕获层析在降低病毒载量方面也可以做到 2-3logs 的降低，表 1 总结了不同色谱技术清除病毒的能力。表 1. 纯化工艺中层析步骤病毒清除的效果层析类型亲和层析病毒清除效果 (log10)2 to 3阴离子层析4 to 5阳离子层析2 to 3疏水层析4 to 5复合阴离子层析4 to 5案例分享：亲和层析的病毒清除研究生物制药企业保证药品的安全性是至关重要的，因此，评估工艺步骤对病毒清除的作用是工艺验证的一个重要部分，因此就需要

43、一个适宜的模型进行有效的病毒清除研究。在此案例中，以按比例缩小的 scale-down 模型来评估亲和捕获层析步骤对病毒清除的作用。利用proteinA 亲和层析捕获目的蛋白，是几乎所有单抗产品生产工艺下游纯化的第一步，此层析步骤虽然不是专门针对病毒清除设计的，但是在目标抗体被捕获的同时，病毒以流传模式通过层析柱，也可以起到很好的病毒清除的效果。当选择作为捕获步骤的层析介质时，一个重要的衡量指标就是其病毒清除能力。对于 proteinA 层析介质来说，比较典型的病毒载量降低在 2.5logs 左右范围内，下面以 MabSelect PrismA 层析介质为例来说明亲和层析的病毒清除效力，研究采

44、用 HiScale 10/40 系列层析柱。材料及研究方法：MabSelect PrismA 层析介质在 HiScale 10/40 色谱柱中装载，装柱参数如下：层析介质混悬液浓度：50%；装柱溶液：20% 乙醇 0.4 M 氯化钠；沉降速率：200cm/h；层析介质以填充系数 1.10 压缩至最终柱高 20 厘米。用于病毒清除研究的病毒选择两种不同模式的病毒用于此研究，是 CHO 细胞系早期病毒研究的典型病毒，模型病毒为为异嗜性小鼠白血病病毒 (Xenotropic mouse leukemia virus, xMuLV) 和小鼠微小病毒 (Minute virus of mice, MVM

45、) ( 见表 2)。采用 q-PCR 分析 xMuLV 的效价。MVM效价用生物测定法进行分析。表 2. 用于病毒清除研究的模型病毒信息病毒种属基因组大小 (nm)是否包膜病毒物理化学处理敏感性xMuLVRetross-RNA80110YesLowMVMParvoss-DNA1824NoVery high设计试验以挑战病毒清除能力的稳健性为了确认亲和层析介质清除病毒能力的稳健性，采用不同的上样量、保留时间设置不同参数组合。层析介质的柱床高度为 20cm，柱体积为 16ml。表 3. 试验参数设置组别上样浓度 (mg/mL)层析保留时间 (min)上样保留时间 (min)标准参数 165612标

46、准参数 265612低上样量20612短保留时间6544层析操作步骤如下：5CV 的 PBS 平衡层析柱，分别用 3CV 的 PBS、高盐缓冲液及醋酸盐进行洗涤。结果与讨论：病毒清除研究的结果汇总如图 8 所示。与标准运行参数组相比，在低上样量和短停留时间的参数下，xMuLV 的清除率略高而 MVM 则正好相反。两种病毒的结果差异表明，在既定的工艺参数下，病毒粒子与目的蛋白和层析介质的相互作用是不同的，因此需要一个更大范围及规模的研究来说明这一点。xMuLV reduction factor(log10)MVM reduction factor(log10)3.643.473.092.852.

47、98 2.872.472.6Standard 1Standard 2Low sampleloadShort residence time图 8 . 病毒清除结果汇总通过此试验，结果显示亲和层析的病毒清楚效率保持在较为典型的降低病毒荷载的范围内，HiScale 10/40 与 MabSelect PrismA 组合达到了预期的病毒去除效果，是病毒清除研究中捕获步骤的可靠选择，并且即使上样量及保留时间都是不同的，依然证明了层析介质的稳健性。除病毒过滤方法除病毒过滤主要特点一项应用多年、被证明的具有高效除病毒能力技术。例如：高载量下的病毒去除能力。根据尺寸排阻，死端过滤，截留大于孔径的病毒颗粒，一般

48、对于小于 170 KD 的蛋白产品，回收率大于 98%。是与层析、化学灭活等正交的技术。 相对病毒灭活技术，具有高收率、且不会降解蛋白质。稳健、可工艺缩小、可使用在线完整性测试监控。所有类型病毒皆有效，可广泛应用于多种料液产品。易于使用。例如：常规过滤、易清洁和高压蒸汽灭菌、机械和化学稳定性好、可使用一次性筒式 / 囊式滤器、易于工艺放大等。除病毒过滤的挑战对杂质敏感大规模生产的经济可行性仅对 200kD 的分子有效蛋白质复原。工艺规定了较高的蛋白质复原率，至少在 95% 以上除细小病毒过滤器选择要求有效截留有效回收蛋白常规过滤过滤时间短高过滤载量可验证、可放大且可进行完整性测试影响除细小病毒

49、过滤去除效果的关键参数体积载量。常有各种因素可能会导致过滤通量降低、滤器载量降低。可从滤器选择、样品 pH 与电导优化、样品浓度选择和添加剂选择等方面优化滤器载量。流量衰减。过滤器的流动特性由膜表的面积和膜的渗透率决定。膜的渗透率首先由总孔隙度（空隙容积）、膜的厚度和有效孔径决定。过滤器通过量的使用期限作为它能够滞留的时间总长，在出现无法接受的高压差或流动损失之前。预滤器能够略微提高过滤速度和过滤时间。工艺中断。工艺中断可能会降低细小病毒截留率。去除 / 灭活病毒能力的验证需要特殊考虑的问题只对可能有去除 / 灭活病毒作用的生产步骤进行验证。模拟的生产工艺各种参数应尽可能与实际的生产工艺相一致

50、，如 pH、温度、蛋白质和其他组成成分的浓度、反应时间、层析柱的柱床高度及流速与床高的比例、洗脱图谱及该步骤的生产效果（如产量、比活性、组成成分）。应分析生产工艺中各种参数的偏差对病毒去除 / 灭活效果的影响。生产各步骤对不同类型病毒去除 / 灭活的选择性。核酸扩增技术（如 PCR）检测病毒核酸的灵敏度比较高，但是该检测技术最大的局限性是不能区别被灭活了还是未被灭活的病毒。因此该技术不能用于灭活病毒量的验证，只能用于生产过程中病毒去除量的验证。通常在生产过程中去除/ 灭活病毒量是可以计算在清除病毒总量中，但不能认定是有效病毒去除步骤。因为生产过程通常有一些变化，很难控制及验证，而且，病毒分配完全取决于病毒特异的理化性质，这些理化性质影响了病毒与凝胶介质相互作用和沉淀的性质。因此由于病毒表面特性的微小差异（如：糖基化），指示病毒与靶病毒分配形式可能完全不同。在实验室增殖的相关病毒可能在分配上与野生株不同。然而，如果病毒清